袁中華， 譚艷美， 陶 媛， 汪江波， 郭東銘， 王 佐， 唐朝克， 田國平，2△

(南華大學(xué)1心血管病研究所，動脈硬化學(xué)湖南省重點實驗室，2附屬第二醫(yī)院，湖南 衡陽421001)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是心腦血管疾病形成的主要原因之一，關(guān)于其發(fā)病機(jī)制的研究目前主要集中在脂質(zhì)侵潤學(xué)說和損傷反應(yīng)學(xué)說。1999年，Ross［1］在損傷反應(yīng)學(xué)說基礎(chǔ)上明確提出As是一類由炎癥引起的疾病，它是具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過程，其發(fā)展的全過程始終伴隨著炎癥反應(yīng)。

脂肪分化相關(guān)蛋白(adipose differentiation-related protein，adipophilin)，是脂滴周圍蛋白PAT家族的成員之一。Jiang等［2］在1992年利用差別雜交篩選技術(shù)在脂肪細(xì)胞中分離提取到adipophilin這種蛋白，在之后的研究中發(fā)現(xiàn)它與脂肪代謝有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，adipophlin不僅可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積，加速As的發(fā)生發(fā)展，而且近期也有研究表明，adipophilin還可影響炎癥因子白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)［3］，但其具體機(jī)制并未闡明。此外，adipophlin可通過活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)影響細(xì)胞中脂質(zhì)蓄積［4］，外界刺激激活ERK1/2磷酸化后，會引起核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)的活化［5］，而 AP-1 與炎癥反應(yīng)和組織損傷也密切相關(guān)。因此，本實驗以此為切入點，探討adipophilin影響炎癥因子表達(dá)的具體機(jī)制，以及在這個過程中ERK1/2和AP-1所發(fā)揮的可能作用。

材料和方法

1 材料與試劑

RAW264.7細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫;DMEM高糖培養(yǎng)基購于Gibco;小牛血清購于杭州四季春生物科技公司;IL-6、TNF-α和MCP-1酶聯(lián)免疫分析試劑盒購于XS;無內(nèi)毒素質(zhì)粒小劑量快速提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量快速提取試劑盒購于Omega;預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和EcoRⅠ、NotⅠ、BamHⅠ、HindⅢ內(nèi)切酶購于 BioLabs;PD98059和curcumin購于Promega;鼠抗人IL-6、MCP-1、TNF-α、ERK1/2、p-ERK1/2、AP-1 和 p-AP-1的I抗購于 ABZOOM;β-actin的 I抗購于 Proteintech，其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。主要儀器有Labconco的單蒸水機(jī)和去離子水機(jī);Labnet的PCR儀;Nikon的倒置式生物顯微鏡(UX620H);Eppendorf的臺式多功能高速冷凍離心機(jī)(5804R型);Bio-Tek的酶標(biāo)儀(ELx800型)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組

在10%小牛血清的高糖培養(yǎng)基中放入PA317細(xì)胞，并在10%小牛血清的高糖培養(yǎng)基中放入RAW264.7細(xì)胞，放置在濕度為95%，溫度為37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。再加入10 mmol/L的HEPES于培養(yǎng)液中。細(xì)胞貼壁達(dá)90%時傳代。傳代時棄去培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化后，加5 mL血清培養(yǎng)液，每24～72 h傳代1次。

本實驗共分5組:對照(control，Con)組，未經(jīng)處理的RAW264.7細(xì)胞;表達(dá)對照(Adi-Con)組，感染pQCXIP包裝病毒的 RAW264.7細(xì)胞;高表達(dá) adipophilin(Adi)組，感染pQCXIP-HA-Adi包裝病毒的RAW264.7細(xì)胞;siRNA對照(siRNA-Con)組，感染pSUPER-retro-scramble-siRNA包裝病毒的RAW264.7細(xì)胞;adipophilin siRNA(Adi siRNA)組，感染 pSUPER-retro-Adi-siRNA包裝病毒的RAW264.7細(xì)胞。

3 方法

3.1 pQCXIP-HA-Adi和 pSUPER-retro-Adi-siRNA 表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、鑒定和提取 根據(jù)分子克隆中CaCl2法制備DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用本課題組袁中華教授已構(gòu)建成功的 PQCXIP、PQCXIP-HA-Adi、pSUPER-scramble-siRNA和pSUPER-Adi-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，分別加入預(yù)冷的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，震蕩混勻，利用 E.Z.N.A.?Endo-free Plasmid Mini Kit II進(jìn)行質(zhì)粒提取，對提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切(EcoRⅠ或NotⅠ)鑒定，使用 E.Z.N.A.?FastFilter Plasmid Maxi Kit對已鑒定的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。

3.2 轉(zhuǎn)染 pQCXIP-HA-Adi和 pSUPER-retro-AdisiRNA入PA317包裝細(xì)胞以及重組DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒液的收集 轉(zhuǎn)染的前1 d將PA317包裝細(xì)胞系按照每孔4×105接種在6孔板中，次日細(xì)胞轉(zhuǎn)染時可達(dá)到95%匯片。將pQCXIP和pQCXIP-HA-Adi用無血清高糖培養(yǎng)基和Attractene稀釋，并與DNA稀釋液混勻，室溫下孵育。然后，用無血清的培養(yǎng)基漂洗PA317細(xì)胞，每孔的包裝細(xì)胞上再加入Attractene/DNA混合物，混勻，室溫下10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后用嘌呤霉素篩選，每2～3 d換1次培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)3～4周，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并持續(xù)表達(dá)adipophilin的抗性克隆，將細(xì)胞克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)移和擴(kuò)增，收集含有病毒的培養(yǎng)液。

3.3 病毒感染RAW264.7細(xì)胞 將PA317細(xì)胞以每孔4×104細(xì)胞接種在24孔板中，次日將嘌呤霉素按不同濃度加入各孔中，每隔2～3 d換液1次，保持嘌呤霉素濃度不變，觀察細(xì)胞。挑取嘌呤霉素的濃度為該培養(yǎng)的條件下細(xì)胞5 d內(nèi)的大量死亡，第14天時全部死亡的最低濃度，確定PA317細(xì)胞最佳嘌呤霉素篩選濃度。接著，將RAW264.7細(xì)胞按照4×105接種到6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜后分別以10－2、10－3、10－4倍稀釋 pQCXIP 和 pQCXIP-HA-Adi病毒上清，再加入嘌呤霉素終濃度為8 mg/L，混勻。將RAW264.7細(xì)胞中的培養(yǎng)基棄去，各孔中加入病毒稀釋液，每種病毒分2孔，感染至少6 h后，用含血清培養(yǎng)基逐步稀釋嘌呤霉素濃度，持續(xù)培養(yǎng)2周，可見陽性的細(xì)胞克隆生長。

3.4 蛋白免疫印跡分析 將所需細(xì)胞處理后，裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。利用蛋白定量試劑盒定量后。使蛋白變性，將10%SDS-PAGE膠每孔加入10 μL 樣本，110 V，40 min;之后切膠轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，200 mA，1 h;5%無抗脫脂奶粉封閉過夜。加入鼠源性I抗，置于空氣浴搖床4 h，辣根過氧化物酶標(biāo)記II抗置于空氣浴搖床50 min。暗室壓片，顯影。

3.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗 收集各組細(xì)胞上清液，用雙抗體夾心法測定MCP-1、TNF-α和IL-6細(xì)胞水平，用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加MCP-1、TNF-α和IL-6細(xì)胞上清液再與 HRP標(biāo)記的 MCP-1、TNF-α和 IL-6抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。按照說明書中方法計算，最后統(tǒng)計結(jié)果。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各實驗組均與對照組比較，采用t檢驗，由GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件完成，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Adipophilin對 IL-6、TNF-α和MCP-1表達(dá)的影響

與對照組(Con)相比，高表達(dá)adipophilin(Adi)組的IL-6、TNF-α和 MCP-1濃度明顯升高，差別顯著;低表達(dá) adipophilin(Adi-siRNA)組的 IL-6、TNF-α和MCP-1濃度明顯降低，差別顯著;而表達(dá)對照(Adi-Con)組和siRNA對照(siRNA-Con)組的IL-6、TNF-α和MCP-1濃度沒有明顯變化，見圖1。

Figure 1.The effects of adipophilin(Adi)on the concentrations of IL-6，TNF-α and MCP-1.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control(Con)group.圖1 Adipophilin對 IL-6、TNF-α和MCP-1濃度的影響

2 Adipophilin對AP-1蛋白活性的影響

與Con組相比，Adi組的p-AP-1占其總蛋白的比值明顯增高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義，表明被活化的AP-1增加。Adi-siRNA組的p-AP-1占其總蛋白的比值明顯下調(diào)，表明AP-1的活性被抑制。而Adi-Con組和siRNA-Con組p-AP-1占其總蛋白的比值沒有明顯變化，見圖2。

3 Adipophilin對ERK1/2蛋白活性的影響

與Con組相比，Adi組p-ERK1/2占其總蛋白的比值增高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義，表明被活化的ERK1/2增加;Adi-siRNA組p-ERK1/2占其總蛋白的比值下調(diào)，而Adi-Con組和siRNA-Con組沒有明顯變化，見圖3。

4 ERK1/2抑制劑對adipophilin和AP-1蛋白水平的影響

將各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞約鋪滿95%以上，加入50 μmol/L ERK1/2阻斷劑PD98059孵育2 h，收集各組細(xì)胞提取總蛋白，Western blot檢測ERK1/2、p-ERK1/2、AP-1、p-AP-1 和 adipophilin 的蛋白水平。統(tǒng)計結(jié)果表明，用PD98059處理后，與Con組相比，其它各組中adipophilin蛋白表達(dá)均增高;Adi組和Adi-siRNA組的p-ERK1/2和p-AP-1占其總蛋白的比值下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義;而p-ERK1/2和p-AP-1占其總蛋白的比值在Adi-Con組和siRNA-Con組沒有明顯變化，見圖4。

Figure 2.The effects of adipophilin(Adi)on the protein levels of AP-1 and p-AP-1.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control(Con)group.圖2 Adipophilin對AP-1及p-AP-1蛋白水平的影響

5 AP-1抑制劑對adipophilin、ERK1/2及炎癥因子表達(dá)的影響

將各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞約鋪滿95%以上，加入20 μmol/L AP-1阻斷劑curcumin孵育2 h，提取各組總蛋白并收集細(xì)胞上清液。Western blot檢測adipophilin、AP-1、p-AP-1、ERK1/2 和 p-ERK1/2 的蛋白水平，ELISA方法檢測炎癥因子在上清液的濃度變化。Western blot結(jié)果表明，p-AP-1占其總蛋白的比值在各組中均降低。與Con組相比，adipophilin和p-ERK1/2蛋白在Adi組中表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其它蛋白變化不明顯。ELISA結(jié)果顯示，與Con組相比，IL-6、TNF-α 和 MCP-1的濃度在 Adi組和Adi-siRNA組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;Adi-Con組和siRNA-Con組無明顯變化，但與未加入AP-1抑制劑相比，加入AP-1抑制劑各組中炎癥因子濃度明顯降低，見圖5、6。

討 論

Adipophilin是一種不完全包被蛋白，在正常的狀態(tài)下，它主要位于細(xì)胞內(nèi)的新生脂滴周圍，在許多細(xì)胞株上都有表達(dá)，但在組織水平只在少數(shù)細(xì)胞有表達(dá)。國內(nèi)外研究證明，adipophilin與泡沫細(xì)胞的形成密切相關(guān)［6－7］，且在 As發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其具體機(jī)制還不是很明確。

Figure 3.The effects of adipophilin(Adi)on the protein levels of ERK1/2 and p-ERK1/2.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control(Con)group.圖3 Adipophilin對 ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平的影響

ERK1/2是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中重要的一員，主要被各種生長因子、離子射線、過氧化氫等磷酸化而激活，進(jìn)入細(xì)胞核作用于c-Jun、NF-κB和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)某些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，與細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)。此外，新近研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2還介導(dǎo)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。ERK1/2是MAPK家族中一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有研究顯示ERK1/2與動脈粥樣硬化密切相關(guān)［8］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在RAW264.7細(xì)胞中，氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein，oxLDL)以時間依賴方式活化ERK1/2，并調(diào)控了adipophilin表達(dá)，且與細(xì)胞中脂質(zhì)蓄積相關(guān)［4］，在巨噬細(xì)胞中，oxLDL誘導(dǎo) ERK1/2磷酸化［9］，使單核巨噬細(xì)胞黏附到內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)展［10］。

Figure 4.The effects of ERK1/2 inhibitor on the protein levels of adipophilin(Adi)，AP-1 and ERK1/2.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control(Con)group.圖4 ERK1/2抑制劑對adipophilin、AP-1和ERK1/2蛋白水平的影響

Figure 5.The effects of AP-1 inhibitor on the protein levels of adipophilin(Adi)，AP-1 and ERK1/2.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control(Con)group.圖5 AP-1抑制劑對adipophilin、AP-1和ERK1/2的蛋白水平的影響

Figure 6.The effects of AP-1 inhibitor on the concentrations of IL-6，TNF-α and MCP-1.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control(Con)group.圖6 AP-1抑制劑對IL-6、TNF-α和MCP-1濃度的影響

AP-1是一類重要的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，是由c-Jun和c-Fos組成的異源二聚體，正常情況下無活性或活性很低，可被各種刺激激活，它的活性失調(diào)與炎癥、腫瘤等多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。AP-1是ERK1/2重要下游靶信號分子，外界刺激激活ERK1/2磷酸化常常導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-κB等活化。

近年來，有關(guān)As炎癥反應(yīng)機(jī)制的研究日漸增多，本課題組前期的研究多集中于adipophilin在As脂質(zhì)蓄積中的作用，然而，Chen等［3］研究發(fā)現(xiàn)，在THP-1巨噬細(xì)胞中adipophilin可增加炎癥因子表達(dá)，這一現(xiàn)象為我們提供了一個新的研究方向，因此本實驗即致力于研究adipophilin影響炎癥因子表達(dá)的機(jī)制。

為了進(jìn)一步驗證Chen等的實驗結(jié)果，我們首先構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)和沉默adipophilin的RAW264.7細(xì)胞株，觀察了不同adipophilin表達(dá)狀態(tài)下細(xì)胞中炎癥因子的變化。實驗結(jié)果表明，在RAW264.7細(xì)胞中，隨著 adipophilin的表達(dá)上調(diào)炎癥因子 IL-6、TNF-α和MCP-1的濃度明顯上升，尤其是TNF-α上調(diào)更明顯;而沉默adipophilin使IL-6、TNF-α和MCP-1的濃度明顯下降。說明adipophilin可以影響炎癥因子IL-6、TNF-α和 MCP-1表達(dá)，與Chen等的實驗結(jié)果相吻合。但adipophilin是通過什么途徑影響炎癥因子IL-6、TNF-α和MCP-1表達(dá)，這其中的機(jī)制我們還不清楚。

ERK1/2在動脈粥樣硬化中具有重要的作用，有研究表明許多促炎基因表達(dá)都受到ERK1/2的調(diào)節(jié)。Liu等［4］也已證實，在巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積中，ERK1/2和adipophilin有關(guān)。此外，AP-1是ERK1/2重要下游靶分子，p-ERK1/2可活化AP-1，在人體主動脈平滑肌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子AP-1經(jīng)ERK1/2激活，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)［5］。有報道顯示［11］，oxLDL、乙?；兔芏戎鞍椎韧饨缫蛩氐拇碳ぜせ盍薓APK，MAPK的激活促使轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、AP-1、P53等的活化并加重了炎癥反應(yīng)。這些證據(jù)顯示，ERK1/2調(diào)控 adipophilin表達(dá)，而 ERK1/2可激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1進(jìn)一步調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)，我們推測adipophilin影響炎癥因子表達(dá)，可能是通過ERK1/2-AP-1途徑。

實驗結(jié)果提示，在 adipophilin表達(dá)增高時ERK1/2和AP-1兩者的活性形式 p-ERK1/2和p-AP-1的水平明顯增高，沉默adipophilin時p-ERK1/2和p-AP-1占其總蛋白的比值也明顯降低，說明ERK1/2和AP-1可以被adipophilin調(diào)控。參考文獻(xiàn)［12-14］，用ERK1/2抑制劑 PD98059的最佳使用濃度50 μmol/L預(yù)處理細(xì)胞2 h，p-ERK1/2及p-AP-1占其總蛋白的比值明顯下調(diào)，這可能是ERK1/2參與AP-1表達(dá)的調(diào)控。隨后用AP-1抑制劑curcumin(20 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞2 h，Adi組中 adipophilin 和p-ERK1/2蛋白水平增高，但p-AP-1占其總蛋白的比值明顯降低，此外我們還發(fā)現(xiàn)炎癥因子IL-6、TNF-α和MCP-1在細(xì)胞上清液的濃度明顯下調(diào)。這提示ERK1/2-AP-1途徑調(diào)節(jié)了炎癥因子表達(dá)。

已有的ERK1/2和AP-1的相關(guān)實驗顯示，激活ERK1/2、JNK、p38 MAPK 和 JAK-STAT信號，顯著增加了膀胱癌細(xì)胞中AP-1和ERK1/2的結(jié)合活性［15］。低鹽可通過促進(jìn)ERK1/2磷酸化、增加AP-1等信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)來實現(xiàn)細(xì)胞環(huán)氧化酶2的表達(dá)增加［16］。結(jié)合我們的實驗，可以認(rèn)為，adipophilin對炎癥因子影響，首先通過激活 ERK1/2，ERK1/2在轉(zhuǎn)錄水平活化AP-1，進(jìn)而調(diào)控炎癥因子的表達(dá)。本實驗結(jié)果為證實adipophilin在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到的作用提供了有力的實驗依據(jù)。

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