江 遠(yuǎn)，張 玲，鐘肖英，吳文如，何金洋

鐵沉積與肝纖維化（Liver fibrosis，LF）關(guān)系密切。含鐵血黃素（Hemosiderosis）可沉積在各種類型的肝硬化[1，2]、慢性病毒性肝炎[3]患者肝組織中，而鐵過載又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)肝硬化和肝癌的發(fā)生[4～6]。臨床資料顯示，去鐵治療能顯著改善血清LF指標(biāo)[7]。我們前期實(shí)驗(yàn)表明，炎癥反應(yīng)是鐵沉積于巨噬細(xì)胞并促進(jìn)LF發(fā)生的機(jī)制之一[8]，且不同鐵負(fù)載水平能夠誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cell，HSC）活化或發(fā)生細(xì)胞凋亡，提示鐵螯合劑治療LF的潛在作用[9]。本研究在本課題組成功建立實(shí)驗(yàn)性LF大鼠模型的基礎(chǔ)上[10]，以去鐵銨腹腔注射SD大鼠作為對照，探討鐵沉積影響LF的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 SD大鼠39只，體質(zhì)量110～140 g，雌雄各半，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號：0029666）。鼠抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（Anti-αsmooth muscle actin，α-SMA，批號：BM0002）、山羊抗小鼠 IgG（SA1020）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（AR1022）由武漢博士德生物工程公司提供。新鮮配制普魯士藍(lán)染色所需染液：2%亞鐵氰化鉀50 ml+濃鹽酸1 ml。鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液1000μg/mL由國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供。ASCENT型酶標(biāo)儀為芬蘭雷勃公司產(chǎn)品。AU400型奧林巴斯全自動(dòng)生化分析儀由日本奧林巴斯公司提供。JENA AA400型原子吸收分光光度計(jì)由德國JENA儀器公司提供。TGF-β1引物由加拿大Fermentas公司合成。Master mix熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒購自日本TOYOBO公司。TRIzol RNA提取試劑購于美國MRC公司。

1.2 肝纖維化大鼠模型制備 取SD大鼠39只，隨機(jī)分為模型組和空白對照組。模型組（n=27）以二甲基亞硝胺（DMN，天津化學(xué)試劑研究所）10μL.kg-1腹腔注射，每周連續(xù)3日，共4 w；空白對照組（n=12）予以等體積生理鹽水腹腔注射。在造模成功后，再將模型大鼠隨機(jī)分為模型組（n=15）和去鐵銨組（n=12）。分別給予兩組模型大鼠生理鹽水或去鐵銨（諾華制藥廠）100 mg·kg-1腹腔注射，3次/w，共2 w。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，按要求收集血清，摘取左前葉肝臟，分別待檢。

1.3 血生化指標(biāo)和血清鐵檢測 使用AU400型奧林巴斯全自動(dòng)生化分析儀檢測。

1.4 血清鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白檢測 采用ELISA法檢測（美國ADL公司）。

1.5 大鼠肝組織鐵濃度（Hepatic iron concentration，HIC）檢測 按照有關(guān)文獻(xiàn)[11]報(bào)道的方法，采用火焰原子吸收光譜法測定。

1.6 肝組織病理學(xué)檢查 取肝組織，在Bouin's固定液中固定24 h～36 h，石蠟包埋，切片，分別行HE染色、Masson染色和普魯士藍(lán)染色。按照參考文獻(xiàn)[12，13]報(bào)道的方法進(jìn)行肝組織膠原半定量分析。

1.7 肝組織α-SMA表達(dá)檢測 按照試劑盒說明書提供的方法操作。

1.8 肝組織TGF-β1 mRNA水平檢測 按TRIzol提取試劑盒操作說明進(jìn)行總RNA提取，立即行逆轉(zhuǎn)錄。將目的基因與內(nèi)參照三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的比值作為該目的基因的相對水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多樣本有序分類資料的兩兩比較采用Ridit分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 對照組肝組織肝小葉排列整齊，無病理學(xué)改變；模型組肝組織可見大量纖維沉積，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，部分肝組織出現(xiàn)脂肪堆積，匯管區(qū)大片炎細(xì)胞浸潤，肝組織大片出血灶，伴隨著纖維組織增生，甚至有假小葉形成。肝組織內(nèi)有棕褐色顆粒樣物質(zhì)（鐵）沉積，且主要沉積在庫弗細(xì)胞（KC）中；去鐵銨組肝細(xì)胞變性壞死有所減輕，纖維結(jié)締組織和假小葉形成均有所減少（圖1～3）。

圖1 肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 對照組肝組織肝小葉排列整齊，無病理學(xué)改變（HE，400×）

圖2 肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 模型組大鼠肝組織可見纖維組織增生，假小葉形成。肝組織內(nèi)有棕褐色顆粒樣物質(zhì)（鐵）沉積，且主要沉積在 KC 中（HE，400×）

圖3 肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 去鐵銨腹腔注射后，肝組織肝細(xì)胞變性壞死有所減輕，纖維結(jié)締組織和假小葉形成均有所減少（HE，400×）

2.2 肝組織膠原情況 對照組肝組織僅有少量膠原纖維沉積在匯管區(qū)和中央靜脈壁；模型組膠原纖維染色顯著增強(qiáng)，可見纖維間隔，甚至有假小葉形成；去鐵銨組膠原纖維增生明顯減輕，纖維間隔變窄，較少有假小葉形成（圖4～6）。半定量分析膠原結(jié)果表明，模型組膠原沉積較對照組和去鐵銨組明顯增加（P＜0.05，表1）。

2.3 鐵負(fù)載水平比較 經(jīng)普魯士藍(lán)染色，結(jié)果顯示各組肝組織鐵負(fù)載水平不同，即呈模型組＞去鐵銨組＞對照組趨勢。深藍(lán)色鐵顆粒主要沿纖維間隔分布，鐵主要沉積在KC，或?yàn)楸籏C吞噬（圖7～9）。

圖4 肝組織膠原情況 對照組肝組織僅有少量膠原纖維沉積在匯管區(qū)和中央靜脈壁（Masson，400×）

圖5 肝組織膠原情況 模型組肝組織膠原纖維染色顯著增強(qiáng)，可見纖維間隔（Masson，400×）

圖6 肝組織膠原情況 去鐵銨腹腔注射后，肝組織膠原纖維增生明顯減輕，纖維間隔變窄，少有假小葉形成（Masson，400×）

表1 各組大鼠肝組織膠原半定量結(jié)果比較

圖7 肝組織鐵染色結(jié)果 對照組肝組織無鐵沉積（普魯士藍(lán)，400×）

圖8 肝組織鐵染色結(jié)果 模型組肝組織有大量棕褐色物質(zhì)（鐵）沉積，主要沿纖維間隔分布，鐵主要沉積在KC（普魯士藍(lán)，400×）

圖9 肝組織鐵染色結(jié)果 去鐵銨腹腔注射后，肝組織鐵負(fù)載明顯減少（普魯士藍(lán)，400×）

2.4 肝組織α-SMA表達(dá)情況 在模型組肝組織壞死區(qū)周圍，沿著鐵顆粒分布區(qū)域，有大量α-SMA表達(dá)陽性的HSC（即活化的HSC）和吞噬鐵的KC同時(shí)出現(xiàn)在新形成的纖維間隔中，并且在活化的HSC中也出現(xiàn)鐵顆粒沉積，提示在DMN誘導(dǎo)的LF大鼠，肝組織伴隨著大量HSC活化，鐵主要沉積于KC和HSC（圖10～11）。

圖10 肝組織α-SMA表達(dá)情況 對照組肝組織未見α-SMA表達(dá)（免疫組化，400×）

圖11 肝組織α-SMA表達(dá)情況 模型組大鼠肝組織見大量α-SMA表達(dá)陽性的HSC（即活化的HSC）和吞噬鐵的KC同時(shí)出現(xiàn)在新形成的纖維間隔中，在活化的HSC中也出現(xiàn)鐵顆粒沉積（免疫組化，400×）

2.5 大鼠肝組織鐵濃度的變化 根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖12），結(jié)果表明，鐵質(zhì)量濃度在0.0～5.0 μg/mL范圍內(nèi)，線性良好。用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，測得平均值為1.006μg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.494%。加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，回收率在98.86%～99.993%之間，平均回收率為99.61%。最后進(jìn)行肝組織HIC測定（表2）。結(jié)果表明，模型組HIC為對照組的 1.78倍（LSD-t=5.15，P＜0.01），而去鐵銨組HIC較模型組則減少了23.5%（LSD-t=-2.76，P＜0.05），提示正常大鼠肝組織含有一定量的鐵，但隨著LF的形成，鐵沉積更加明顯，而去鐵銨處理則能減輕鐵的沉積。

圖12 鐵原子吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程

表2 各組大鼠肝組織鐵濃度（mg/g干重，）的變化

表2 各組大鼠肝組織鐵濃度（mg/g干重，）的變化

與對照組比，①P＜0.01或P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只數(shù) 肝鐵質(zhì)量濃度對照組 5 0.4±0.0模型組 5 0.8±0.1①去鐵銨 5 0.6±0.1①②

2.6 大鼠血清鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和血清鐵水平變化 模型組血清鐵蛋白水平是對照組的1.97倍（LSD-t=2.21，P＜0.05）；去鐵銨能使模型組血清鐵蛋白水平降低 78.5%（LSD-t=-3.52，P＜0.01）。模型組血清轉(zhuǎn)鐵蛋白僅為對照組的 49.3%（LSD-t=-4.78，P＜0.01）；而經(jīng)去鐵銨治療，血清轉(zhuǎn)鐵蛋白則增加81.4%（LSD-t=3.77，P=0.01）。模型組血清鐵水平顯著減少（LSD-t=-2.50，P＜0.05），但去鐵銨能進(jìn)一步降低其血清鐵水平（LSD-t=-2.43，P＜0.05，表 3）。

表3 各組大鼠血清鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和血清鐵水平（）比較

表3 各組大鼠血清鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和血清鐵水平（）比較

與對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.01

血清鐵（μmol/L）對照組 11 24.2±27.6 0.7±0.2 66.1±8.9模型組 11 47.7±27.9① 0.3±0.1① 49.7±20.6①去鐵銨 10 10.3±12.5② 0.6±0.2② 33.4±15.9①②只數(shù) 鐵蛋白（ng/mL）轉(zhuǎn)鐵蛋白（mg/mL）

2.7 鐵沉積對DMN誘導(dǎo)的LF大鼠肝組織TGF-β1 mRNA水平的影響 模型組肝組織TGF-β1 mRNA水平為對照組的 5.2倍[（11.896±0.639）對（2.292±0.222），LSD-t=25.95，P＜0.01]，而經(jīng)去鐵銨治療，其TGF-β1 mRNA水平下調(diào)了 37.1%[（7.481±0.745），LSD-t=-11.95，P＜0.01]。結(jié)果表明，LF大鼠肝組織TGF-β1 mRNA水平明顯上調(diào)，而去鐵銨能降低其水平，提示肝內(nèi)鐵沉積通過調(diào)控TGF-β1基因水平可能促進(jìn)了LF的發(fā)生和發(fā)展。

3 討論

Arezzini et al[4]研究顯示添加羰基鐵能促進(jìn)亞劑量CCL4誘導(dǎo)的大鼠肝硬化發(fā)生。Mackinnon et al[14]報(bào)道亞毒性劑量CCL4蒸汽吸入的大鼠在添加鐵和酒精后能促進(jìn)LF的發(fā)展。給予酒精性肝病模型動(dòng)物添加羰基鐵導(dǎo)致了大鼠LF的組織病理學(xué)變化[15]。本課題組曾以DMN腹腔注射建立大鼠LF模型，發(fā)現(xiàn)鐵負(fù)載和脂肪堆積是其顯著的組織病理學(xué)特點(diǎn)[10]。

在本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠肝損傷嚴(yán)重，肝組織有膠原纖維沉積、肝細(xì)胞變性壞死和大片出血灶，肝組織鐵負(fù)載明顯增加，鐵主要沿纖維間隔分布。而用去鐵銨治療后，肝組織鐵負(fù)載明顯減少，膠原纖維沉積和肝細(xì)胞變性壞死明顯減輕，提示鐵沉積是促進(jìn)大鼠LF形成的因素之一。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鐵沉積于KC和 HSC并促進(jìn)其活化是鐵沉積影響大鼠LF發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制。首先，在DMN誘導(dǎo)的大鼠LF中，我們觀察到鐵負(fù)載的存在。用去鐵銨治療后，肝組織鐵沉積和血清鐵離子水平均明顯下降；其次，通過普魯士藍(lán)染色及普魯士藍(lán)和α-SMA雙染色發(fā)現(xiàn)，在LF大鼠肝組織中伴隨著HSC大量活化，鐵主要沉積于KC和HSC；再次，作為最重要的促纖維化細(xì)胞因子之一，肝組織TGF-β1 mRNA水平在LF大鼠明顯上調(diào)，TGF-β1可通過自分泌和旁分泌途徑使靜止的HSC活化，從而促進(jìn)LF的發(fā)生和發(fā)展。在DMN大鼠LF模型發(fā)現(xiàn)鐵負(fù)載的KC和HSC TGFβ1蛋白表達(dá)均呈強(qiáng)陽性，提示鐵沉積可能使KC表達(dá)TGFβ1蛋白增加從而影響HSC活化，促進(jìn)了LF的進(jìn)展[16]。

鐵元素是細(xì)胞生長的基本物質(zhì)，肝臟是鐵儲(chǔ)存的主要部位。肝臟出血是本次實(shí)驗(yàn)性LF大鼠的顯著特征。伴隨著出血性壞死及纖維化進(jìn)展，紅細(xì)胞中的鐵主要被KC吞噬。運(yùn)鐵素（Ferroportin）能將儲(chǔ)存在KC中的鐵轉(zhuǎn)出細(xì)胞外[17]，再被HSC攝取。由于HSC存在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體[18]，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TfR1）作為一種2型跨膜蛋白，能夠高親和性地連接含三價(jià)鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，在HSC內(nèi)與鐵蛋白結(jié)合，變成可儲(chǔ)存的鐵[19，20]。我們認(rèn)為，在肝纖維化發(fā)生時(shí)，大量的鐵沉積于肝組織并形成HSC活化的外環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)了LF的進(jìn)展，甚至導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生。因此，有效地控制肝鐵過載，對肝病的預(yù)防和治療有著重要的臨床意義。

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