梁曉艷，萬(wàn)東山，2，郭蘭英

（1.華美生物工程有限公司，河南洛陽(yáng) 471003；2.鄭州大學(xué)，河南鄭州 450001）

多重?zé)晒釸T-PCR技術(shù)檢測(cè)豬流感病毒、豬乙型腦炎病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒方法的建立

梁曉艷1，萬(wàn)東山1，2，郭蘭英1

（1.華美生物工程有限公司，河南洛陽(yáng) 471003；2.鄭州大學(xué)，河南鄭州 450001）

[目的] 建立能同時(shí)鑒測(cè)豬流感病毒（SIV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的多重?zé)晒釸T-PCR方法。[方法] 根據(jù)4種病原體的高度保守基因序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物和探針，并對(duì)引物和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，檢測(cè)48例疑似樣本。[結(jié)果] 建立了多重?zé)晒釸T-PCR方法，檢測(cè)48例臨床樣本中，4種病毒均未感染的1例，SIV與JEV混合感染占2.1 %，CSFV與PRRSV混合感染為31.3 %。[結(jié)論] 多重?zé)晒釸T-PCR對(duì)四種病原體的檢測(cè)準(zhǔn)確性好，具有快速的特點(diǎn)。

多重?zé)晒釸T-PCR；豬流感病毒；豬乙型腦炎病毒；豬瘟病毒；豬繁殖與呼吸綜合征病毒

1 前言

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化發(fā)展，豬繁殖障礙疫病已成為大中型豬場(chǎng)最重要的疫病之一。在引起豬繁殖與呼吸障礙的諸多病原中，豬瘟病毒、豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬乙腦病毒是較為常見(jiàn)的RNA病毒，豬在這四種病毒感染后發(fā)病早期，均有發(fā)熱、食欲減少等癥狀，根據(jù)癥狀很難區(qū)分感染病原體的類(lèi)別，而且近年來(lái)呈現(xiàn)混合感

染的特點(diǎn)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，對(duì)于病毒病的診斷一般采用病原分離鑒定和血清學(xué)方法[3]，但這些方法存在操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、敏感性較差等不足，特別是當(dāng)豬群混合感染多種病原時(shí)，確切診斷還需進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)[4]。本試驗(yàn)依據(jù)SIV、CSFV、PRRSV和JEV的保守區(qū)基因序列，參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并合成四對(duì)特異性引物及探針，建立了可以同時(shí)檢測(cè)SIV、CSFV、PRRSV和JEV四種RNA病毒混合感染的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法，并對(duì)臨床48例疑似病料進(jìn)行初步檢測(cè)。

2 材料與方法

2.1 儀器

Qiagen分離柱、LR10 2.4A高速冷凍離心機(jī)、ABI7500熒光分析儀、JY02S紫外分析儀、HM-I多功能水平電泳槽。

2.2 毒株

豬流感病毒（SIV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）均由本實(shí)驗(yàn)室采集、分離保存。

2.3 臨床樣本

收集自2013年河南省洛陽(yáng)市周邊不同地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)疑似豬流感、豬乙型腦炎、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征病豬48例，取心、肝、脾、腎、淋巴結(jié)、大腦、肺臟等，分別裝入不同的封口帶內(nèi)，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 引物與探針

表1 用于4種豬病毒的熒光RT-PCR的引物及探針

根據(jù)Genebank公布的序列設(shè)計(jì)4對(duì)引物和探針，由上海生工生物工程有限公司合成。

2.5 試驗(yàn)方法

2.5.1 病毒增殖及模板制備

SIV和JEV采用BHK-21細(xì)胞增殖，CSFV用PK-15細(xì)胞增殖，PRRSV用MARC-145細(xì)胞增殖，37 ℃分別培養(yǎng)，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞病變達(dá)90%以上時(shí)收毒，將收獲的細(xì)胞液置于-20 ℃冷凍，37 ℃解凍，如此反復(fù)凍融3次，3000 r/min離心25 min，分別吸取含SIV、CSFV、PRRSV和JEV的上清液100 μL，加入600 μL裂解液，充分顛倒，室溫靜置5 min，將離心管中液體吸入吸附柱中，13000 r/ min 離心30 s，棄去收集管中液體，向吸附柱中加入600 μL 洗液，13000 r/min 離心30s，棄去收集管中液體，重復(fù)洗滌一次，13000 r/min，離心2 min。將吸附柱移入新的離心管中，加入25μL洗脫液，室溫靜置1 min，13000 r/min 離心30 s，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 多重?zé)晒釸T-PCR的建立

建立熒光PCR反應(yīng)體系，在50 μL的反應(yīng)體系中分別依次加入：10×RT-PCR緩沖液5 μL，MgCL23 mmol/L，dNTPs濃 度 為 200 μm/L，25×RT-PCR酶混合物2 μL，四對(duì)引物濃度均為0.5 μmol/L，RNase Inhibitor 40 U/μL，探針濃度0.2 μmol/L，模板5 μL，最后用DEPC-H2O補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃ 15 min；95 ℃ 10 min；40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 8 s，60 ℃ 34 s，充分混勻并短暫離心后放入擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，用1 %瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果。

2.5.3 多重?zé)晒釸T-PCR的優(yōu)化

在其他條件不變的情況下，四對(duì)引物濃度從 0.4 μmol/L、

0.6 μmol/L、0.8 μmol/L、1.0 μmol/L遞增，熒光探針濃度從0.1 μmol/L、0.15 μmol/L、0.2 μmol/L、0.25 μmol/L遞增，根據(jù)Ct值及曲線(xiàn)形態(tài)選擇最佳的濃度及配比。

2.5.4 陰、陽(yáng)性結(jié)果判定

反應(yīng)結(jié)束后記錄樣品的Ct值，如果反應(yīng)曲線(xiàn)呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，而且Ct<33，則表明為陽(yáng)性，否則判為陰性。

2.5.5 臨床試驗(yàn)

取收集的心、肝、脾、腎、淋巴結(jié)、大腦、肺臟等各2 g，放入研磨器內(nèi)并且加入5mL PBS，充分研磨混勻，超聲波破碎5 min，2000 r/min離心5 min，取上清液提取RNA作為反應(yīng)模板，按照前面所建里的反應(yīng)體系依次加入各反應(yīng)物，進(jìn)行多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 多重?zé)晒釸T-PCR的優(yōu)化

經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)確立最終SIV引物濃度為：0.45 μmol/L；PRRSV引物濃度為0.66 μmol/L；CSFV引物濃度為0.55 μmol/L；JEV引物濃度為0.75 μmol/L；探針濃度分別為0.1 μmol/L、0.25 μmol/L、0.2 μmol/L、0.15 μmol/L，按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系同時(shí)檢測(cè)4種豬病毒，結(jié)果如圖1所示。

圖1 多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)4種豬病毒

3.2 多重?zé)晒釸T-PCR的鑒定

將擴(kuò)增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，4條目的條帶均在100 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符 （圖2）。

3.3 臨床樣本檢測(cè)

48例臨床樣本經(jīng)用所建立的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PRRSV單獨(dú)感染12例，感染率為25 %，SIV單純感染7例，感染率為14.6%， CSFV單純感染6例，感染率為12.5%，JEV單獨(dú)感染4例，感染率為8.3%，SIV與JEV混合感染1例，CSFV與PRRSV混合感染15例，感染率為31.3%，SIV與JEV混合感染有1份，感染率為2.1%。四種病毒均未檢感染的有1例，4種病毒都感染的有2份，占比達(dá)4.2 %，這兩份樣本的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

圖2 多重?zé)晒釸T-PCR的鑒定

圖3 4種病毒都感染的兩份樣本的熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

4 討論

多重?zé)晒釸T-PCR是臨床混合感染病原體的重要鑒別診斷方法，通過(guò)分析軟件能直觀詳細(xì)記錄整個(gè)RT-PCR過(guò)程，且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只打開(kāi)一次試管，有效減少假陽(yáng)性和污染發(fā)生的機(jī)會(huì)[1]。多重?zé)晒釸T-PCR成功的關(guān)鍵在于引物與探針設(shè)計(jì)，選擇高度保守的基因序列，設(shè)計(jì)多對(duì)特異性高的引物和

探針，經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選調(diào)整，最終確定各個(gè)引物探針的濃度。

本文采用一步法RT-PCR進(jìn)行RNA病毒的擴(kuò)增，不斷的摸索條件，采用獨(dú)有的反應(yīng)條件：50℃ 15 min；95℃ 10 min；40個(gè)循環(huán)：95℃ 8 s，60℃ 34 s，事實(shí)證明，這種反應(yīng)模式方便，快捷，可操作性強(qiáng)。王英[9]采用一步法RT-PCR同時(shí)擴(kuò)増DNA和RNA混合模板，在一步法檢測(cè)上又有創(chuàng)新。

本文檢測(cè)的48例臨床樣本中，PRRSV感染率高達(dá)56 %，占到一半以上，且CSFV與PRRSV常呈混合感染的態(tài)勢(shì)，這與陳光達(dá)的報(bào)告大體一致[10]，而SIV與JEV常呈散發(fā)態(tài)勢(shì)。

目前，對(duì)于豬病毒的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)技術(shù)沒(méi)有報(bào)道，本文通過(guò)多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)豬4種常見(jiàn)病毒，并進(jìn)行了臨床樣本檢測(cè)，可真實(shí)反應(yīng)豬群帶毒狀況，為后續(xù)科研及熒光定量RT-PCR技術(shù)開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

[1]饒品彬. EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR同時(shí)檢測(cè)多種豬病毒研究[D]. 浙江 杭州：浙江理工大學(xué)，2014.03.

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Development of a Multiplex Fluorescent RT-PCR for Detection of 4 Swine Viruses

Liang Xiaoyan1，Wan Dongshan1，2，Guo Lanying1
（1.Sino-American Biotechnology Co，LTD，Luoyang，Henan 471003；2. Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450001）

[Objective] To develop a multiplex fluorescent RT-PCR assay to detect swine influenza virus（SIV），Japanese encephalitis virus（JEV），classical swine fever virus（CSFV），and porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）. [Method] Specific primers and probe were designed based on the highly conserved gene sequences of the four swine pathogens and their working concentrations and the amplification conditions were optimized. The multiplex fluorescent RT-PCR assay was evaluated with 48 suspected clinical samples. [Result] The multiple fluorescent RT-PCR assay was established for 4 swine viruses. Only one out of 48 samples was negative to the four viruses；the positive rate of SIV and JEV mixed infection was 2.1 %；the positive rate of CSFV and PRRSV mixed infection was 31.3 %.[Conclusion] The development of the multiplex fluorescent RT-PCR provided a sensitive，specific and rapid method to detect SIV，CSFV，PRRSV and JEV.

multiplex fluorescent RT-PCR assay；swine influenza virus（SIV）；Japanese encephalitis virus（JEV）；classical swine fever virus（CSFV）；porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）

S854.4+4

B

1005-944X（2015）04-0068-04

洛陽(yáng)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào)：1301068A

郭蘭英