馬冬，佟文秀，張艷梅，姜杰，李琪，李鷗

·新進(jìn)展·

妊娠早期基于游離胎兒細(xì)胞DNA檢測(cè)非整倍性染色體的研究進(jìn)展

馬冬，佟文秀，張艷梅，姜杰，李琪，李鷗

非整倍性染色體是圍生期發(fā)病率和死亡率的主要原因。在妊娠早期，以較低的檢測(cè)成本實(shí)現(xiàn)最大限度的檢測(cè)率和最低的假陽性率，且減少不必要的侵入是產(chǎn)前篩查方法的主要目的。除血清學(xué)、超聲學(xué)及綜合篩查方法外，利用母體血漿中游離胎兒細(xì)胞DNA(cffDNA)建立的無創(chuàng)基因檢測(cè)方法具有更加快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，愈來愈受到重視。本文就非整倍性染色體異常的基因檢測(cè)方法研究進(jìn)展做一綜述，以期為有效地控制染色體異?；純旱某錾吞岣呷丝谒刭|(zhì)提供有力技術(shù)支撐。

產(chǎn)前診斷;染色體畸變;無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測(cè);游離胎兒細(xì)胞DNA

馬冬，佟文秀，張艷梅，等.妊娠早期基于游離胎兒細(xì)胞DNA檢測(cè)非整倍性染色體的研究進(jìn)展［J］．中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(30):3732－3735.［www.chinagp.net］

Ma D，TongWX，Zhang YM，et al.Research progress of aneuploidy detection based on cell－free fetal DNA in the first trimster of pregnancy［J］．Chinese General Practice，2015，18(30):3732－3735.

染色體異常綜合征患者具有嚴(yán)重的智力和生理缺陷，發(fā)病率高且無法治療。染色體病通常包括染色體數(shù)目異常和染色體結(jié)構(gòu)異常，前者占存活新生兒的1/150～1/120［1］，且以非整倍性染色體最為常見。最常見的非整倍性染色體活產(chǎn)兒包括21三體綜合征、13與18三體綜合征、特納綜合征及Klinefelter綜合征。目前，除通過染色體病產(chǎn)前篩查和診斷終止染色體異常新生兒出生外，仍無其他有效預(yù)防和治療方法［2］。因此，為提高出生人口素質(zhì)，妊娠婦女均應(yīng)接受胎兒非整倍性染色體產(chǎn)前篩查。

1997年，Lo等［3］研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠婦女血漿中存在游離胎兒細(xì)胞DNA(cell－free fetal DNA，cffDNA)，其水平較胎兒有核紅細(xì)胞豐富，且隨著妊娠進(jìn)程而增加，在妊娠婦女血液中出現(xiàn)時(shí)間早且產(chǎn)后迅速清除。由于cffDNA提供了全面分析胎兒發(fā)育、生理功能以及病理分子機(jī)制的可能，并具有快速降解的特性，使其成為產(chǎn)前無創(chuàng)檢測(cè)的最優(yōu)指標(biāo)［4］。2010年，Lo等［5］的研究進(jìn)一步證明了，妊娠婦女外周血漿存在胎兒的全基因組cffDNA序列片段，使其從理論上可以利用妊娠婦女外周血漿進(jìn)行針對(duì)胎兒的幾乎全部染色體檢測(cè)。cffDNA檢測(cè)能更早發(fā)現(xiàn)胎兒異常，與傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷相比具有較高的靈敏度和特異度，妊娠婦女易于接受，可有效減少對(duì)妊娠婦女身體的創(chuàng)傷和心理負(fù)擔(dān)，所以近年來cffDNA受到廣泛關(guān)注［6］。本文將目前應(yīng)用cffDNA檢測(cè)非整倍性染色體的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并探討其存在的問題及發(fā)展趨勢(shì)。

1 妊娠早期胎兒非整倍性染色體產(chǎn)前篩查

1.1 血清生化標(biāo)志物篩查血清生化標(biāo)志物篩查的原理是由于胎兒染色體的異常會(huì)影響胎盤功能，從而導(dǎo)致妊娠婦女血清生化指標(biāo)異常，最終這些妊娠婦女將被篩查為高危妊娠婦女。1999年，Christiansen等［7］通過對(duì)妊娠婦女血清中多種妊娠相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)在9～13孕周與妊娠相關(guān)的血漿蛋白A (PAPP－A)水平下降、人絨毛膜促性腺激素β亞單位(β－HCG)水平增高的妊娠婦女存在發(fā)生21三體綜合征的風(fēng)險(xiǎn)，而僅以妊娠婦女血漿中PAPP－A水平診斷21三體綜合征的靈敏度為42%，假陽性率為5%。其他妊娠早期血清生化標(biāo)志物篩查指標(biāo)包括:甲胎蛋白(AFP)、游離雌三醇(uE3)［8］、抑制素A(inhibin－A)［9］、胎盤生長因子(PIGF)［10］、妊娠特異性β1糖蛋白(SP1)［11］、侵襲性滋養(yǎng)層抗原(ITA)［12］和去整合素樣金屬蛋白酶(ADAM－12)［13］等。由于采用單獨(dú)的血清學(xué)指標(biāo)診斷胎兒非整倍性染色體的檢出率不高，且具有一定的假陽性和假陰性，因此早期妊娠篩查較多的是聯(lián)合指標(biāo)。

1.2 產(chǎn)前超聲標(biāo)記篩查目前建議在妊娠11～14周應(yīng)用產(chǎn)前超聲標(biāo)記篩查來檢查胎兒頸背皮膚透明帶厚度(nuchalskinfold thickness，NT)，在妊娠18～24周采用腹部超聲仔細(xì)檢查胎兒結(jié)構(gòu)。產(chǎn)前超聲標(biāo)記篩查在多方面較血清生化標(biāo)志物篩查優(yōu)勢(shì)明顯［14］。NT已成為在妊娠早期檢測(cè)染色體數(shù)目異常的最敏感的產(chǎn)前超聲標(biāo)記篩查指標(biāo)，Grande等［15］最新研究表明，NT可作為妊娠早期(9～10周)檢測(cè)胎兒三倍體綜合征的標(biāo)記頂臀長度(CRL)(28～44 mm)。其他妊娠早期超聲標(biāo)記篩查指標(biāo)包括:鼻骨缺失、胎盤體積及早發(fā)的胎兒生長受限(FGR)、心動(dòng)過緩等。盡管關(guān)于胎兒非整倍性染色體的產(chǎn)前超聲標(biāo)記篩查研究越來越多，但在日常篩查中應(yīng)用超聲仍面臨著可靠性和質(zhì)量控制的問題，且需要與妊娠中期相關(guān)指標(biāo)聯(lián)合篩查。Caughey等［16］研究證實(shí)，單獨(dú)利用產(chǎn)前超聲標(biāo)記篩查來決定高危妊娠婦女是否行羊水穿刺，56%的21三體綜合征胎兒將被漏診。

1.3 綜合篩查目前公認(rèn)最常用、最有效的妊娠早期篩查方案是PAPP－A、游離β－HCG和NT聯(lián)合篩查，可診斷約90%的21三體綜合征胎兒，且假陽性率約為5%［17］，對(duì)18三體綜合征、13三體綜合征和Tuner綜合征檢測(cè)的靈敏度分別為89%、90%和90%［18］。盡管妊娠早期篩查指標(biāo)不斷被報(bào)道，但是目前仍以妊娠中期篩查指標(biāo)為主要，通過對(duì)β－HCG、AFP和uE3水平進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)進(jìn)行分析。血清生化標(biāo)志物和產(chǎn)前超聲標(biāo)記聯(lián)合篩查等無創(chuàng)傷的篩查方式一方面靈敏度有限，另一方面又無法代替有創(chuàng)性產(chǎn)前篩查來進(jìn)行胎兒遺傳學(xué)疾病的診斷。

2 基于cffDNA檢測(cè)非整倍性染色體

cffDNA檢測(cè)用于無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查在很大程度上會(huì)受到母源性血漿背景的影響，常規(guī)方法只能檢測(cè)出父源性遺傳的基因突變，對(duì)母源性遺傳的檢測(cè)有一定限制［19］。因此，利用妊娠婦女血漿中胎兒游離核酸檢測(cè)胎兒非整倍性染色體主要通過以下3個(gè)方面進(jìn)行:(1)改進(jìn)提取cffDNA的方法;(2)篩查簡便的胎兒特異性標(biāo)志物;(3)建立直接檢測(cè)胎兒非整倍性染色體的數(shù)字PCR(digital PCR)和大規(guī)模平行基因組測(cè)序(massively parallel genomic sequencing，MPGS)技術(shù)［20］。

2.1 cffDNA的特點(diǎn)cffDNA主要來源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，且占血漿全部DNA的比例隨著孕周的增大而緩慢上升。母體血漿中的cffDNA具有如下基本特性:(1)妊娠早期占母體血漿全部DNA的3%～6%［21］。(2)cffDNA水平隨妊娠進(jìn)展而逐漸增加，最早可于妊娠5周在妊娠婦女血漿中測(cè)出，為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了新的可能，在很大程度上降低了妊娠婦女的身心負(fù)擔(dān)。(3)妊娠婦女血漿中的cffDNA分子較母體游離DNA分子長度短很多。99%的cffDNA分子短于313 bp，其中80%的長度在193 bp以下，因此可通過DNA分子長度對(duì)cffDNA進(jìn)行富集［22］。

2.2 cffDNA的提取妊娠婦女血漿中提取cffDNA的質(zhì)量好壞是其檢測(cè)的關(guān)鍵步驟。除利用改良的飽和酚提取cffDNA外，目前研究多采用QIAGEN等公司商品化試劑盒進(jìn)行血漿DNA的提取(例如: QIAmp DNA Blood Mini Kit)。Huang等［23］利用DNA提取自動(dòng)化系統(tǒng)不僅提高了cffDNA的產(chǎn)量和純度，而且還能夠提高PCR擴(kuò)增效率。Jorgez等［24］通過DNA分子長度分級(jí)分離法和全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification，WGA)提高了cffDNA的富集效率。

2.3 cffDNA水平的測(cè)定PCR是目前檢測(cè)cffDNA最常用的方法。Wataganara等［25］研究顯示，PCR檢測(cè)cffDNA在妊娠婦女血中的檢測(cè)限為5.83 copies/m l。目前妊娠21三體綜合征胎兒妊娠婦女血漿中cffDNA水平明顯增加的原因可能為: (1)妊娠21三體綜合征胎兒結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，胎兒與母體間的交換致使胎兒細(xì)胞進(jìn)入母體增多，從而使妊娠婦女血漿中的胎兒有核紅細(xì)胞明顯增多，為正常的4～5倍。增多的胎兒細(xì)胞進(jìn)入妊娠婦女血清后自行凋亡釋放cffDNA;(2)由于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡或胎盤重塑導(dǎo)致其直接釋放cffDNA進(jìn)入母體血液中;(3)有學(xué)者報(bào)道，在妊娠21三體綜合征妊娠婦女的胎盤上發(fā)現(xiàn)較多的絨毛出血及未成熟的滋養(yǎng)層細(xì)胞，這樣可能會(huì)加速胎兒與母體間的游離核酸交換，導(dǎo)致cffDNA水平明顯增多［26］。有研究表明，妊娠13三體綜合征胎兒的妊娠婦女血漿中cffDNA水平是正常妊娠婦女的1.8倍［25］。

2.4 非整倍性染色體檢測(cè)自從Lo等［3］在孕有男胎的妊娠婦女血漿中檢測(cè)出胎兒Y染色體特異性DNA序列之后，發(fā)現(xiàn)了不依賴于胎兒性別和母體血漿的胎兒特異性標(biāo)志物，這為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷胎兒非整倍性染色體提供了可能。Nicolaides等［27］利用妊娠婦女血漿中cffDNA測(cè)序13、18、21、X、Y染色體非整倍性的SNP目標(biāo)序列，可作為無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查胎兒非整倍性染色體的方法，該技術(shù)不但精確，且不受缺乏SNP、DNA提取質(zhì)量和雜合子診斷的限制，臨床應(yīng)用前景較大。Poon等［28］檢測(cè)出妊娠婦女和胎兒DNA序列甲基化之間的差異，首次將表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物用于無創(chuàng)產(chǎn)前篩查。隨后利用發(fā)現(xiàn)的18號(hào)染色體上maspin基因(SERPINB5)［29］、21號(hào)染色體上AIRE基因［30］和HLCS基因［31］啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)的高度甲基化差異，成功檢測(cè)了18三體綜合征和21三體綜合征，但是這些方法均受限于酶切位點(diǎn)和經(jīng)亞硫酸氫鈉前處理導(dǎo)致的DNA降解。Tong等［32］首次利用DNA的甲基化修飾和免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation methodology，MeDiP)檢測(cè)技術(shù)克服了以上問題，成功診斷出14例21三體綜合征和26例其他非整倍性染色體。

由于通用性標(biāo)志物研究應(yīng)用的局限性，近幾年研究建立了digital PCR和MPGS。digital PCR即數(shù)字相對(duì)染色體計(jì)量分析，比PCR更為精確，可對(duì)cffDNA水平進(jìn)行精確定量分析。其不依賴胎兒性別及遺傳多態(tài)性，甚至允許有母體DNA的污染和嵌合體的存在，具有較高的臨床靈敏度和較廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。Lo等［33］利用digital PCR診斷胎兒非整倍性染色體，但需要胎兒非整倍性染色體DNA水平需達(dá)到cffDNA總水平的25%以上。

采用MPGS技術(shù)，通過對(duì)妊娠婦女血漿中總DNA片段測(cè)序檢測(cè)胎兒非整倍性染色體，不需要分離出cffDNA，由此可精確計(jì)算出釋放在血漿中各種游離DNA的水平，經(jīng)序列比對(duì)可計(jì)算出血漿中每條染色體的相對(duì)水平。如果胎兒為21三體綜合征，則代表21號(hào)染色體的特異性序列在妊娠婦女血漿中存在過度表達(dá)，從而導(dǎo)致妊娠婦女血漿中21號(hào)染色體序列的比例小幅增加而被檢測(cè)出。Chiu等［34］報(bào)道了利用GAII Analyser(Illumina)測(cè)序系統(tǒng)，分別采用8－重和2－重的方法檢測(cè)21三體綜合征，具有很高的靈敏度(分別為79.1%和98.9%)和特異度(分別為100.0%和97.9%)。Palomaki等［35］利用HiSeq 2000(Illumina)測(cè)序系統(tǒng)采用4－重分析法，其靈敏度和特異度分別為98.6%和99.8%?；赾ffDNA檢測(cè)胎兒非整倍性染色體技術(shù)發(fā)展進(jìn)程見表1。

表1 基于cffDNA檢測(cè)胎兒非整倍性染色體技術(shù)發(fā)展進(jìn)程Table 1 Recent advances of cffDNA testing on fetal aneuploidy detection

3 小結(jié)

目前，胎兒非整倍性染色體的基本預(yù)防措施包括:(1)避免高齡妊娠;(2)對(duì)具有非整倍性染色體風(fēng)險(xiǎn)的夫妻進(jìn)行妊娠前基因診斷;(3)補(bǔ)充葉酸。如果以上預(yù)防措施在妊娠婦女35歲前完成，可明顯降低胎兒非整倍性染色體的發(fā)生。由此可見，cffDNA檢測(cè)在無創(chuàng)產(chǎn)前篩查胎兒非整倍性染色體領(lǐng)域發(fā)展?jié)摿薮?。但測(cè)序相關(guān)費(fèi)用昂貴以及對(duì)檢測(cè)結(jié)果解釋需要復(fù)雜的生物信息學(xué)，為cffDNA檢測(cè)的發(fā)展帶來了一定的局限性。目前，雖然已有大量前瞻性臨床研究，對(duì)應(yīng)用cffDNA檢測(cè)胎兒非整倍性染色體篩查的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證，但尚需大樣本試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期進(jìn)一步降低檢測(cè)成本，提高檢測(cè)效率，使cffDNA檢測(cè)成為重要的產(chǎn)前篩査方法。

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Research Progress of Aneuploidy Detection Based on Cell－free Fetal DNA in the First Trimster of Pregnancy

MA Dong，TONG Wen－xiu，ZHANG Yan－mei，et al.North China University of Science and Technology，Hebei Coal Occupational Health and Safety Key Laboratory，Tangshan 063000，China

Aneuploidiy is a major cause for perinatal morbidity and mortality.In the first trimester of pregnancy，the main purpose of prenatal screening method is to achieve maximum detection rate and low false positive rate，and reduce unnecessary invasive procedures at a relatively low cost.Besides the serology，ultrasound and comprehensive screening method，the non－invasive gene detection method using cell－free fetal DNA(cffDNA)in maternal plasma is more rapid and accurate.In this paper，we reviewed the research progress of detection method for aneuploid chromosome abnormality，in order to effectively control the birth of infants with chromosome abnormalities and to provide technical support for the improvement of population quality.

Prenatal diagnosis;Chromosome aberrations;Non－invasive prenatal testing;Cell－free fetal DNA

R 596.1

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.30.021

2015－02－21;

2015－06－16)

(本文編輯:李婷婷)

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2014105093)

063000河北省唐山市，華北理工大學(xué)，河北省煤炭職業(yè)衛(wèi)生與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(馬冬，李琪);唐山工人醫(yī)院婦產(chǎn)科(佟文秀，張艷梅，姜杰，李鷗)

李鷗，063000河北省唐山市，唐山工人醫(yī)院婦產(chǎn)科;

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