陳建秋王玉紅李鵬李靜,閻超,**(.上海交通大學(xué)藥學(xué)院 上海 0040；．上海通微分析技術(shù)有限公司 上海 003)

核殼液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法直接檢測(cè)20種氨基酸*

陳建秋1王玉紅2李鵬2李靜1,2閻超1,2**
(1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院 上海 200240；2．上海通微分析技術(shù)有限公司 上海 201203)

目的：應(yīng)用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light scattering detector, ELSD）、“HALO”核-殼型新型填料液相色譜柱，建立一種高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLC-ELSD）直接測(cè)定20種未衍生氨基酸的分析方法，并將其用于復(fù)方氨基酸注射液中氨基酸含量的測(cè)定。方法：采用核-殼型HALO色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 mm C18），以甲醇-九氟戊酸-七氟丁酸-三氟乙酸-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速0.5 ml/min，ELSD飄移管溫度40 ℃，載氣流速3.0 L/min，對(duì)20種基本氨基酸進(jìn)行分離檢測(cè)。結(jié)果：氨基酸的質(zhì)量濃度在0.01～1.0 mg/ml范圍內(nèi)，其峰面積的對(duì)數(shù)值與進(jìn)樣質(zhì)量的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系；氨基酸的檢出限介于20～50 ng之間，樣品加標(biāo)回收率為89.0%～111.2%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠，溶劑消耗少，為藥品、食品、飼料及化工生產(chǎn)等領(lǐng)域混合氨基酸樣品的直接檢測(cè)提供了參考。

反相高效液相色譜 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 核殼型填料 未衍生氨基酸

氨基酸是生命體基本物質(zhì)之一，也是常見的食品添加劑和藥物制劑成分。由于氨基酸具有高極性、低揮發(fā)性、大部分無強(qiáng)發(fā)色基團(tuán)的特性，其分離和檢測(cè)都較為困難，而目前常規(guī)使用的氨基酸分離檢測(cè)方法是柱后在線衍生“茚三酮”法，即經(jīng)典氨基酸分析儀法，其存在儀器昂貴、運(yùn)行費(fèi)用高、衍生物不穩(wěn)定、反應(yīng)條件沖突、操作時(shí)間長(zhǎng)等諸多問題[1-4]。

本研究采用國(guó)產(chǎn)HPLC-ELSD平臺(tái)及核殼型填料色譜柱[5-8]，在未衍生情況下將20種氨基酸在30 min內(nèi)達(dá)到基本基線分離[9-10]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器，試劑與材料

EasySepTM-1020高效液相色譜儀（上海通微分析技術(shù)有限公司）；UM-5000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（上海通微分析技術(shù)有限公司）；KQ2200B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；FA1004電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）

氨基酸對(duì)照品：?；撬幔╰aurine）、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酰胺(Gln)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、脯氨酸(Pro)、胱氨酸(Cys-Cys)、賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)、纈氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、甲硫氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)，純度均大于99.0%，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸(TFA)(HPLC級(jí)，美國(guó)天地公司)；七氟丁酸和九氟戊酸(HPLC級(jí)，J&K chemical 公司）；甲醇(HPLC級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；水為二次重蒸餾水；其他試劑均為分析純；復(fù)方氨基酸注射液（15AA）(批號(hào)：1110281-1，江蘇四環(huán)生物股份有限公司); HALO C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 mm）（上海通微分析技術(shù)有限公司）。

1.2 溶液制備

對(duì)照品儲(chǔ)備液：分別稱取20種氨基酸對(duì)照品適量，置于同一量瓶中，加0.2 mol·L-1鹽酸溶液溶解配制成各氨基酸濃度均約為1.0 mg·ml-1的混合溶液，用0.22 mm濾膜過濾備用。

供試品溶液：將復(fù)方氨基酸注射液（250 ml∶20 g（總氨基酸））以二次重蒸餾水稀釋50倍，用0.22 mm濾膜過濾備用[11-12]。

1.3 色譜條件

流動(dòng)相：A相為九氟戊酸-七氟丁酸-三氟乙酸-水(1∶5∶0.6∶1000，V/V/V/V)；B相為甲醇；梯度洗脫程序：0～8 min，0%B；8～13 min，0%B～20%B；13～23 min，20%B～40%B；23～25 min，40%B～60%B，保持至5.5 min。流速0.5 ml·min-1。漂移管溫度40 ℃；載氣流速3.0 L·min-1；進(jìn)樣體積10 ml；柱溫25 ℃。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照氨基酸溶液的分離

取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，稀釋成0.05 mg·ml-1混合溶液，以10 ml定量環(huán)進(jìn)樣，20種氨基酸的分離結(jié)果如圖1所示。通過色譜圖，計(jì)算各組分的理論塔板數(shù)和分離度，其最小值分別為3 167（按taurine峰計(jì))和1.13（Gly峰與Ser峰)，在該色譜條件下，20種氨基酸峰能在30 min內(nèi)基本達(dá)到基線分離。

圖1 20種氨基酸對(duì)照品混合液的HPLC-ELSD色譜圖

2.2 線性關(guān)系和檢出限

分別取20種氨基酸質(zhì)量濃度均約為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 mg·ml-1的對(duì)照品混合溶液，在上述條件下分析，以各氨基酸樣品濃度（mg·ml-1）的對(duì)數(shù)X為橫坐標(biāo)，以各氨基酸峰面積的對(duì)數(shù)Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，各氨基酸的線性回歸方程見表l。以0.01 mg·ml-1對(duì)照品混合溶液進(jìn)樣，并讀取各氨基酸的對(duì)應(yīng)峰高，逐步稀釋混合溶液，當(dāng)各氨基酸信噪比約為3時(shí)，計(jì)算得到各氨基酸組分的檢出限介于20～50 ng之間，其中絲氨酸的檢出限最高，為50 ng（折合質(zhì)量濃度為0.005 mg·ml-1）[13]。

表l 20種氨基酸線性方程

2.3 方法的精密度

取0.05 mg?ml-1混合對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣10 ml，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定保留時(shí)間和峰面積。各組分保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.04%～0.6%，峰面積的RSD為1.7%～2.8%。

2.4 樣品回收率

精密量取3份復(fù)方氨基酸注射液樣品分別置于容量瓶中，加入一定量的氨基酸對(duì)照品溶解后，按供試品溶液制備方法制備后測(cè)定（圖2）。因樣品中Cys含量低于該色譜條件下的檢測(cè)限，故僅檢測(cè)出了14種氨基酸。樣品中14種氨基酸回收率均在89.0%～111.2%之間，RSD為1.9%～9.7%。

2.5 樣品分析

配制3份供試品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果見表2。

圖2 復(fù)方氨基酸注射液的HPLC-ELSD色譜圖

表2 復(fù)方氨基酸注射液檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

本研究采用的色譜柱為新型核殼型填料色譜柱（HALO色譜柱），其整體粒徑大小為2.7 mm，其中多孔外殼大小為0.5 mm。該色譜柱具有亞2微米色譜柱的超高柱效，可在常規(guī)高效液相色譜儀上進(jìn)行復(fù)雜混合物的快速分離，實(shí)現(xiàn)近似UHPLC的性能[14]，但操作背壓卻不高于400 bar（4×107Pa），且易于在不同儀器上進(jìn)行方法轉(zhuǎn)移。其原理是因?yàn)楹藲そY(jié)構(gòu)降低了渦流擴(kuò)散和提供了更快的傳質(zhì)過程，導(dǎo)致色譜峰擴(kuò)散和柱背壓較低。核殼型顆粒并不完全多孔，應(yīng)用Fused-core處理技術(shù)與納米結(jié)構(gòu)技術(shù)的結(jié)合，在堅(jiān)實(shí)的硅膠核心上生成了一個(gè)既堅(jiān)固又均勻的多孔外殼，且?guī)缀鯖]有硅醇活性。此外該色譜柱所用的篩板孔徑（2 mm）要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于UHPLC（0.5 mm），解決了UPLC柱入口篩板的堵塞問題[15-16]。運(yùn)用該色譜柱，在30 min內(nèi)能達(dá)到樣品的基線分離，降低了分析成本，提高了樣品檢測(cè)速度。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本研究選擇離子對(duì)試劑作為流動(dòng)相結(jié)合梯度洗脫進(jìn)行氨基酸的分離。實(shí)驗(yàn)中分別選擇甲醇和乙腈作為有機(jī)相進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)同一條件下，乙腈對(duì)極性弱的氨基酸洗脫較強(qiáng)，造成保留時(shí)間提前，分離度明顯變差，綜合考慮，選擇甲醇作為有機(jī)相進(jìn)行梯度洗脫。另外，我們首先選擇七氟丁酸-三氟乙酸-水進(jìn)行流動(dòng)相篩選。當(dāng)逐漸增加七氟丁酸的濃度（0.3%、0.4%、0.5%），甘氨酸和絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸分離度略增加，但仍沒有達(dá)到基線分離；同時(shí)考察了九氟戊酸離子對(duì)試劑對(duì)氨基酸分離度的影響，其對(duì)蘇氨酸和丙氨酸的分離有了很大的提高。本研究創(chuàng)造性地將九氟戊酸和七氟戊酸按一定比例結(jié)合，解決了親水性氨基酸分離度不好的問題。另對(duì)三氟乙酸的濃度對(duì)氨基酸分離的影響也進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)隨著三氟乙酸濃度的降低，原先較難分離的甘氨酸和絲氨酸的分離度明顯增加，但這種變化對(duì)其他氨基酸的分離度也有一定影響，綜合考慮下，最終選擇三氟乙酸的濃度為0.05%。

3.3 流速對(duì)分離度的影響

分別調(diào)整流速為0.5、0.6、0.8和1.0 ml·min-1，考察各氨基酸的分離度，結(jié)果流速越高，最難分離的甘氨酸和絲氨酸的分離度越差，且梯度洗脫時(shí)柱壓達(dá)到最大值?？紤]實(shí)際應(yīng)用，我們選擇流速為0.5 ml·min-1。

3.4 色譜柱柱溫的選擇

分別在室溫（25 ℃）和45 ℃條件下進(jìn)行液相分離，發(fā)現(xiàn)溫度越高，氨基酸的保留時(shí)間越短，甘氨酸和絲氨酸的分離度越差。原因是溫度升高，減少了離子對(duì)對(duì)色譜柱硅膠的相互作用，使保留減弱。因此，我們選擇室溫條件下進(jìn)行分離。

3.5 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)的選擇

實(shí)驗(yàn)中使用的蒸發(fā)光散射檢測(cè)器是低溫型ELSD檢測(cè)器，可在較低溫度下實(shí)現(xiàn)流動(dòng)相的完全蒸發(fā)，有效降低溶劑形成的背景噪聲，同時(shí)避免了儀器在高溫下可能產(chǎn)生的信號(hào)噪聲干擾，提高了樣品檢測(cè)靈敏度。分別設(shè)定漂移管溫度為30、35、40、45和50 ℃，以各氨基酸的信噪比為考察對(duì)象，結(jié)果顯示漂移管溫度在30～50 ℃無明顯差別?？紤]到漂移管溫度低于溶劑蒸發(fā)溫度時(shí)，流動(dòng)相無法充分揮發(fā)，造成基線背景水平升高；而漂移管溫度過高時(shí)，可能會(huì)帶來較大的噪聲，且檢測(cè)器溫度應(yīng)保證高于實(shí)驗(yàn)室溫度以便溫度的調(diào)節(jié)控制，故本實(shí)驗(yàn)選用了40 ℃作為漂移管溫度。

保持漂移管溫度為40 ℃不變，對(duì)載氣流量（2.0、2.5、3.0、3.5 和4 L·min-1）進(jìn)行考察，結(jié)果顯示在低載氣流量下樣品信號(hào)響應(yīng)較高，但甘氨酸和絲氨酸的分離度有所降低，分析其原因，應(yīng)該是在低氣體流速條件下，樣品色譜峰的展寬造成的；最終選用載氣流量為3.0 L·min-1。

4 總結(jié)

本文實(shí)驗(yàn)基于核殼型填料色譜柱，建立了一種反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法分離檢測(cè)未衍生氨基酸，可在30 min內(nèi)完成20種未衍生氨基酸的分離測(cè)定，且基本達(dá)到基線分離，同時(shí)，選擇色譜流速為0.5 ml·min-1，在達(dá)到氨基酸分離的同時(shí)，也減少了流動(dòng)相的使用量，明顯降低了檢測(cè)成本，也減少了環(huán)境污染。該方法簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠，適用于氨基酸注射液中氨基酸含量的直接測(cè)定，同時(shí)該方法可開發(fā)為飼料中混合氨基酸樣品的檢驗(yàn)。所以，其對(duì)食品安全管理、藥物質(zhì)量控制和相關(guān)生產(chǎn)工業(yè)的工藝改良、質(zhì)量控制都有積極的作用。

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Simultaneous determination of 20 amino acids by core-shell ODS column HPLC with evaporative light-scattering detection*

CHEN Jianqiu1, WANG Yuhong2, LI Peng2, LI Jing1,2, YAN Chao1,2**
(1. School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; 2. Unimicro (Shanghai) Technologies Co. Ltd., Shanghai 201203, China)

Objective: An analytical method for the determination of 20 underivatized amino acids was established using HPLC with HALO column coupled with an evaporative light-scattering detector (ELSD). Methods: The HALO column was packed with a core-shell C18stationary phase (4.6 mm×150 mm, 2.7 mm). A solvent gradient elution was performed with nonafluoropentanoic acid-heptafluorobutyric acid containing trifluoroacetic acid as mobile phase A and methanol as mobile phase B. The temperature of the drift tube in ELSD was set at 40℃ and the flow rate of carrier gas was 3.0 L/min. Results: There was a good linear relationship between the logarithm of the peak area and logarithm of the mass of each separated amino acid. The limits of detection for the underivatized amino acids were from 20 ng to 50 ng. The average recoveries of the 20 amino acids were between 89.0%and 111.2%. Conclusion: This method is simple, rapid and accurate for the determination of underivatized amino acids and can be widely used for the determination of underivatized amino acids in pharmaceutical, food, animal feeds and chemical industries.

reversed-phase high performance liquid chromatography（RP-HPLC); evaporative light-scatting detection(ELSD); core-shell stationary phase column; underivatized amino acids

R927.2; O657

A

1006-1533(2015)11-0075-05

科技部中小企業(yè)創(chuàng)新基金-核殼型色譜填料及色譜柱的產(chǎn)業(yè)化（12C26213202212）

**

閻超，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事微分離分析和電色譜分離領(lǐng)域的研究。E-mail：chaoyan@ unimicrotech.com

2015-04-08）