鄧偉民孫大林綜述 金保方審校

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)（江蘇南京 210046）；2. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合男科

睪丸支持細(xì)胞對精原干細(xì)胞作用因子研究進(jìn)展

鄧偉民1孫大林2綜述 金保方2審校

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)（江蘇南京 210046）；2. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合男科

輔助生殖技術(shù)的迅速發(fā)展，使得男性不育癥患者在治療上的困境得到了很大的改善，但是仍然有許多不育癥患者由于無精子癥等問題無法完全解決。精原干細(xì)胞（Spermatogonial Stem cells， SSCs）位于睪丸生精小管基底膜上，是體內(nèi)處于自然狀態(tài)條件下唯一可將遺傳信息傳至子代的干細(xì)胞。既能通過自我更新維持?jǐn)?shù)量的穩(wěn)定，也能通過基因或者信號的調(diào)節(jié)達(dá)到自我分化，最終產(chǎn)生精細(xì)胞。SSCs自我更新和分化之間的動態(tài)平衡，保證了雄性生命過程中持續(xù)進(jìn)行的精子發(fā)生，如果該平衡被破壞則有可能導(dǎo)致精子生成的障礙：過度增殖則導(dǎo)致生殖細(xì)胞瘤的產(chǎn)生，而過度分化則導(dǎo)致雄性的不育［1］。所以SSCs的廣泛研究為臨床上無精子癥的患者帶來希望，同時也為于少、弱、畸精子癥（OAT）患者的臨床治療帶來指導(dǎo)意義。

睪丸支持細(xì)胞（Sertoli Cells，SCs）是1865年被德國組織學(xué)家Entico Sertoli第一次發(fā)現(xiàn)的，并進(jìn)行了詳細(xì)描述，它是體細(xì)胞中唯一與生精細(xì)胞接觸的，具有獨特的形態(tài)結(jié)構(gòu)：在光鏡下細(xì)胞輪廓清晰，電鏡下呈上窄下寬的不規(guī)則錐體形，頂端可達(dá)生精小管管腔，基底部緊貼基膜，呈橢圓形或錐形的細(xì)胞核，也有的核呈分葉狀，核膜常皺縮，胞質(zhì)含量高，含有較多的細(xì)胞器以及大量的脂滴，并還有組織有序、功能十分活躍的骨架。相鄰SCs靠近基底膜處存在緊密連接，該緊密連接是參與形成睪丸血-睪屏障的一部分，借助它的封閉作用，能將生精小管分為近管腔的近腔室和近基底部的基底室。

現(xiàn)已證實，SCs主要作用是提供營養(yǎng)給各級生精細(xì)胞、參與并調(diào)控生精細(xì)胞自我更新和分化之間的穩(wěn)定，使精子能夠有序和持續(xù)的進(jìn)行發(fā)生。因此，SCs可以稱作是生精細(xì)胞的“保姆細(xì)胞”，在精子的生成過程中起著至關(guān)重要的作用，本文就SCs對SSCS的作用以及主要相關(guān)作用因子進(jìn)行綜述。

一、SCs與SSCs關(guān)系及對其作用

（一） SCs是包括SSCs在內(nèi)的各級生精細(xì)胞發(fā)育的支架

睪丸內(nèi)部生精小管主要由SCs和SSCs兩種細(xì)胞構(gòu)成， SSCs有很強(qiáng)的自我更新能力和較高的分化潛能，以及向子代傳遞遺傳信息的特殊功能。SSCs的自我更新和分化在SCs分泌的各種因子調(diào)控下有序而精確的進(jìn)行。SSCs以及處于分化前期的精原細(xì)胞位于基底室內(nèi)，處于分化后期的精母細(xì)胞則位于近腔室內(nèi)，精子成熟之后再從近腔室的頂端釋放進(jìn)入到管腔內(nèi)部。所以說，SCs是包括SSCs在內(nèi)的各級生精細(xì)胞發(fā)育的支架。而且，SCs所形成的獨特而封閉的局部微環(huán)境也是生精細(xì)胞進(jìn)行分化和更新活動的必需場所。

（二）SCs是SSCs特定發(fā)育環(huán)境的主要結(jié)構(gòu)和調(diào)控者

在哺乳動物睪丸內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)可以分為生精小管和管外間質(zhì)組織。生精小管由管腔和生精上皮構(gòu)成， SCs存在于生精上皮， 主要為精子生成提供特定微環(huán)境及免疫豁免環(huán)境。維持免疫豁免功能首先是SCs通過緊密連接，形成一層物理屏障，即血睪屏障（blood testis barrier，BTB）。BTB由相鄰支持細(xì)胞之間的緊密連接復(fù)合體在青春期開始形成，使生精小管內(nèi)形成特殊免疫豁免區(qū)域。為精子的產(chǎn)生提供不受機(jī)體免疫系統(tǒng)干擾的微環(huán)境。精子產(chǎn)生的過程中，在細(xì)胞黏附和運(yùn)動中構(gòu)成緊密連接的蛋白質(zhì)分子參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這些分子的研究，有利于闡明生精過程中SCs緊密連接的重構(gòu)作用、促進(jìn)生精細(xì)胞發(fā)育以及精母細(xì)胞通過血-睪屏障的機(jī)制。

SSCs移植研究證明［2］，基底室是SSCs能進(jìn)行自身維持的唯一場所， 因此能推斷出基底室可能就是SSCs 的特定發(fā)育微環(huán)境，它由支持細(xì)胞及其連接、細(xì)胞外基質(zhì)、管周肌樣細(xì)胞、生精小管基膜等構(gòu)成。研究表明， 將野生型小鼠的SCs向不育小鼠的睪丸內(nèi)移植，使得不育小鼠重新可育，表明SCs在SSCs的維持、更新及分化等過程中具有不可替代的功能［3］。因此，SCs是SSCs 特定發(fā)育環(huán)境的主要結(jié)構(gòu)和調(diào)控者。

睪丸微環(huán)境主要包括各種調(diào)控精原干細(xì)胞的增殖和分化因子，如由支持細(xì)胞分泌的GDNF、FGF2等， 間質(zhì)細(xì)胞分泌的CSF1、睪酮等， 以及血液及周圍體液含有的Neuregulin 1、Activin A、BMP4和SOHLH等因子。同時，也標(biāo)明了精原干細(xì)胞及其相鄰細(xì)胞的相對位置， 如支持細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞等形成的基底室結(jié)構(gòu)，見圖1。

圖1 簡潔地表示了SCCs與SCs以及睪丸微環(huán)境間的關(guān)系

二、SCs產(chǎn)生的調(diào)節(jié)SSCs 發(fā)育的主要因子

（一）膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長因子

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）是由SCs分泌的，屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）家族的中的一個亞族，是含有134個氨基酸殘基的糖基化二硫鍵結(jié)合的同源二聚體蛋白。SSCs 表達(dá)的GDNF 受體復(fù)合物包括GDNF家族受體α1（GDNF family receptor alpha1，GFRα1）和酪氨酸激酶Ret受體。在SSCs、神經(jīng)干細(xì)胞等多種細(xì)胞的發(fā)育、分化，GDNF均有調(diào)節(jié)作用并貫穿個體的整個生命過程［4］。已有報道證實GDNF 信號途徑對SSCs 自我更新和分化之間的作用是決定性的［5］。敲除GDNF 的基因小鼠可以存活，但小鼠的SSCs 卻會逐漸地消失。相反， GDNF 表達(dá)過多則會因未分化精原細(xì)胞數(shù)量增多而導(dǎo)致生殖細(xì)胞瘤。

在人幼年和成年的睪丸中，GDNF 于SCs、Leydig 細(xì)胞、精母、精子細(xì)胞以及一些微小動脈血管壁的平滑肌表達(dá)。GDNF 的表達(dá)不僅受到成纖維細(xì)胞生長因子2（fi broblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和人白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等物質(zhì)的調(diào)控外，還受到卵泡刺激素（ follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH） 的調(diào)控。所以，GDNF 的表達(dá)受到整體和局部的雙重調(diào)控［5］。GDNF 主要通過三方面調(diào)控SSCs［6］：（1）GDNF可參與精子發(fā)生過程，GDNF還參與調(diào)控SSCs 增殖和分化的旁分泌。小劑量的GDNF 會導(dǎo)致SSCs 過度分化和損耗； 而大劑量的GDNF則會促進(jìn)SSCs 的增殖而抑制其分化。（2） GDNF參與睪丸的發(fā)育，SCs分泌GDNF，并以自分泌方式促進(jìn)SCs的成熟和分裂，從而促進(jìn)睪丸發(fā)育。（3）GDNF 促進(jìn)血睪屏障的形成，用以構(gòu)成SSCs的微環(huán)境。管周肌樣細(xì)胞分泌GDNF，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)GDNF 的受體GFRα1（GDNF family receptor alpha1，GFRα1） ，GDNF 作用于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的方式是旁分泌，既促進(jìn)其增殖，又可以形成細(xì)胞間的緊密連接，是通過促進(jìn)毛細(xì)血管內(nèi)皮達(dá)到的［7］。

（二）干細(xì)胞因子

干細(xì)胞因子（stem cell factor， SCF）是SCs的分泌產(chǎn)物之一，是原癌基因c-Kit受體的配體［8］。c-Kit受體蛋白是酪氨酸激酶的受體之一。將自然生長型的生殖細(xì)胞移植到Steel/Steeldickie小鼠睪丸中仍然可以形成集落，但其并不能更進(jìn)一步分化，這表明SCF與c-Kit結(jié)合對于維持精原細(xì)胞的分化是必不可少的，出生后的個體精原細(xì)胞的增殖、分化中也同樣受到SCF/ c-KIT系統(tǒng)調(diào)控。在小鼠精原細(xì)胞群體中，c-KIT受體表達(dá)于正在分化中的精原細(xì)胞，而未分化型精原細(xì)胞和SSCs 中卻不表達(dá)或很少表達(dá)［9］。同時更多資料表明，SCF /c-Kit 系統(tǒng)可以通過不同的途徑調(diào)節(jié)SSCs的自我更新和增殖： 通過使拉巴霉素敏感的PI3K → AKT→ mTOR → p70S6K → CyclinD3 → cdk4，cdk6 →Rb 發(fā)生磷酸化，SCF /c-Kit 系統(tǒng)使c-Kit陽性SSCs 從G1 期向S 期過渡，若阻斷PI3K與c-Kit 結(jié)合，可導(dǎo)致精子生成障礙，造成男性不育。研究發(fā)現(xiàn)MEK通路也可調(diào)控生精過程，SCF /c-Kit 系統(tǒng)激活MEK→Erk1 /2→CyclinE，CyclinA2→cdk2→拮抗Rb 磷酸化，控制生精過程的進(jìn)程，使用U0126可以阻斷MEK 通路，導(dǎo)致SCF 誘導(dǎo)的促有絲分裂過程的中斷［10］。

（三）轉(zhuǎn)錄因子Ets 差異基因5

轉(zhuǎn)錄因子Ets 差異基因5（Ets variant gene 5，Etv5）是由Sertoli 細(xì)胞分泌的一種轉(zhuǎn)錄因子，是ETS家族的一個成員，而ETS家庭是一個大型轉(zhuǎn)錄基因家庭，他們在細(xì)胞生理學(xué)上的不同方面發(fā)揮作用：包括細(xì)胞遷移、增殖、分化、凋亡和癌變細(xì)胞相互作用［11］。ETV5在未成年和成年人體內(nèi)組織內(nèi)有著廣泛的影響［12］，包括睪丸和卵巢［13，14］。在老鼠和人類細(xì)胞中，ETV5定位的區(qū)域在精原干細(xì)胞和支持細(xì)胞［15］。小鼠模型研究表明，ETV5是男女生育必不可少的基因［16］，破壞小鼠Etv5 基因，可導(dǎo)致SSCs 缺失，造成唯支持細(xì)胞綜合征（SCOS）和無精子癥。運(yùn)用微陣列分析法，同野生型（WT）小鼠相比較，Etv5（Etv5-/-）敲除的小鼠，幾種趨化因子表達(dá)量和原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells，PGCs）的遷移明顯減少［17］。Chen 等［12］運(yùn)用微陣列分析Etv5 缺失小鼠的原始SCs，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞龕（niche）的一些保守因子發(fā)生改變，基質(zhì)細(xì)胞源性因子12（stromal cellderived factor12，Cxcl12）、Cxcl15 等趨化因子大量減少，這些趨化因子可能是調(diào)控SSCs 自我更新的信號分子。Morrow等研究表明［18］，Etv5 基因的缺失，可能通過影響SCs的功能，進(jìn)而造成SSCs 缺失，其作用機(jī)制可能是通過降低突變鼠claudin5 蛋白水平，進(jìn)而導(dǎo)致血睪屏障的損傷。

（四）骨形態(tài)發(fā)生蛋白4

骨形態(tài)發(fā)生蛋白4 （bone morphogenetic protein-4，Bmp4），是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）家族中不可或缺的一員，多種細(xì)胞的增殖和分化在胚胎發(fā)育時期均受到其調(diào)控作用，又因其能在異位誘導(dǎo)骨和軟骨的形成而得名［19］。Bmp4基因敲除的小鼠會導(dǎo)致中胚層發(fā)育缺陷而引起胚胎性死亡。通常由細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad介導(dǎo)Bmp4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Bmp4通過絲氨酸/蘇氨酸激酶受體（TβR II）結(jié)合后，再與TβR-I受體相結(jié)合形成復(fù)合物。

Carlomaqno等［20］發(fā)現(xiàn)Bmp4可促進(jìn)大鼠SSCs的分化，并能改變細(xì)胞粘附特性。據(jù)報道，雄性小鼠的Bmp4由SCs產(chǎn)生，有調(diào)控精原細(xì)胞的分化的作用，可能是通過c-Kit基因的表達(dá)實現(xiàn)的［21］。小鼠中除精子細(xì)胞不表達(dá)外，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和支持細(xì)胞均表達(dá)Bmp4；是因為受體在精細(xì)胞中表達(dá)，而在精母和精子細(xì)胞中不表達(dá)。李毅、郝晶等實驗［22］，使用添加Bmp4的培養(yǎng)基培養(yǎng)SSCs，通過提高Bmp4的濃度達(dá)到激活Bmp4/Smad信號通路，促進(jìn)細(xì)胞分化。提出了Bmp4/Smad信號通路可能是通過上調(diào)靶基因sohlh2的活性來激活并促進(jìn)小鼠SSCs的分化。

（五）染色質(zhì)修飾獨立基因Sin3A

哺乳動物體內(nèi)SIN3蛋白復(fù)合物在基因表達(dá)的過程中執(zhí)行多種功能，如：影響核小體重塑，并介導(dǎo)DNA損傷修復(fù)和復(fù)制時間等。而其中的Sin3A（Chromatin modifi er Swi-independent 3a，Sin3A）連同相關(guān)的組蛋白去乙?；?，影響細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子在發(fā)育和分化過程中的表達(dá)，Sin3A是維護(hù)大量內(nèi)細(xì)胞所必不可少的，如小鼠囊胚細(xì)胞，胚胎成纖維細(xì)胞，成肌細(xì)胞等。在有絲分裂中Sin3A基因特異性敲除的SCs可以支持精子發(fā)生的早期階段，但在分化期，這種細(xì)胞是無法引導(dǎo)單倍體的精子細(xì)胞的伸長過程。

Payne等［23］，在SCs胚胎期基因敲除Sin3A， Sin3A特異性缺失的SCs導(dǎo)致出生后一些未分化精原細(xì)胞的形成，同時維持最初的分化狀態(tài)。在早期，突變體睪丸的SSCs逐漸喪失分化能力，精細(xì)胞生長被限制，同時伴隨著大量的生殖細(xì)胞衰退。損失Sin3A基因的小鼠會導(dǎo)致SCOS的表型，Miyamoto等的研究［24］，通過編碼區(qū)基因分析80例Sin3A缺失日本患者，缺乏Sin3A會導(dǎo)致SCOS造成人類無精子癥。這些結(jié)果表明，Sin3A的缺失以一個特定的方式損害SCs的分子行為，影響了雄性動物睪丸微環(huán)境，進(jìn)而導(dǎo)致SSCs的生成障礙。導(dǎo)致Sin3A的缺失引發(fā)DNA損傷的機(jī)制目前未知。目前的研究顯示［25］，一個哺乳動物完整的SIN3復(fù)合蛋白需要適當(dāng)?shù)谋坶g異染色質(zhì)化，Sin3A缺失可能與Sds3蛋白導(dǎo)致染色體分離現(xiàn)象相關(guān)，這可能是導(dǎo)致染色體破損的機(jī)制。

（六）CXCL12/CX4R系統(tǒng)

CXCL12是由睪丸支持細(xì)胞分泌并表達(dá)的基因編碼的一種趨化因子，與CXCR4受體相結(jié)合并參與精原干細(xì)胞自我更新和維持的調(diào)控。CXCR4的還原作用，是在未分化的小鼠精原細(xì)胞的培養(yǎng)中，通過CXCR4特異性抑制劑和 CXCL12抗體阻斷劑，導(dǎo)致了SSCs的死亡，而CXCR4通路的抑制作用，是通過在成年小鼠睪丸中注射CXCR4特異性抑制劑，破壞了SSCs的自我維持，導(dǎo)致了生殖細(xì)胞的損失。GDNF和FGF2都可以調(diào)節(jié)CXCR4 的mRNA在thy1c SSCs培養(yǎng)上的表達(dá)。運(yùn)用微陣列基因分析顯示，CXCL12/ CXCR4通路的中斷導(dǎo)致的FGF-2數(shù)量顯著降低［26］，這表明CXCL12，F(xiàn)GF-2和GNDF形成對SSCs自我更新影響的合作網(wǎng)絡(luò)。此外，CXCR4還參與胚胎發(fā)育階段原始生殖細(xì)胞歸巢和出生后SSCs在睪丸微環(huán)境的種系回歸［6］。SCs中Sin3A特異性缺失導(dǎo)致結(jié)構(gòu)上一些未分化的精原細(xì)胞的形成。趨化因子CXCL12及其受體CXCR4在新生期睪丸特異性缺失sin3a的SCs中未被檢測到［23］，表明CXCL12/CXCR4的系統(tǒng)影響SSCs微環(huán)境的建立，進(jìn)而影響SSCs。

（七）其他因子

除以上因子外SCs還分泌許多因子影響精原干細(xì)胞，如白細(xì)胞介素IL-1α、IL-6，集落刺激因子CSF-1，胰島素樣生長因子IGF-1，表皮生長因子EGF，生長因子FGF-2等等。如圖1所示GDNF、FGF-2、EGF、CSF-1 以及IGF-1 是構(gòu)成精原干細(xì)胞微環(huán)境的主要細(xì)胞因子，它們共同調(diào)節(jié)并控制精原干細(xì)胞的生存的能力。

三、小結(jié)與展望

在睪丸成體細(xì)胞中，SCs對SSCs的影響最大，SCs為包括SSCs在內(nèi)的各級生精細(xì)胞提供了發(fā)育的外部支架之外，還為其中的生精細(xì)胞提供了生長發(fā)育的微環(huán)境。作為“保姆細(xì)胞”的SCs通過分泌各類因子及物質(zhì)對SSCs的自我更新和分化進(jìn)行精確的調(diào)節(jié)，同時為SSCs提供了特殊的免疫豁免環(huán)境。SCs還能通過調(diào)控其他成體細(xì)胞，從而間接影響SSCs的功能，在精子發(fā)生中發(fā)揮著無可替代的作用。

SSCs 的研究也是近年來的熱點和重點，現(xiàn)如今人的SSCs 的體外培養(yǎng)體系已經(jīng)建立［2］，解決了人SSCs 體外繁殖的問題。最近研究表明［27］，小鼠的組織體外培養(yǎng)可以支持精子的發(fā)生，但是通過體外的一些研究只能說明GDNF 在調(diào)控精子發(fā)生過程中起到很重要的作用，也就是說，在體外FGF-2，IL，IGF-I，EGF，CSF-1 等對于SSCs的作用需要進(jìn)一步的研究。研究人員對SSCs微環(huán)境定位的主要困難是SSCs的數(shù)量稀少，并且缺少特異性分子標(biāo)記，所以尋找SSCs特異性生物標(biāo)志物和建立可靠的分選方法依然是SSCs 的重要研究方向之一。所以，建立一個安全有效的能將人類SSCs 誘導(dǎo)成精子的體外誘導(dǎo)體系并大量運(yùn)用于臨床實踐，是實現(xiàn)SSCs 在人類輔助生殖上應(yīng)用迫切需要解決的問題。

致謝：本文受國家自然科學(xué)基金（81273760；81473678）；國家自然科學(xué)基金青年基金（81403402；81302969）基金項目資助

不育，男性； 精原干細(xì)胞； 塞爾托利細(xì)胞

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（2015-09-18收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.12.017

R 698.2