王美芹，張建志，王莉

維生素D結(jié)合蛋白基因rs2282679 A/C多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的相關(guān)性研究

王美芹，張建志，王莉

目的探討維生素D結(jié)合蛋白(VDBP)基因rs2282679 A/C多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病(COPD)的相關(guān)性。方法選取2012年3月—2014年5月衡水市哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院住院治療的男性COPD患者120例為COPD組，另選取同時(shí)期衡水市疾病預(yù)防控制中心體檢健康男性112例為對(duì)照組，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)血清25羥維生素D〔25(OH)D〕水平，采用TaqMan－聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)VDBP基因rs2282679 A/C等位基因頻率及基因型分布。結(jié)果對(duì)照組25(OH)D水平(55.1±5.8)nmol/L高于COPD組的(37.3±2.3)nmol/L(t=31.220，P＜0.001)。對(duì)照組與COPD組VDBP基因rs2282679 A/C等位基因頻率與基因型分布比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)照組與COPD組AA、AC、CC基因型者組間25(OH)D水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)照組和COPD組組內(nèi)AA、AC、CC基因型者25(OH)D水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);其中AC、CC基因型者低于AA基因型者，CC基因型者低于AC基因型者(P＜0.05)。調(diào)整年齡、吸煙指數(shù)后，AA基因型比AC基因型COPD易患率低18.3%〔OR=0.374，95%CI(0.197，0.708)，P=0.002〕;AA基因型比CC基因型COPD易患率低35.8%〔OR=0.260，95%CI(0.106，0.640)，P=0.002〕;AC基因型比CC基因型COPD易患率低16.7%〔OR =0.201，95%CI(0.849，4.744)，P=0.109〕。結(jié)論VDBP基因rs2282679 A/C多態(tài)性與COPD具有相關(guān)性，其中CC基因型與COPD易患性、25(OH)D水平關(guān)系緊密，或可作為COPD易患性篩選的突變位點(diǎn)。

肺疾病，慢性阻塞性;維生素D結(jié)合蛋白質(zhì);基因;多態(tài)性，單核苷酸

王美芹，張建志，王莉.維生素D結(jié)合蛋白基因rs2282679 A/C多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的相關(guān)性研究［J］．中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(30):3678－3681.［www.chinagp.net］

Wang MQ，Zhang JZ，Wang L.Correlation between rs2282679 A/C polymorphism in vitamin D－binding protein gene and chronic obstructive pulmonary disease［J］．Chinese General Practice，2015，18(30):3678－3681.

目前，慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的發(fā)病機(jī)制尚不明確，造成的肺功能降低亦無(wú)有效干預(yù)措施，其死亡率居所有死因第4位，且呈逐年遞增趨勢(shì)，全球疾病負(fù)擔(dān)研究項(xiàng)目預(yù)計(jì)到2020年COPD將為死因第3位［1］。我國(guó)對(duì)7個(gè)地區(qū)20 245名成年人的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，40歲以上人群的COPD患病率高達(dá)8.2%［2］。探索COPD的發(fā)病機(jī)制是預(yù)防該病的關(guān)鍵。維生素D參與了COPD的慢性氣道炎癥過(guò)程，對(duì)人體的呼吸器官具有保護(hù)作用，其在人體內(nèi)的水平與肺功能密切相關(guān)［3］。因此，近年來(lái)關(guān)于維生素D與COPD的研究成為該病防治的熱點(diǎn)。維生素D結(jié)合蛋白(VDBP)是一種合成于肝臟的多功能血漿球蛋白，可結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)維生素D及其代謝物{如25羥維生素D〔25(OH)D〕、1，25－二羥維生素D3〔1，25－(OH)2D3〕}至靶器官發(fā)揮生理作用［4］。VDBP基因多態(tài)性與維生素D的水平關(guān)系密切，目前已知的基因型有124種［5］，有研究報(bào)道顯示，位于第12內(nèi)含子的rs2282679A/C多態(tài)性與維生素D水平相關(guān)［6］。本研究擬探討VDBP基因rs2282679A/C多態(tài)性與25(OH)D水平、COPD易患性的關(guān)系，了解COPD的發(fā)生機(jī)制，為防治COPD提供依據(jù)與指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn):發(fā)病為中年，有長(zhǎng)期吸煙或其他煙霧接觸史，癥狀進(jìn)展緩慢，存在持續(xù)性氣流受限，吸入支氣管舒張劑后第1秒用力呼氣末容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)＜70%［2］。排除標(biāo)準(zhǔn):患有或合并肺炎、支氣管哮喘、間質(zhì)性肺疾病等影響肺功能測(cè)定結(jié)果的疾病;患有或合并腫瘤、1型糖尿病、自身免疫性疾病、心血管疾病等影響維生素D水平的慢性疾病;采血前1個(gè)月口服維生素D;入選者間有血緣關(guān)系;近6個(gè)月COPD急性發(fā)作者。

1.2 臨床資料選取2012年3月—2014年5月衡水市哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院住院治療的COPD患者120例為COPD組，均符合上述納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，漢族，男性，年齡42～71歲，平均年齡(63.6±10.5)歲;吸煙指數(shù)(每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù))(28.6±3.2)年支，F(xiàn)EV1/FVC為(61±20)%，F(xiàn)EV1占預(yù)計(jì)值百分比為(63±23)%。另選取同時(shí)期衡水市疾病預(yù)防控制中心體檢健康男性112例為對(duì)照組，漢族，年齡40～70歲，平均年齡(62.5±9.7)歲;吸煙指數(shù)(27.4±2.0)年支，F(xiàn)EV1/FVC為(85±34)%，F(xiàn)EV1占預(yù)計(jì)值百分比為(87±24)%。兩組年齡、吸煙指數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為0.827和0.196，P值分別為0.409和0.051);對(duì)照組FEV1/FVC、FEV1占預(yù)計(jì)值百分比高于COPD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為6.650和45.667，P值均＜0.001)。

1.3 肺功能檢測(cè)使用cosmed便攜式肺功能儀(上海益聯(lián)醫(yī)學(xué)儀器發(fā)展有限公司)進(jìn)行肺功能測(cè)定。測(cè)定前避免使用短效或長(zhǎng)效支氣管舒張劑，受試者深吸氣后以爆發(fā)力快速用力用口呼吸，檢測(cè)2次，取較佳者。

1.4 維生素D水平檢測(cè)抽取受試者空腹外周血5 ml，2 h內(nèi)－70℃冷凍保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)25(OH)D水平［7］。

1.5 基因組DNA提取與分型收集受試者外周血細(xì)胞，采用Qiagen試劑盒(廣州健侖生物科技有限公司)提取DNA。嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，步驟為:預(yù)冷，充分研磨血細(xì)胞，加入緩沖液將二者混勻，2 500 r/min離心10 min(離心半徑13.5 cm)、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、鹽析、2 500 r/min離心10 min(離心半徑13.5 cm)棄沉淀取上清液，加無(wú)水乙醇沉淀、12 000 r/min離心5 min(離心半徑8 cm)，洗提DNA。

采用TaqMan－聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法對(duì)DNA上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)進(jìn)行基因分型。儀器:實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，采用SDS 2.3軟件檢測(cè)基因熒光信號(hào)確定樣本的基因型。結(jié)果滿(mǎn)足Hardy－Weinberg平衡(χ2=16.20，P=0.07)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以(±s)表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法;不同基因型與25(OH)D水平關(guān)系采用單因素方差分析，不同基因型與COPD易患率的關(guān)系采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組25(OH)D水平比較對(duì)照組25(OH)D水平為(55.1±5.8)nmol/L，COPD組25(OH)D水平為(37.3±2.3)nmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t =31.220，P＜0.001)。

2.2 兩組等位基因頻率與基因型分布比較對(duì)照組與COPD組VDBP基因rs2282679 A/C等位基因頻率與基因型分布比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表1)。

表1 對(duì)照組與COPD組VDBP基因rs2282679 A/C等位基因頻率與基因型分布比較〔n(%)〕Table1 Comparison of allele frequency and genotype distribution of VDBP gene A/C rs2282679 between control group and COPD group

2.3 兩組不同基因型者25(OH)D水平比較對(duì)照組與COPD組AA、AC、CC基因型者組間25(OH)D水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)照組和COPD組AA、AC、CC基因型者組內(nèi)25(OH)D水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);其中AC、CC基因型者低于AA基因型者，CC基因型者低于AC基因型者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表2)。

表2 兩組不同基因型者25(OH)D水平比較(±s，nmol/L)Table 2 Comparison of 25(OH)D level between the two groups of different genotype distribution

表2 兩組不同基因型者25(OH)D水平比較(±s，nmol/L)Table 2 Comparison of 25(OH)D level between the two groups of different genotype distribution

注:25(OH)D=25羥維生素D;與AA基因型比較，aP＜0.05;與AC基因型比較，bP＜0.05

組別AA例數(shù)25(OH)D AC例數(shù)25(OH)D CC例數(shù)25(OH)D F值P值47.560＜0.001 COPD組102 41.3±3.9 15 39.6±3.1a3 36.4±2.9ab56.880＜0.001 t值對(duì)照組106 58.6±5.2 4 56.0±4.9a2 51.3±2.2ab＜0.001＜0.001＜0.001 28.936 32.840 65.964 P值

2.4 不同基因型與COPD易患性的關(guān)系調(diào)整年齡、吸煙指數(shù)后，AA基因型比AC基因型COPD易患率低18.3%〔OR=0.374，95%CI(0.197，0.708)，P =0.002〕;AA基因型比CC基因型COPD易患率低35.8%〔OR=0.260，95%CI(0.106，0.640)，P =0.002〕;AC基因型比CC基因型COPD易患率低16.7%〔OR=0.201，95%CI(0.849，4.744)，P =0.109〕。

3 討論

COPD是一種不可逆的氣流受限性疾病，本研究結(jié)果顯示，COPD組FEV1/FVC、FEV1占預(yù)計(jì)值百分比、25(OH)D水平均低于對(duì)照組。有學(xué)者指出，由于COPD患者的全身炎性反應(yīng)、缺乏營(yíng)養(yǎng)、皮膚老化等問(wèn)題影響維生素D的吸收、代謝、合成，導(dǎo)致此類(lèi)患者普遍存在維生素D缺乏［8］。Janssens等［9］在調(diào)研COPD患者維生素D缺乏程度時(shí)發(fā)現(xiàn)，維生素D缺乏與骨質(zhì)疏松、骨骼肌能力降低引起的骨折密切相關(guān)，而這又會(huì)引起呼吸運(yùn)動(dòng)受限、呼吸肌障礙、FEV1與FVC降低。本研究未對(duì)25(OH)D水平與呼吸受限程度進(jìn)行相關(guān)性分析，但從二者在COPD組的低水平表現(xiàn)與已知的研究報(bào)道來(lái)看，兩者相關(guān)度緊密。李曉晨等［10］關(guān)于COPD的研究結(jié)果顯示，COPD組與健康組中血清25(OH)D水平與FEV1占預(yù)計(jì)值百分比均呈正相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，VDBP基因rs2282679多態(tài)性與COPD的發(fā)生存在相關(guān)性，對(duì)照組與COPD組VDBP基因rs2282679 A/C等位基因頻率與基因型分布比較均有差異;從易患關(guān)系來(lái)看，CC基因型COPD易患率最高。本研究對(duì)rs2282679基因型與25(OH)D水平進(jìn)行觀察，結(jié)果CC基因型25(OH)D水平最低，且無(wú)論COPD組還是對(duì)照組AA、AC、CC基因型者組內(nèi)25(OH)D水平比較有差異。Ahn等［11］對(duì)5個(gè)組群的4000余名歐洲人進(jìn)行全基因與25(OH)D水平的觀察發(fā)現(xiàn)，25(OH)D水平與SNP位點(diǎn)rs2282679關(guān)系密切。一份關(guān)于北京、上海地區(qū)漢族維生素D水平的報(bào)道顯示，rs2282679A/C與25(OH)D水平具有相關(guān)性，其中C等位基因的單倍體型與25(OH)D水平亦存在關(guān)聯(lián)性［12］。CC基因型的COPD高易患率與其低水平的25(OH)D具有一致性，VDBP表達(dá)水平降低，維生素D水平缺乏導(dǎo)致肺功能下降、免疫反應(yīng)障礙、抗感染能力降低等，繼而使COPD發(fā)生或加重。

綜上所述，VDBP基因rs2282679A/C多態(tài)性與25(OH)D水平和COPD易患性密切相關(guān)，其中CC基因型者25(OH)D水平最低，患COPD的風(fēng)險(xiǎn)較高。本研究存在地域、入選條件的局限性，如在全國(guó)范圍的人群中得到證實(shí)，將有助于了解我國(guó)人群維生素D的調(diào)節(jié)機(jī)制，或可將rs2282679位點(diǎn)CC基因型作為COPD易患性篩選的突變位點(diǎn)。

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Correlation Between rs2282679 A/C Polymorphism in Vitamin D－binding Protein Gene and Chronic Obstructive Pulmonary Disease Pulmonary Disease

WANGMei－qin，ZHANG Jian－zhi，WANG Li.Harrison International Peace Hospital，Hengshui 053000，China

Objective To investigate the correlation between rs2282679 A/C polymorphism in vitamin D－binding protein(VDBP)gene and chronic obstructive pulmonary disease(COPD).Methods Enrolled 120 COPD patients who were admitted into Harrison International Peace Hospital in Hengshui from March 2012 to May 2014 as COPD group.Also enrolled 112 health males who received physical examination in the same period as control group.ELISA was employed to detect serum 25(OH)D，and TaqMan－PCR was used to detect the allele frequency and genotype distribution of rs2282679 A/C in VDBP gene.Results The 25(OH)D levels of control group and COPD group were(55.1±5.8)nmol/L and(37.3±2.3) nmol/L respectively，with control group higher than COPD group(t=31.220，P＜0.001).Control group and COPD group were significantly different in allele frequency and genotype distribution of rs2282679 A/C in VDBP gene(P＜0.05).Control group and COPD group were significantly different in 25(OH)D levels of AA，AC and CC genotypes(P＜0.05).In control group and COPD group，subjects of AA，AC and CC genotypes were significantly different in 25(OH)D level(P＜0.05); subjects of AC and CC genotype were lower than subjects of AA genotype，and subjects of CC genotype were lower than subjects of AC genotype(P＜0.05).After the adjustment of age and smoking indexes，AA genotype is 18.3%lower than AC genotype in susceptibility to COPD〔OR=0.374，95%CI(0.197，0.708)，P=0.002〕;AA genotype is 35.8%lower than CC genotype in susceptibility to COPD〔OR=0.260，95%CI(0.106，0.640)，P=0.002〕;AC genotype is16.7%lower than CC genotype in susceptibility to COPD〔OR=0.201，95%CI(0.849，4.744)，P=0.109〕.Conclusion rs2282679 A/C polymorphism in VDBP gene is significantly associated with COPD.CC genotype is related to the liability of COPD and is closely related with 25(OH)D，and it may be a mutation site for the screening of COPD liability.

Pulmonary disease，chronic obstructive;Vitamin D－binding protein;Genes;Polymorphism，single nucleotide

R 563

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.30.010

2015－01－21;

2015－07－15)

(本文編輯:陳素芳)

053000河北省衡水市哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院(王美芹);河北省衡水市疾病預(yù)防控制中心(張建志);河北省衡水市桃城區(qū)婦幼保健院(王莉)

張建志，053000河北省衡水市疾病預(yù)防控制中心;E－mail:zhangjianzhi99@163.com