齊景文，依穎新，周艷紅，雷 蕾，楊蘊(yùn)力，李 祺

（沈陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽(yáng) 110034）

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種廣泛分布于世界各地的人畜共患的傳染病，人類感染后，病程長(zhǎng)，反復(fù)發(fā)作，長(zhǎng)期不愈，家畜感染則出現(xiàn)流產(chǎn)和不育，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康。近年來(lái)，布病在許多國(guó)家和地區(qū)再度肆虐[1]，盡管這些國(guó)家和地區(qū)都采取各種防控措施，也取得了一定成效，但布病防控工作仍是一個(gè)長(zhǎng)期而艱巨的任務(wù)。

目前，我國(guó)布病的血清學(xué)檢測(cè)方法主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）等，RBT用于初篩，SAT和CFT用于診斷定性，就SAT而言，存在一定的假陽(yáng)性和假陰性[2]，對(duì)診斷定性和陽(yáng)性畜的撲殺有一定影響，而CFT操作復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)者要求高，特異性很好，但有一定假陰性，會(huì)出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，對(duì)布病的凈化不利，我們希望通過(guò)對(duì)國(guó)際貿(mào)易指定的ELISA檢測(cè)方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行比對(duì)分析，能為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)修訂提供參考。

1 材料與方法

1.1 被檢血清

血清樣本為2009-2014年沈陽(yáng)8涉農(nóng)區(qū)縣（市）送檢復(fù)核樣本669份，其中奶牛樣本383份，羊樣本286份。

1.2 試劑

布魯菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)陰性和陽(yáng)性血清，來(lái)自青島易邦生物工程有限公司；布魯菌病試管凝集試驗(yàn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)陰性和陽(yáng)性血清，來(lái)自青島易邦生物工程有限公司；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清、溶血素和補(bǔ)體，由中國(guó)CDC傳染病所提供；布氏桿菌抗體ELISA檢測(cè)試驗(yàn)盒，由美國(guó)IDEXX公司提供。

1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀（TECAN，SUNRISE），瑞士TECAN公司產(chǎn)品；洗板機(jī)（Columbus M8/2R），瑞士TECAN公司產(chǎn)品；超純水純化系統(tǒng)（Milli-Q-B），美國(guó)密理博公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴箱（WS2-261-79），上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠；恒溫培養(yǎng)箱（HPS-250），哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；單、多道移液器（Eppendorf），德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；離心機(jī)（SIGMA，3K30），德國(guó)希格瑪離心機(jī)有限公司生產(chǎn)。

1.4 試驗(yàn)方法

虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）按照GB/T 18646-2002進(jìn)行操作與判定，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試驗(yàn)按試劑操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作與結(jié)果判定。

表1 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的可能結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 牛羊布魯菌病不同血清學(xué)檢測(cè)方法結(jié)果

按《布魯氏菌病防治技術(shù)規(guī)范》要求，RBT陽(yáng)性而SAT陰性或CFT陰性牛只需間隔30天重新采血檢測(cè)，本試驗(yàn)過(guò)程中，出現(xiàn)的可疑牛只，間隔30-45天重新采集血清樣本進(jìn)行了檢測(cè)，轉(zhuǎn)陽(yáng)的和仍然可疑的，按陽(yáng)性統(tǒng)計(jì)，轉(zhuǎn)陰的，按陰性統(tǒng)計(jì)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

為了更好說(shuō)明四種布魯菌病檢測(cè)方法的可靠性，研究中分別利用布魯菌病ELISA檢測(cè)結(jié)果與RBT、SAT和CFT檢測(cè)結(jié)果分別進(jìn)行比較，采用假陽(yáng)性率、假陰性率、一致率和Kappa值四種分析指標(biāo)。假設(shè)，實(shí)驗(yàn)中形成的檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表2 ELISA與RBT、SAT和CFT檢測(cè)同一批奶牛血清樣本布魯菌病結(jié)果

表3 ELISA與RBT、SAT和CFT檢測(cè)同一批羊血清樣本布魯菌病結(jié)果

四種分析指標(biāo)的計(jì)算方法如下：

假陰性率＝（c/e1）×100%

假陽(yáng)性率＝（b/e2）×100%

一致率＝[（a+d）/n]×100%

Kappa 值 ={[（a+d）/n]-[（e1r1+e2r2）/n2]}/{1-[（e1r1+e2r2）/n2]}[3]

假陰性率是指確診陰性用某種方法檢測(cè)為陽(yáng)性與此種方法檢測(cè)所有陽(yáng)性之和的百分比；假陽(yáng)性是指確診為陽(yáng)性用某種方法檢測(cè)為陰性與此種方法檢測(cè)所有陰性之和的百分比；一致率是指確診的陽(yáng)性與陰性樣本且與兩種檢測(cè)方法結(jié)果相一致的總和與所有檢測(cè)樣本的百分比；Kappa值是醫(yī)學(xué)上常用和一種用于計(jì)數(shù)資料的一致性評(píng)測(cè)，是評(píng)價(jià)一致性的測(cè)量值。假陰性與假陽(yáng)性能反應(yīng)檢測(cè)方法的敏感性和特異性，一致率是檢測(cè)方法的相關(guān)程度，Kappa值是一致性檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，一般認(rèn)為，Kappa值≥0.75，說(shuō)明已經(jīng)取得相當(dāng)滿意的一致程度。若Kappa值＜0.4，則說(shuō)明一致程度不夠理想。

2.2 ELISA與RBT、SAT和CFT檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性比較

通過(guò)RBT、SAT、CFT和ELISA四種血清學(xué)方法，對(duì)牛羊布魯菌病檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比，可以得出：RBT、SAT、CFT與ELISA檢測(cè)的一致率較高（88%以上），通過(guò)Kappa值檢驗(yàn)，Kappa值均大于或等于0.75，說(shuō)明四種檢測(cè)方法具有很好的一致性，ELISA方法可以進(jìn)行布魯菌病的診斷定性。但RBT、SAT、CFT與ELISA相比，有一定的假陽(yáng)性（1.22%～22.97%）和假陰性（2.59%～14.71%）（見(jiàn)表2、表3），假陽(yáng)性的存在容易發(fā)生牛羊布魯菌病的錯(cuò)判，假陰性率高表明檢測(cè)過(guò)程中容易出現(xiàn)病畜漏網(wǎng)狀況，不利于布魯菌病的凈化工作。SAT作為國(guó)標(biāo)中布魯菌病診斷定性的方法，在布魯菌病檢測(cè)中效果并不理想，CFT敏感性差，易漏檢，而成為群體的潛在威脅。這四種血清學(xué)方法中，RBT操作簡(jiǎn)便，快速易行，有一定的敏感性和特異性，用于牛羊布魯菌病初篩效果較好，CFT方法雖然操作復(fù)雜，但特異性好，用于陽(yáng)性畜的撲殺最為合理，因此采用RBT進(jìn)行初篩，用CFT與ELISA進(jìn)行牛羊布魯菌病聯(lián)合診斷較為理想。

3 討論

雖然對(duì)沈陽(yáng)市2009—2014年牛羊布魯菌病復(fù)核樣本進(jìn)行了研究，但樣品存貯時(shí)間與來(lái)源是否具有代表性，需要在以后的研究中進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。牛羊布魯菌病的血清學(xué)診斷方法種類較多，但目前還沒(méi)有任何一種方法在敏感性、特異性以及操作簡(jiǎn)便、易行、快速等方面都是完美無(wú)缺的。在對(duì)383頭奶牛樣本檢測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)有25頭SAT可疑或陰性，而ELISA檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性，檢出可疑樣品，間隔一個(gè)月需重新采樣檢測(cè)，在隨后的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，這25頭新采集奶牛樣本中有20頭出現(xiàn)了SAT轉(zhuǎn)陽(yáng)的情況；在檢測(cè)中也出現(xiàn)了5份樣本RBT陽(yáng)性SAT陰性，而CFT和ELISA陽(yáng)性的情況。陽(yáng)性畜的漏檢，為病原菌的散布和疾病的蔓延提供了機(jī)會(huì)，陰性畜的誤殺會(huì)造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

鑒于這幾種檢測(cè)方法的符合率不高，建議在實(shí)際檢測(cè)工作中，用兩種或兩種以上的方法配合檢測(cè)。一般在進(jìn)行大規(guī)模檢疫時(shí)，為了降低繁重的工作量，先采用特異性較差但價(jià)格低廉、操作比較簡(jiǎn)便、敏感性較高的方法進(jìn)行篩選，然后再用敏感性和特異性好的診斷方法進(jìn)行復(fù)核。通過(guò)研究認(rèn)為，應(yīng)用RBT初篩較好，因?yàn)镽BT具有敏感性高，操作簡(jiǎn)單易行，不需要太多的儀器設(shè)備，對(duì)環(huán)境要求不嚴(yán)格；布病的陽(yáng)性畜要進(jìn)行撲殺和無(wú)害化處理，因此運(yùn)用特異性好的CFT與ELISA方法進(jìn)行聯(lián)合診斷定性較為理想。

[1]尚德秋.布魯氏菌病再度肆虐及其原因[J].中國(guó)地方病防治雜志，2001，16（1）：29-34.

[2]范偉興，鐘旗，何倩倪，等.幾種布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法的比較研究[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2006，23（6）：31-33.

[3]王蓓.臨床流行病學(xué)[M].南京：東南大學(xué)出版社，2004：251.