徐明　楊利民　王秋泉

摘 要 提出并發(fā)展了一種基于電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）的雙元素標(biāo)簽標(biāo)記策略來(lái)選擇性識(shí)別和檢測(cè)硒蛋白/多肽，其中內(nèi)源元素硒（Se）作為硒蛋白/多肽分子的識(shí)別元素，外源元素汞（Hg）作為硒蛋白/多肽和含硒蛋白/多肽分子的區(qū)分元素。通過(guò)對(duì)硒代半胱氨酸（SeCys）和谷胱甘肽過(guò)氧化酶1（GPx1）兩種模型分子的研究，外源鄰羧基苯硫甲基汞（CH3Hg-THI）動(dòng)態(tài)解離的CH3Hg+能夠選擇性標(biāo)記硒代半胱氨酸殘基（SeCys）中硒醇基（-SeH），但不能標(biāo)記含硒蛋白/多肽分子的硒代蛋氨酸殘基（SeMet）中的—SeCH3，進(jìn)而依據(jù)Se和Hg的ICP-MS信號(hào)識(shí)別和檢測(cè)硒蛋白/多肽。本方法應(yīng)用于富硒酵母水溶性提取液的分析，結(jié)果表明，提取液中的硒蛋白/多肽能夠被有效識(shí)別和檢測(cè)，驗(yàn)證了Se-Hg雙元素標(biāo)簽標(biāo)記策略的發(fā)展是ICP-MS識(shí)別和檢測(cè)硒蛋白/多肽的一種可行且優(yōu)越的途徑。

關(guān)鍵詞 硒； 汞； 硒蛋白/多肽； 電感耦合等離子體質(zhì)譜

1 引 言

以內(nèi)源元素分析蛋白質(zhì)已有很長(zhǎng)的歷史，130年前發(fā)明的凱氏定氮法（Kjeldahl method）就是利用檢測(cè)蛋白質(zhì)內(nèi)源元素氮進(jìn)行蛋白質(zhì)分析的經(jīng)典范例[1]。近二十年來(lái)，隨著生命科學(xué)和分析技術(shù)的快速發(fā)展，針對(duì)生物分子（如蛋白質(zhì)和多肽）的新元素標(biāo)簽標(biāo)記研究策略和方法不斷涌現(xiàn)，而且還在快速發(fā)展進(jìn)程中[2]。具有優(yōu)異的元素分析能力（高的靈敏度和選擇性）的電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）與元素標(biāo)簽策略的有機(jī)結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物體系中低豐度蛋白質(zhì)和多肽等生物分子的分析[3～5]。除了內(nèi)源元素標(biāo)簽，通過(guò)人為標(biāo)記外源元素標(biāo)簽（如鑭系元素、Hg、Au等）的研究策略因可以進(jìn)一步擴(kuò)展研究范圍和彌補(bǔ)內(nèi)源元素標(biāo)簽的不足，越來(lái)越受到重視[6～14]。但是，因?yàn)獒槍?duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)/多肽如何建立起內(nèi)源元素標(biāo)簽和外源標(biāo)記元素間的關(guān)系還有一定困難，目前報(bào)道的研究方法還多集中于單一利用內(nèi)源或外源元素，同時(shí)利用兩類元素標(biāo)簽的研究工作還鮮有報(bào)道。內(nèi)源和外源雙元素標(biāo)記識(shí)別策略的建立，需要滿足以下要求：（1）目標(biāo)生物分子需要含有內(nèi)源性共價(jià)結(jié)合的標(biāo)簽元素；（2）目標(biāo)生物分子能夠被外源性元素標(biāo)簽有效標(biāo)記，并且所標(biāo)記的外源元素標(biāo)簽與內(nèi)源標(biāo)簽元素應(yīng)發(fā)揮各自的識(shí)別、區(qū)分和檢測(cè)功能；（3）內(nèi)源和外源性元素標(biāo)簽?zāi)軌蛲瑫r(shí)有效地被ICP-MS識(shí)別和檢測(cè)。

在本課題組以前的研究工作中，不但利用內(nèi)源元素硒（Se）定量地研究了人血漿中的硒蛋白，而且利用外源元素汞（Hg）標(biāo)簽對(duì)多種蛋白和多肽分子實(shí)現(xiàn)選擇性的標(biāo)記和定量分析[14～19]。Se和Hg是一對(duì)典型的在生物體中會(huì)產(chǎn)生拮抗效應(yīng)的元素，并形成特定的硒汞化合物[20～22]。作為一類重要的生物分子，硒蛋白/多肽中Se以硒醇（—SeH）的形式存在于硒代半胱氨酸殘基中，這為外源的Hg標(biāo)簽提供了一個(gè)理想的標(biāo)記位點(diǎn)。利用這兩種元素作為內(nèi)源和外源元素標(biāo)簽識(shí)別和檢測(cè)硒蛋白/多肽在理論上是可行的。本研究探討了利用外源Hg標(biāo)簽標(biāo)記硒蛋白/多肽的可能性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)Se-Hg雙元素標(biāo)記選擇性識(shí)別和檢測(cè)硒蛋白/多肽的目的。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

液相色譜-電噴霧質(zhì)譜（Esquire LC/ESI-IT-MS，德國(guó)布魯克公司）；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Microflex LRF MALDI-TOF-MS，德國(guó)布魯克公司）；SERIES 200液相色譜-ELAN DRC II電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS，鉑金埃爾默公司）。為了消除16O2+對(duì)32S+的干擾，在測(cè)定S時(shí)使用O2（99.999%，北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司）將S在動(dòng)態(tài)反應(yīng)池中氧化為SO（0.6 mL/min O2；RPQ 0.45），檢測(cè)32S16O+測(cè)定S的含量；監(jiān)測(cè)82Se+和202Hg+用于Se和Hg的測(cè)定。

硒代胱氨酸（Seleno-DL-cystine， （SeCys）2），硒代蛋氨酸（L-Selenomethionine， SeMet），二硫蘇糖醇（Dithiol dithiothreitol， DTT），鄰羧基苯硫酚（Thiosalicylic acid， HOOCC6H4SH），2，5-二羥基苯甲酸（2，5-Dihydroxybenzoic acid）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1（Glutathione peroxidase 1， GPx1）均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；氯化甲基汞（Methylmercuric chloride， CH3HgCl，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）；富硒酵母（Sel-Plex，美國(guó)Alltech公司）；用于尺寸排阻色譜的標(biāo)準(zhǔn)物Pyruvate kinase （237.0 kDa）， Bovine serum albumin （66.5 kDa）， Ovalbumin （44.3 kDa）， Lysozyme （14.3 kDa） 和 Cobalamin （1.4 kDa）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。其它試劑均為分析純以上的純度；高純水（18 MΩ cm，廈門大學(xué)薩本棟微機(jī)電中心）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 CH3Hg-THI標(biāo)記硒蛋白/多肽 將相同摩爾的氯化甲基汞（CH3HgCl）與鄰羧基苯硫酚（HOOCC6H4SH）混合反應(yīng)，獲得鄰羧基苯硫甲基汞CH3HgS-C6H4COOH（CH3Hg-THI， 4 mmol/L， pH 7.4），并于4℃保存。利用過(guò)量的二硫蘇糖醇（DTT）將硒代胱氨酸（10

還原為硒代半胱氨酸（SeCys）。CH3Hg-THI（4 mmol/L， 0.2 mL）標(biāo)記還原所得的SeCys。在緩沖溶液（20 mmol/L NH4COOCH3， pH 7.4）中37℃孵育1 h后，利用ESI-IT-MS進(jìn)行分析標(biāo)記產(chǎn)物。同時(shí)，作為對(duì)照，硒代蛋氨酸（SeMet）也按照上述過(guò)程進(jìn)行處理分析。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1（GPx1）溶于緩沖液（20 mmol/L NH4COOCH3， pH 7.4）作為儲(chǔ)備液，并保存于

分別與CH3HgCl和CH3Hg-THI（5 μL， 4 mmol/L）進(jìn)行反應(yīng)（37℃， 1 h）。反應(yīng)結(jié)束后，使用SEC/ICP-MS （尺寸排阻色譜柱，Superdex 75 10/300 GL（GE Healthcare）；流動(dòng)相： 5 mmol/L Tris + 100 mmol/L NH3HCO3， pH 7.4； 流速： 0.75 mL/min）和RPLC/ESI-MS VP-ODS C18反相色譜柱（日本Shimadzu公司）；流動(dòng)相A： H2O， 0.05% TFA； 流動(dòng)相B： Acetonitrile， 0.05% TFA； 流速： 150 μL/min； 洗脫梯度： 0～5 min， 1% B； 5～10 min， 1%～5% B； 10～20 min， 5%～10% B； 20～25 min， 10%～30% B； 25～40 min， 30% B）對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行分析。每?jī)纱畏治鲩g隔，利用1% DTT清洗色譜柱30 min。反應(yīng)產(chǎn)物同時(shí)利用MALDI-TOF-MS進(jìn)行分析。

2.2.2 富硒酵母水溶性提取液的制備和分析 使用5 mL PBS緩沖液（1.4 mmol/L NaCl， 0.27 mmol/L KCl， 1 mmol/L Na2HPO4， 0.18 mmol/L KH2PO4， pH 7.4）于4℃超聲萃取富硒酵母（0.5 g）5 min，于4℃以10000 r/min離心30 min 2次，收集上清液，得到富硒酵母水溶性提取液。于50 μL富硒酵母水溶性提取液樣品中加入CH3Hg-THI（5 μL， 4 mmol/L）進(jìn)行標(biāo)記。反應(yīng)產(chǎn)物使用PD minitrap G-10進(jìn)行脫鹽處理后，利用SEC/ICP-MS和RPLC/ICP-MS進(jìn)行檢測(cè)分析。ICP-MS測(cè)定（82Se+， 202Hg+和32S16O+）之前，串聯(lián)的UV檢測(cè)器（214 nm）對(duì)色譜流出物進(jìn)行檢測(cè)。3 結(jié)果與討論

3.1 雙元素標(biāo)記原理

如圖1a所示，在蛋白質(zhì)/多肽分子中，Se有兩種存在形式：硒代半胱氨酸（SeCys）和硒代蛋氨酸（SeMet），兩者與S的存在形式半胱氨酸（Cys）和蛋氨酸（Met）結(jié)構(gòu)相似。含有SeCys的蛋白/多肽被定義為硒蛋白/多肽，而含有SeMet的蛋白/多肽為含硒的蛋白/多肽，這兩類蛋白/多肽具有不同的生理功能[23]。硒蛋白/多肽的SeCys殘基中的-SeH可以與CH3Hg-THI動(dòng)態(tài)離解出的CH3Hg+反應(yīng)， 實(shí)現(xiàn)選擇性的Hg標(biāo)記；含有SeMet的含硒蛋白/多肽因Se以-SeCH3的形式存在而不能與Hg反應(yīng)（圖1b）。另一方面，硒醇基-SeH的pKa=5.2低于巰基（-SH）的pKa=8.5大約3個(gè)數(shù)量級(jí)； 相比于-SH，-SeH活性更高，更易與CH3Hg+反應(yīng)[24，25]。只有被ICP-MS同時(shí)檢測(cè)到Se和Hg的信號(hào)又在ESI-IT-MS上呈現(xiàn)Se和Hg的特征同位素分布的分子才被認(rèn)為是硒蛋白/多肽；而只檢測(cè)到Se或Hg的信號(hào)的分子可能是含硒蛋白/多肽或其它含Cys的蛋白/多肽 （圖1c和1d）。這樣就可以實(shí)現(xiàn)硒蛋白/多肽的特異性識(shí)別。

圖1 內(nèi)源和外源Se-Hg雙元素標(biāo)記策略識(shí)別硒蛋白和多肽

Fig.1 Endogenous and exogenous Se-Hg dual-labeling strategy for recognizing selenoprotein/peptide

3.2 CH3Hg-THI標(biāo)記硒醇-SeH

為了研究CH3Hg-THI能否選擇性的標(biāo)記-SeH，首先用DTT還原硒代胱氨酸（SeCys）2得到硒代半胱氨酸SeCys，之后用CH3Hg-THI標(biāo)記SeCys（圖2a）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)改變（SeCys）2與DTT的摩爾比，成功地獲得SeCys（m/z 167.6）（圖2b）；其在與CH3Hg-THI反應(yīng)后，SeCys的質(zhì)譜信號(hào)消失，同時(shí)出現(xiàn)了產(chǎn)物CH3Hg-SeCys的質(zhì)譜信號(hào)（m/z 404.6），而且其同位素分布（404.6（23.0%）， 402.6（16.3%）， 403.5（14.9%）， 401.6（12.8%）， 406.6（11.3%）， 400.5（8.4%）， 405.5（6.6%）， 408.5（2.9%）， 399.5（2.1%）， 397.7（0.9%）， 398.6（0.8%））與H2NCOOHCHCH2SeHgCH3的理論同位素分布一致（圖2c），證明SeCys中的-SeH被成功標(biāo)記。作為對(duì)照，SeMet（m/z 197.9和394.8）質(zhì)譜信號(hào)在標(biāo)記反應(yīng)前后并無(wú)變化，說(shuō)明-SeCH3不能被CH3Hg-THI所標(biāo)記。

圖2 （a）硒代胱氨酸（SeCys）2的DTT還原和CH3Hg-THI標(biāo)記SeCys反應(yīng)；（b）利用DTT還原硒代胱氨酸（SeCys）2獲得硒代半胱氨酸SeCys的ESI-IT-MS質(zhì)譜圖；（c）CH3Hg-THI標(biāo)記硒代半胱氨酸SeCys和硒代蛋氨酸SeMet的質(zhì)譜圖

Fig.2 （a） Reduction of （SeCys）2 to SeCys by dithiol dithiothreitol （DTT） and labeling with CH3Hg-THI， （b） ESI-IT-MS of the reduction of （SeCys）2 to SeCys by DTT and （c） labelling of the SeCys and SeMet with CH3Hg+ dynamically released from CH3Hg-THI

3.3 CH3Hg-THI標(biāo)記硒蛋白GPx1

本實(shí)驗(yàn)選取了一種典型的硒蛋白GPx1作為模型分子，驗(yàn)證CH3Hg-THI標(biāo)記GPx1中-SeH反應(yīng)的可行性。GPx1是硒蛋白家族中的一個(gè)重要成員，它能夠有效清除生物體中的超氧自由基[26]。GPx1分子由4個(gè)Monomer組成，每個(gè)Monomer含有1個(gè)-SeH基團(tuán)（SeCys52）和2個(gè)-SH基團(tuán)[27]。作為對(duì)照，同時(shí)使用CH3Hg+和CH3Hg-THI分別對(duì)GPx1進(jìn)行標(biāo)記。結(jié)果表明，在生理溶液中直接使用CH3Hg+對(duì)GPx1進(jìn)行標(biāo)記時(shí)出現(xiàn)了白色的蛋白沉淀（圖3a），說(shuō)明GPx1的分子構(gòu)象被破壞，導(dǎo)致其變性。SEC/ICP-MS的分析結(jié)果也表明溶液中殘存的CH3Hg+標(biāo)記的GPx1的Se和Hg信號(hào)顯著降低（圖3b）。相比于直接使用CH3Hg+，CH3Hg-THI間接地動(dòng)態(tài)釋放CH3Hg+[17]，并與GPx1反應(yīng)，在標(biāo)記過(guò)程中不會(huì)導(dǎo)致GPx1變性（圖3a），這時(shí)SEC/ICP-MS可同時(shí)檢測(cè)到非常強(qiáng)的Se和Hg信號(hào)，說(shuō)明GPx1成功地被CH3Hg-THI標(biāo)記，并能在生理溶液中穩(wěn)定存在。

利用SEC/ESI-IT-MS和MALDI-TOF-MS對(duì)標(biāo)記后的GPx1進(jìn)行了分析（如圖3c）。SEC/ESI-IT-MS檢測(cè)到的標(biāo)記前后的M（GPx1 monomer）和標(biāo)記后產(chǎn)物M（M-（HgCH3）3），分子量分別為22651.5 和23326.9 Da，質(zhì)量差為675.4 Da，說(shuō)明GPx1 monomer中的-SeH基團(tuán)和2個(gè)-SH基團(tuán)都被成功標(biāo)記。MALDI-TOF-MS對(duì)相同標(biāo)記產(chǎn)物的分析結(jié)果表明，除GPx1monomer可以被CH3Hg-THI成功標(biāo)記外，其二聚體、三聚體和四聚體都可以被成功標(biāo)記，再次證明CH3Hg-THI動(dòng)態(tài)標(biāo)記有利于保持GPx1分子的穩(wěn)定性。進(jìn)一步利用SEC/ICP-MS對(duì)標(biāo)記反應(yīng)進(jìn)行了定量分析?；贗CP-MS對(duì)202Hg 的檢出限（45 pmol/L），GPx1的檢出限可以達(dá)到10 fmol，較通過(guò)對(duì)82Se的檢測(cè)靈敏度（100 fmol）提高1個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明外源的Hg標(biāo)簽除了能夠幫助區(qū)分硒蛋白/多肽和含硒蛋白/多肽分子，也能夠有效提高硒蛋白/多肽的檢測(cè)能力，有利于低豐度生物分子的研究。

圖3 （a）CH3Hg+和CH3Hg-THI標(biāo)記GPx1；（b）SEC-ICP-MS，（c）ESI-IT-MS和（d）MALDI-TOF-MS分析GPx1和其標(biāo)記產(chǎn)物

Fig.3 （a） Labeling of glucathione peroxidase 1 （GPx1） directly with CH3Hg+ and CH3Hg-THI under the same experimental conditions； （b） Typical chromatograms of SEC-ICP-MS of native and labeled GPx1； Analysis of the native and CH3Hg-tagged GPx1 by （c） ESI-IT-MS and （d） MALDI-TOF-MS

3.4 富硒酵母提取物中硒蛋白/多肽的識(shí)別和檢測(cè)

富硒酵母中不但含有硒蛋白/多肽，而且有含硒蛋白/多肽和含硒無(wú)機(jī)小分子，在平衡生物體內(nèi)的Se含量和硒蛋白/多肽功能方面發(fā)揮著重要作用[28～33]。采用PBS緩沖液超聲提取富硒酵母的水溶性組分，對(duì)其中硒蛋白/多肽進(jìn)行識(shí)別和檢測(cè)。需要注意的是，在CH3Hg-THI標(biāo)記和SEC/ICP-MS和RPLC/ICP-MS檢測(cè)之前，并未對(duì)富硒酵母的水溶性提取液進(jìn)行還原，避免因還原反應(yīng)造成二硫鍵斷裂，產(chǎn)生大量SH基團(tuán)。CH3Hg-THI對(duì)富硒酵母水溶性提取液進(jìn)行標(biāo)記后，采用兩種色譜模式SEC （圖4a）和RPLC（圖4b）與ICP-MS聯(lián)用進(jìn)行分析。SEC/ICP-MS結(jié)果表明，在富硒酵母的水溶性提取物主要含有5個(gè)含硒餾分（9.6， 12.8， 21.2， 24.6和31.4 min）。因可同時(shí)檢測(cè)到Se和Hg的信號(hào)（圖4a），9.6，12.8和21.2 min這3個(gè)餾分中含有硒蛋白/多肽；與分子量標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間相比較，9.6 min組分是分子量大于44.3 kDa的硒蛋白，含量占總Se含量的2.6%；12.8 min保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)GPx1的保留時(shí)間一致，富硒酵母水溶性提取樣品中含有GPx1，占總Se的1.1%；21.2 min餾分的分子量介于1.4～14 kDa，是硒多肽，占總Se的58.8 %；而24.6和31.4 min組分的分子量小于1.4 kDa，又因只觀察到Se的信號(hào)，它們可能是含硒的小分子化合物，占Se總含量的33.4 %。相比于SEC，RPLC有更高的分辨率。在相同的分離時(shí)間（40 min）內(nèi)，RPLC/ICP-MS共檢測(cè)到15個(gè)色譜峰有Se的信號(hào)，其中7個(gè)色譜峰

圖4 富硒酵母水溶性提取液的SEC/ICP-MS（a）和RPLC/ICP-MS（b）分析。*標(biāo)記的色譜峰為潛在的硒蛋白/多肽。（a）中1， 2， 3， 4和5分別表示分子量標(biāo)志物（237.0， 66.5， 44.3， 14.3 and 1.4 kDa）的保留時(shí)間

Fig.4 Typical chromatograms of water-soluble extract of Se-enriched yeast analyzed using （a） SEC-ICP-MS and （b） RP-ICP-MS. The marked （*） peaks indicated possible selenoproteins （peptides） in the extract. 1， 2， 3， 4 and 5 in （a） represent the elution time of the five molecular weight markers used （237.0， 66.5， 44.3， 14.3 and 1.4 kDa）

（*）同時(shí)檢測(cè)到Se和Hg的信號(hào)（圖4b），可認(rèn)為是硒蛋白/多肽，GPx1位于26.5～30.0 min之間。由圖4b可見(jiàn)，當(dāng)檢測(cè)32S16O+時(shí)，高含量組分在10 min前被檢測(cè)到，這些都是富硒酵母水溶性提取液中高含量的含Cys的蛋白分子（因硒蛋白分子中也可能含有Cys）；在這樣的高的背景下，本方法仍可以識(shí)別硒蛋白/多肽、含硒蛋白/多肽和其他高豐度蛋白/多肽分子，證明了Se-Hg雙元素標(biāo)簽標(biāo)記方法在解決識(shí)別和檢測(cè)硒蛋白/多肽問(wèn)題上的優(yōu)越性。值得指出的是，更高分辨能力的多維分離技術(shù)和更高分辨率的質(zhì)譜技術(shù)（如FT-ICR-MS）的聯(lián)合應(yīng)用將有助于已識(shí)別的硒蛋白/多肽的組成和結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步鑒定。

4 結(jié) 論

提出并發(fā)展了內(nèi)源和外源雙元素標(biāo)簽標(biāo)記策略，此策略使得ICP-MS在識(shí)別和檢測(cè)硒蛋白/多肽方面展示了前所未有的優(yōu)越性。隨著針對(duì)不同重要蛋白/多肽分子的雙元素標(biāo)簽標(biāo)記策略研究的深入開(kāi)展，此策略將在識(shí)別和定量已知和未知蛋白/多肽分子方面發(fā)揮重要作用。

References

1 Kjeldahl J Z. Anal. Chem.， 1883， 22（1）： 366

Symbolm@@ 382

2 Cvetkovic A， Menon A L， Thorgersen M P， Scott J W， Poole F L， Jenney F E， Lancaster W A， Praissman J L， Shanmukh S， Vaccaro B J， Shanmukh S， Vaccaro B J， Trauger S A， Kalisiak E， Apon J V， Siuzdak G， Yannone S M， Tainer J A， Adams M W. Nature， 2010， 466（7307）： 779-782

3 XU Ming， YAN Xiao-Wen， YANG Li-Min， WANG Qiu-Quan. Scientia Sininca Chimica， 2011， 41（4）： 663-677

徐 明， 嚴(yán)曉文， 楊利民， 王秋泉. 中國(guó)科學(xué)： 化學(xué)， 2011， 41（4）： 663-677

4 Yan X W， Yang L M， Wang Q Q. Anal. Bioanal. Chem.， 2013， 405（17）： 5663-5670

5 WANG Qiu-Quan，TANG Nan-Nan， YANG Li-Min. Scientia Sininca Chimica， 2014， 44（5）： 664-671

王秋泉， 唐南南， 楊利民. 中國(guó)科學(xué)： 化學(xué)， 2014， 44（5）： 664-671

6 Zhang C， Zhang Z， Yu B， Shi J， Zhang X. Anal. Chem.， 2002， 74（1）： 96

7 Baranov V I， Quinn Z， Bandura D R， Tanner S D. Anal. Chem.， 2002， 74（7）： 1629

8 Sanz-Medel A， Montes-Bayon M， Fernandez Sanchez M L. Anal. Bioanal. Chem.， 2003， 377（2）： 236

9 Szpunar J. Analyst， 2005， 130（4）： 442

10 Prange A， Prfrock D. J. Anal. At. Spectrom.， 2008， 23（4）： 432

11 Bettmer J， Montes Bayón M， Encinar J R， Fernández Sánchez M L， Fernández de la Campa Mdel R， Sanz Medel A. J. Proteomics， 2009， 72（6）： 989

12 Mounicou S， Szpunar J， Lobinski R. Chem. Soc. Rev.， 2009， 38（4）： 1119

13 Wang M，F(xiàn)eng W， Zhao Y， Chai Z. Mass Spectrom. Rev.， 2010， 29（2）： 326

14 Xu M， Yang LM， Wang Q Q. J. Anal. At. Spectrom.， 2008， 23（11）： 1545

15 Guo Y F， Chen L Q， Yang L M， Wang Q Q. J. Am. Soc. Mass Spectrom.， 2008， 19（8）： 1108

16 Guo Y F， Xu M， Yang L M， Wang Q Q. J. Anal. At. Spectrom.， 2009， 24（9）： 1184

17 Xu M， Yan X W， Xie Q Q. Yang L M， Wang Q Q. Anal. Chem.， 2010， 82（5）： 1616

18 Xu M， Yang L M， Wang Q Q. Chem. Eur. J.， 2012， 18（44）： 13989

19 Xu M， Yang L M， Wang Q Q. Metallomics， 2013， 5（7）： 855

20 Mounicou S， Shah M， Meija J， Caruso J A， Vonderheide A P， Shann J. J. Anal. At. Spectrom.， 2006， 21（4）： 404

21 Li Y F， Chen C Y， Li B， Wang Q， Wang J X， Gao Y X， Zhao Y L， Chai Z F. J. Anal. At. Spectrom.， 2007， 22（8）： 925

22 Li Y F， Dong Z Q， Chen C Y， Li B， Gao Y X， Qu L Y， Wang T C， Fu X， Zhao Y L， Chai Z F. Environ. Sci. Technol.， 2012， 46（20）： 11313

23 Behne D， Kyriakopoulos A. Annu. Rev. Nutr.， 2001， 21（1）： 453

24 Huber R E， Criddle R S. Arch. Biochem. Biophys.， 1967， 122（1）： 164

25 Arnér E S. Exp. Cell Res.， 2010， 316（8）： 1296

26 Margis R， Dunand C， Teixeira F K， Margis-Pinheiro M. FEBS J.， 2008， 275（15）： 3959

27 Nakamura W， Hosoda S， Hayashi K. Biochim. Biophys. Acta， 1974， 358（1）： 251

28 Lobanov A V， Hatfield D L， Gladyshev V N. Biochim. Biophys. Acta， 2009， 1790（11）： 1424

29 Mester Z， Willie S， Yang L， Sturgeon R， Caruso J A， Fernández M L， Fodor P， Goldschmidt R J， Goenaga-Infante H， Lobinski R， Maxwell P， McSheehy S， Polatajko A， Sadi B B， Sanz-Medel A， Scriver C， Szpunar J， Wahlen R， Wolf W. Anal. Bioanal. Chem.， 2006， 385（1）： 168

30 Rao Y， McCooeye M， Windust A， Bramanti E， D'Ulivo A， Mester Z. Anal. Chem.， 2010， 82（19）： 8121-8130

31 Bierla K， Szpunar J， Yiannikouris A， Lobinski R. Trends Anal. Chem.， 2012， 41： 122

32 Bierla K， Bianga J， Ouerdane L， Szpunar J， Yiannikouris A， Lobinski R. J. Proteomics， 2013， 87： 26

33 Li H M， Luo Y C， Li Z X， Yang L M， Wang Q Q. Anal. Chem.， 2012， 84（6）： 2974