羅君，蘇松柏，華玉玲，吳紅梅，張建玲，賀祝英

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴陽 550001;2.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴陽 550001)

心衰寧合劑來源于臨床的有效方劑，是貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科用于治療各種慢性心力衰竭以及輔助治療急性心衰的經(jīng)驗方，由紅參、黃芪、丹參、益母草和炙甘草等8味中藥組成。在保證療效的前提下，為便于患者服用和攜帶，對方中藥材提取及其制備工藝進行了研究[1]。為有效地控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量，確保其臨床應(yīng)用安全、有效，筆者對心衰寧合劑的質(zhì)量標準進行了研究。對紅參，黃芪和丹參進行了薄層色譜(thin layer chromatography，TLC)鑒別，并建立了高效液相色譜 (highperformanceliquid chromatography，HPLC)測定君藥紅參中主成分人參皂苷Rb1的含量測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器日本島津2010高效液相色譜儀;TG332A

1.2 試藥 心衰寧合劑(由貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑室提供，批號:090410，090423，090424)，人參皂苷 Rb1對照品(批號:110704-200420，含量:95.9%)、人參皂苷 Rg1對照品(批號:110703-200425，含量:93.4%)、人參皂苷 Re對照品(批號:110754-200421，含量:92.7%);紅參對照藥材(批號:121045-201105)、黃芪對照藥材(批號:121462-200702)、丹參對照藥材(批號:120923-201111)均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純(美國，Dikmapure)，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 紅參的TLC鑒別 取本品5 mL，加水5 mL稀釋，用三氯甲烷洗滌2次，每次10 mL;棄去三氯甲烷層，取水層用水飽和的正丁醇提取2次，每次10 mL;合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次10 mL;棄去水層，取正丁醇層，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取紅參對照藥材0.5 g，加水1 mL潤濕，超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。另取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品及人參皂苷Rb1對照品，加甲醇制成每毫升各含0.2 mg的混合溶液，作為對照品溶液。按心衰寧合劑制備工藝制備缺紅參陰性藥液，同法制備其陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)實驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10℃靜置的下層液為展開劑[2]。展開，取出，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖1。

2.1.2 黃芪的TLC鑒別 取黃芪對照藥材1 g，加水1 mL潤濕，超聲提取30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇 1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。另取“2.1.1”項下供試品溶液。按心衰寧合劑制備工藝制備缺黃芪陰性藥液，同法制備其陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實驗，吸取上述兩種溶液各3 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水(9∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖2。

2.1.3 丹參的TLC鑒別 取本品5 mL，加水5 mL稀釋，加鹽酸溶液(10→100)1 mL，振搖，用乙酸乙酯提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯層，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對照藥材1 g，加鹽酸溶液(10→100)1 mL潤濕，再加入乙酸乙酯10 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。按心衰寧合劑制備工藝制備缺丹參陰性藥液，同法制備其陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-丙酮-甲酸(8∶2∶1)為展開劑，展開，取出，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖3。

2.2 含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rb1對照品10.952 mg，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇制成每毫升含1.095 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品，精密量取5 mL，置分液漏斗中，加入二氯甲烷洗滌2次，每次10 mL;合并二氯甲烷液，用水10 mL提取，合并水層，用水飽和的正丁醇提取4次，每次10 mL;合并正丁醇液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌2次，每次15 mL，合并堿液層，用水飽和的正丁醇提取2次，每次10 mL;合并以上正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次15 mL，水層用水飽和的正丁醇依次提取，合并正丁醇液，蒸干，用甲醇分次洗滌并定容至10 mL，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按制劑工藝制備處方中除去紅參的陰性對照樣品。按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，按含量測定項下方法測定，結(jié)果顯示，在此條件下供試品溶液中的人參皂苷Rb1得到良好分離，并且缺紅參的陰性對照無干擾。見圖4。

2.2.4 色譜條件和系統(tǒng)適用性 色譜柱為Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);以乙腈為流動相 A，0.1%磷酸溶液為流動相B，按表1梯度洗脫條件進行洗脫，流速為1 mL·min－1，檢測波長203 nm，柱溫25℃。理論板數(shù)按人參皂苷Rb1峰計算應(yīng)不低于3 000。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取人參皂苷Rb1儲備液2 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得每毫升含人參皂苷Rb1為0.219 mg的對照品溶液。分別精密吸取上述人參皂苷Rb1對照品溶液5，10，15，20，25 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖，以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積值(A)為縱坐標，繪制標準曲線。得回歸方程:Y=145 623X+13 925.6，r=0.999 8，將回歸方程擬合為過原點的方程得:Y=149 091X，取線性關(guān)系考察中中間點進樣量人參皂苷Rb1峰面積值分別代入上述兩個方程，計算得兩者相對偏差為0.26%，說明可用外標一點法進行含量測定。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1在1.095～5.475 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 流動相洗脫梯度表Tab.1 Elution gradient of mobile phase

2.2.6 精密度實驗 分別精密吸取人參皂苷Rb1對照品溶液 10 μL(濃度為 0.219 mg·mL－1)，連續(xù)進樣 6次，人參皂苷Rb1峰面積的RSD為0.49%，表明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品(批號:090410)，按“2.2.2”項下制備供試液。分別于 0，4，8，12，24 h 進樣，測定得人參皂苷Rb1含量的RSD為0.74%，表明供試液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性實驗 精密稱定本品(批號:090410)6份，各 5 mL，按“2.2.2”項下制備供試液。精密吸取供試品溶液各10 μL，測定得人參皂苷 Rb1含量的RSD為0.94%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率實驗 取已知含量的同一批樣品(批號:090410)6份，精密量取2.5 mL，分別加入人參皂苷Rb1對照品溶液(0.219 mg·mL－1)7 mL，按“2.2.2”項下制備供試液，精密吸取供試品溶液10 μL，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，計算含量，結(jié)果人參皂苷Rb1平均回收率為 97.3%，RSD 為1.98%。

2.2.10 樣品測定 分別取 3 批次的樣品，按“2.2.2”項下制備供試液，按上述色譜條件測定，外標法計算人參皂苷 Rb1含量，結(jié)果批號為 090410，090423，090424的樣品，人參皂苷 Rb1含量分別為0.58，0.60，0.58 mg·mL－1。

3 討論

紅參為心衰寧合劑方中君藥，《中華人民共和國藥典》2010年版一部“紅參”項下，選擇以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1為指標成分，優(yōu)選得在色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，進行梯度洗脫，檢測波長為203 nm，柱溫25℃下進行分析時:人參皂苷Rb1峰分離良好;人參皂苷Rg1峰和人參皂苷Re峰雖能達到良好的分離效果，但人參皂苷Rg1前有干擾峰難以排除，人參皂苷Re峰較小，不利于定量分析方法的建立。故以人參皂苷Rb1作為制劑的指標成分。

實驗中對樣品提取方法進行了優(yōu)選，結(jié)果，最終確定的提取方法較文獻[3]提取方法更完全，且雜質(zhì)峰較少。實驗中分別對正丁醇提取次數(shù)2，3和4次進行了考察，結(jié)果提取次數(shù)2，3和4次的含量分別為0.178，0.432和 0.459 mg·mL－1，提取 4 次比提取 3 次含量要高，故以水飽和的正丁醇提取4次。樣品中人參皂苷Rb1含量限度的確定，每毫升制劑中人參皂苷Rb1含量限度為0.3 mg·mL－1。結(jié)合3批樣品測定結(jié)果，考慮到生產(chǎn)工藝波動及貯藏條件變化等因素的影響，將本品每毫升含紅參以人參皂苷Rb1計，暫定為不得少于0.40 mg。

綜上所述，經(jīng)過方法學(xué)考察及3批樣品測定，人參皂苷Rb1色譜峰分離度高，峰形良好，陰性無干擾，重復(fù)性、精密度良好，回收率符合要求，整個實驗過程可操作性強，能夠客觀地控制本品的質(zhì)量。

[1]張建玲，賀祝英，吳紅梅.正交試驗優(yōu)選心衰寧合劑水提工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(7):30－33.

[2]李玉賾，劉永先.養(yǎng)心丸中紅參、當歸、丹參、五味子的薄層色譜鑒別[J].遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，6(3):226.

[3]沈志濱，朱俊訪，李博.HPLC法測定益氣復(fù)脈口服液中人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2006，22(3):259－260.