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        細(xì)菌生物膜的研究進(jìn)展

        2015-09-10 20:53:53崔海英張雪婧趙呈婷等
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年8期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)技術(shù)

        崔海英+張雪婧+趙呈婷等

        摘要: 細(xì)菌生物膜是一種包裹在細(xì)胞外多聚物基質(zhì)中的、黏附于有生命或無(wú)生命物體表面的細(xì)菌群體,相對(duì)于游離狀態(tài)的細(xì)菌,生物膜狀態(tài)下的耐藥性更強(qiáng),給臨床治療帶來(lái)困難。近年來(lái),細(xì)菌生物膜的研究得到了迅速發(fā)展,細(xì)菌生物膜的檢測(cè)技術(shù)及清除方法日益完善且效果更佳。本文介紹了細(xì)菌生物膜研究的最新進(jìn)展,包括細(xì)菌生物膜的耐藥機(jī)理、檢測(cè)技術(shù)、清除方法,并對(duì)生物膜的清除進(jìn)行了展望,為研究細(xì)菌耐藥性、控制生物膜感染提供了理論基礎(chǔ)。

        關(guān)鍵詞: 細(xì)菌生物膜;耐藥機(jī)理;檢測(cè)技術(shù);清除方法

        中圖分類號(hào): Q936 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A[HK]

        文章編號(hào):1002-1302(2015)08-0011-04[HS)]

        抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng),給臨床治療帶來(lái)困難。美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心的專家研究表明,65%~80%的人類細(xì)菌感染與生物膜相關(guān),50%的院內(nèi)感染與醫(yī)療器械裝置上的生物膜相關(guān)聯(lián) [1-2]。在惰性表面形成生物膜后,生物膜保護(hù)細(xì)菌免受宿主的獲得性免疫應(yīng)答以及吞噬細(xì)胞的捕食,使其耐藥性提高10~1 000倍 [3],引起了人們極大的關(guān)注。

        細(xì)菌生物膜(bacterial biofilm,BBF)是指細(xì)菌為了適應(yīng)生存環(huán)境,黏附于有生命或無(wú)生命物體表面后,被細(xì)菌胞外自身產(chǎn)生的多聚物基質(zhì)包裹的有組織的細(xì)菌群體 [4-5]。細(xì)菌生物膜中水分含量可高達(dá)97%;除了水和細(xì)菌外,生物膜中還含有蛋白質(zhì)、多糖、肽聚糖、DNA、脂、磷脂等物質(zhì) [6]。本文就細(xì)菌生物膜的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,涉及細(xì)菌生物膜的耐藥機(jī)理、檢測(cè)技術(shù)以及清除方法,并對(duì)細(xì)菌生物膜清除方法的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

        1 細(xì)菌生物膜的耐藥機(jī)理

        1.1 細(xì)菌生物膜的屏障作用

        細(xì)菌吸附在惰性表面后,自身會(huì)產(chǎn)生大量的多糖、脂類等多聚物包裹在細(xì)菌外,從而形成了1層天然的屏障,這是生物膜的顯著特點(diǎn)之一,這種特點(diǎn)可以防止抗生素嵌入在細(xì)菌外壁上。革蘭氏陰性細(xì)菌(如大腸桿菌)比革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞膜外多1層細(xì)胞外膜(多聚糖),就可以有效阻止抗生素的進(jìn)入,或降低進(jìn)入藥物的殺菌性。Suci等利用紅外光譜研究表明,抗生素環(huán)丙沙星滲透進(jìn)生物膜的速度與滲透進(jìn)游離細(xì)菌內(nèi)部的速度相比有明顯降低,這是由于部分環(huán)丙沙星被結(jié)合到生物膜組分中 [7]。還有研究表明,胞外多糖是帶負(fù)電荷的,會(huì)吸收多肽鏈中帶正電荷的氨基側(cè)鏈,形成1道屏障,從而阻礙親水性的抗生素滲透入菌體發(fā)揮殺菌作用,使抗生素的殺菌能力顯著降低 [8]。

        但是現(xiàn)在有越來(lái)越多的試驗(yàn)證明,屏障作用不是生物膜的主要耐藥機(jī)理。Walters等研究表明,氟喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星是能夠穿透銅綠假單胞菌生物膜的 [9]。Anderl等發(fā)現(xiàn),盡管環(huán)丙沙星、氨芐青霉素可以穿透整個(gè)有β-內(nèi)酰胺酶突變體的肺炎克雷伯菌生物膜,但是這個(gè)突變體仍然耐氨芐青霉素 [10]。

        1.2 細(xì)菌生物膜中表型的表達(dá)

        一些細(xì)菌為了適應(yīng)環(huán)境的改變,特定的基因表達(dá)能夠使它們具有耐藥性。生物膜細(xì)菌聚集、黏附以后,為了適應(yīng)新的生存環(huán)境,特定的基因表達(dá)發(fā)生變化,使生物學(xué)行為發(fā)生改變,這稱為生物膜表型。細(xì)菌特有的表型能夠激發(fā)出生物膜的耐藥機(jī)理,Beaudoin等發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌ndvB基因與細(xì)胞外多聚糖的形成有關(guān) [11],如果表達(dá)水平上發(fā)生了改變,多聚糖的形成會(huì)發(fā)生變化,就會(huì)導(dǎo)致抗生素遠(yuǎn)離生物膜外特定的靶細(xì)胞或者與其發(fā)生螯合反應(yīng),從而降低了抗生素的作用,提高了生物膜的耐藥性。

        另外,也有研究發(fā)現(xiàn),大腸桿菌擁有編碼群體感應(yīng)的2個(gè)重要調(diào)節(jié)基因 LuxS、pga操縱子,在生物膜中表達(dá)有所增強(qiáng),會(huì)引起信號(hào)合成酶、β-1-6-N-乙酰-葡聚糖胺合成酶增多,使初始黏附和生物膜成熟效果增加,導(dǎo)致生物膜中的菌株表現(xiàn)出強(qiáng)的耐藥性。人工去除細(xì)菌中的luxS基因,會(huì)使所培養(yǎng)的浮游菌株耐藥性降低,而生物膜菌株耐藥性下降不是很明顯,表明耐藥性并不是單一的耐藥性基因所控制的 [12]。

        1.3 細(xì)菌生物膜的抗生素外排泵系統(tǒng)

        抗生素外排泵系統(tǒng)就是指細(xì)菌能夠產(chǎn)生外排系統(tǒng)將進(jìn)入細(xì)胞生物膜的抗生素排出體外,這是細(xì)菌自我保護(hù)的一種手段。自從1980年McMurray等首次提出主動(dòng)外排系統(tǒng)是大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的基本耐藥機(jī)理之后,主動(dòng)外排系統(tǒng)得到了廣泛深入的研究。Mah認(rèn)為,銅綠假單胞菌基因組中有12個(gè)RND外排泵編碼 [13],主要起耐藥作用的是MexAB-OprM、MexCD-OprJ [14]。Gillis等也發(fā)現(xiàn),MexCD-OprJ、MexXY基因是銅綠假單胞菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素阿齊霉素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理 [15]。此外,突變?cè)黾覯exAB-OprM外排泵的活性也已被證明是銅綠假單胞菌對(duì)氨基糖苷類抗生素、氟喹諾酮類藥物的主要抗性機(jī)理 [16]。

        國(guó)內(nèi)也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),AdeABC外排泵是鮑氏不動(dòng)桿菌的主要外排系統(tǒng),其過(guò)度表達(dá)可增加對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥性;外排系統(tǒng)adeIJK的過(guò)度表達(dá)與鮑氏不動(dòng)桿菌對(duì)四環(huán)素、氟喹諾酮類、克林霉素類、β-內(nèi)酰胺類等抗菌藥物的耐藥性也有所相關(guān) [17-18]。

        1.4 細(xì)菌密度感應(yīng)效應(yīng)(QS)

        QS系統(tǒng)是細(xì)菌間信息傳遞的一種機(jī)制,通過(guò)監(jiān)測(cè)其群體的細(xì)胞密度來(lái)調(diào)節(jié)其特定的基因表達(dá)。此外,QS信號(hào)分子的分子量低、化學(xué)種類廣泛,包括:?;呓z氨酸內(nèi)酯、呋喃硼酸酯、順式不飽和脂肪酸和肽 [19]。Cristina等研究發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌的群體效應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)稱為Agr系統(tǒng),包括膜結(jié)合蛋白(AgrB)、QS肽(AgrD)、雙組分信號(hào)傳輸系統(tǒng)[包括傳感器組氨酸激酶(AGrC)、響應(yīng)調(diào)節(jié)器(AGrA)] [20]。在銅綠假單胞菌中,QS系統(tǒng)由2個(gè)信號(hào)系統(tǒng)(LasI/LasR、RhlI/RhlR)組成,這2個(gè)信號(hào)系統(tǒng)又分別產(chǎn)生特征性的N-?;呓z氨酸內(nèi)酯信號(hào)分子、N-丁?;?L-高絲氨酸內(nèi)酯(BHL)、N-(3-氧代十二酰)-L-高絲氨酸內(nèi)酯(OdDHL),一起應(yīng)對(duì)生存環(huán)境的改變。此外,這2個(gè)信號(hào)系統(tǒng)都由LuxI合成酶組成,并負(fù)責(zé)AHL的合成,AHL是細(xì)菌QS系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子,調(diào)節(jié)環(huán)境變化 [21]。此外,賈寧等研究表明,AgrD、RNAⅢ系統(tǒng)在提高紅霉素耐藥性的過(guò)程中起著重要作用 [22]。

        1.5 其他機(jī)理

        細(xì)菌生物膜耐藥是多種機(jī)理共同參與的結(jié)果,除以上幾種機(jī)理之外,還有營(yíng)養(yǎng)及氧氣的限制 [23]、分泌抗生素水解酶 [24]、免疫防御體制、普遍應(yīng)激反應(yīng) [25-26]等機(jī)制也可影響生物膜的耐藥性。

        2 細(xì)菌生物膜的檢測(cè)技術(shù)

        2.1 染色法

        染色法就是利用生物膜內(nèi)的物質(zhì)能夠與某些染料結(jié)合的性質(zhì),通過(guò)染色的方法對(duì)細(xì)菌的生物膜進(jìn)行定量,最常見的染色劑為結(jié)晶紫、剛果紅、銀鹽。結(jié)晶紫法的操作為:先用1%的結(jié)晶紫溶液浸潤(rùn)生物膜生成的表面,靜置30 min后,用清水洗去多余的染料,將剩余的水吸干并除去后,用乙醇或乙酸溶液溶解附著于生物膜上的染料,所得有色溶液用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)定590 nm處的吸光度 [27]。這種方法簡(jiǎn)便快捷,適用于試管法及96孔板法形成的生物膜的檢測(cè)。王業(yè)梅等用銀染法動(dòng)態(tài)觀察了銅綠假單胞菌生物被膜的形成及形成后的生物被膜,結(jié)果初步顯示了生物被膜形成的過(guò)程及形成后清晰完整的生物被膜 [28]。銀染法的優(yōu)點(diǎn)是試劑價(jià)格低廉,同時(shí)易于試驗(yàn)操作,試驗(yàn)條件要求不高,并且敏感性較好,普通的微生物實(shí)驗(yàn)室就可進(jìn)行操作。

        2.2 熒光法

        熒光染色劑主要是由SYTO9、碘化丙啶構(gòu)成,SYTO9能夠穿透所有的細(xì)菌膜,使細(xì)胞染為綠色;而碘化丙啶只能穿透受損細(xì)胞的細(xì)胞膜,這樣2個(gè)物質(zhì)結(jié)合反應(yīng),使細(xì)胞染為紅色 [29]。這樣就使觀察細(xì)菌生物膜有了選擇性:通過(guò)觀察不同顏色的細(xì)胞,能夠區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞;另外用熒光標(biāo)記的抗體或凝集素更可以特異性地識(shí)別生物膜中的某些成分而使其顯色 [30]。目前出現(xiàn)了一種新的熒光法——肽核酸(PNA)探針熒光原位雜交技術(shù),能夠檢測(cè)和鑒定慢性傷口生物膜中的細(xì)菌種類及細(xì)菌的分布情況 [31]。PNA探針比DNA探針有更高的疏水性,使其更容易穿透疏水性的細(xì)胞壁,從而進(jìn)入靶細(xì)胞的內(nèi)部。肽核酸熒光原位雜交(PNA FISH)技術(shù)作為一種準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)技術(shù),對(duì)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置條件要求也不高,易于操作。

        2.3 激光共聚焦顯微鏡(CLSM)

        激光共聚焦顯微鏡擁有電鏡和普通光鏡均沒(méi)有的優(yōu)勢(shì),被認(rèn)為是目前研究細(xì)菌較為理想的方法。該方法可以對(duì)細(xì)菌及生物膜中各種成分進(jìn)行不同顏色的熒光染色,且能夠避免對(duì)細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)的破壞;能夠?qū)?xì)菌及其生物膜進(jìn)行無(wú)損傷的連續(xù)斷層掃描,并且所得生物膜的各種平面圖像可以進(jìn)行3D圖像重建。同時(shí)使用激光共聚焦顯微鏡,我們可以對(duì)生物膜的各種指標(biāo)如生物膜的厚度、比表面積、各種熒光的強(qiáng)度等參數(shù)進(jìn)行量化,能夠較為方便地得到細(xì)菌形成生物膜的動(dòng)態(tài)過(guò)程中的各種量化數(shù)據(jù) [32]。激光共聚焦顯微鏡不僅提高了分辨率,顯著改變了視野的深度和廣度,并且其所觀察的樣品無(wú)須進(jìn)行脫水等處理,而且能夠最大程度地保持觀察對(duì)象的完整性,從而使結(jié)果更接近真實(shí)情況。宋菲等采用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)細(xì)菌及生物膜的菌體和多糖成分分別標(biāo)記,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌及其生物膜形成過(guò)程中的多糖形成及細(xì)菌分布情況的觀察,并且這種方法可以在操作過(guò)程中大大降低生物膜的減少與缺損程度 [33]。

        2.4 原子力顯微鏡(AFM)

        原子力顯微鏡是利用微懸臂感受和放大懸臂上尖細(xì)探針與受測(cè)樣品原子之間的作用力而達(dá)到檢測(cè)的目的,具有原子級(jí)的分辨率。由于原子力顯微鏡既可以觀察導(dǎo)體,又可以觀察非導(dǎo)體,從而彌補(bǔ)了電鏡的不足 [34]。與電子顯微鏡相比,原子力顯微鏡有很多優(yōu)勢(shì):樣品制備簡(jiǎn)便,樣品導(dǎo)電與否都適用于該儀器;操作環(huán)境不受限制,既可以在真空,又可以在大氣中進(jìn)行;可以對(duì)所測(cè)區(qū)域的面粗糙度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)等 [35]。Abe等利用原子力顯微鏡來(lái)測(cè)量飲用水中的生物膜;用原子力顯微鏡來(lái)測(cè)量機(jī)械剪應(yīng)力,從而估計(jì)生物膜的糾纏率 [36]。Ansari等利用原子顯微鏡觀察棗蜜對(duì)白色念珠菌的細(xì)胞膜,結(jié)果表明棗蜜可以影響白色念珠菌的細(xì)胞形態(tài)、減少其形成生物膜的厚度 [37]。

        3 清除生物膜的方法

        目前細(xì)菌生物膜已成為人們關(guān)注的話題,而清除細(xì)菌生物膜的方法也已成為人們研究的熱點(diǎn),主要有以下幾點(diǎn)。

        3.1 物理方法

        清除細(xì)菌生物膜的物理方法主要有機(jī)械法、超聲波法、電擊法等。機(jī)械法為最原始的方法,但也是最有效的方法。

        例如每天的刷牙活動(dòng),就是通過(guò)不斷地摩擦而去除牙菌斑;用眼鏡布擦眼鏡也是類似的機(jī)械方法。超聲波可以通過(guò)空穴和起泡作用來(lái)消除生物膜 [38]。朱秀菊研究發(fā)現(xiàn),高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)能在一定程度上殺滅銅綠假單胞菌并且破壞其生物膜結(jié)構(gòu) [39]。HIFU的生物學(xué)效應(yīng)主要是熱效應(yīng)、空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng),而且高強(qiáng)度者殺菌作用強(qiáng)。同樣,Wirthlin等也發(fā)現(xiàn),電擊能夠減少牙模型上污染的細(xì)菌數(shù)量 [40]。Kang等還發(fā)現(xiàn),可以通過(guò)高壓的CO2氣體的絕熱膨脹,使1個(gè)噴嘴中產(chǎn)生的氣溶膠噴射到在硅芯片上已生長(zhǎng)了24h的大腸桿菌的生物膜上,可以明顯清除生物膜 [41]。

        3.2 化學(xué)方法

        化學(xué)方法就是指通過(guò)某些化合物來(lái)清除生物膜,是最常用的清除生物膜的方法。一般用的有酶、活性肽、精油及其他化學(xué)試劑。

        Son等研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞壁降解酶SAL-2對(duì)金黃色葡萄球菌有特異性裂解活性,也包括耐甲氧西林菌株,并且約 1 μg/mL 的最小抑制濃度就可以降解生物膜 [42]。Borges等表明,異硫氰酸酯可以降低大腸桿菌、銅綠假單胞菌的黏附能力,并在生物膜上呈現(xiàn)出較高的電位,以減小由革蘭氏陰性細(xì)菌形成的生物膜質(zhì)量 [43],可以使大腸桿菌降低60%的生物膜活性。五倍子不同提取組分對(duì)5種口腔浮游細(xì)菌均有良好的抑制作用,其中五倍子多酚性化合物、五倍子B對(duì)5種口腔生物膜細(xì)菌的抑制作用最好,其次為五倍子C、五倍子D [44]。

        乳鐵蛋白對(duì)銅綠假單胞菌有殺菌活性,同時(shí)還能抑制其生物被膜的形成,其作用與濃度呈正相關(guān);FeCl3促進(jìn)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)和生物被膜的形成;乳鐵蛋白與鐵結(jié)合后,對(duì)其生物被膜的形成有抑制作用 [45]。納米銀離子對(duì)表皮葡萄球菌的生物膜形成和形態(tài)、結(jié)構(gòu)的完整性有抑制作用,但是隨著時(shí)間的推移,其抗菌作用逐漸減弱。高濃度組較低濃度組抗菌效果更加明顯,持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng) [46]。

        3.3 協(xié)同方法

        所謂協(xié)同方法,就是將物理方法與化學(xué)方法或物理方法或其他的一些方法所結(jié)合起來(lái)的方法。Oulahal-Lagsir等通過(guò)嘗試將超聲波、蛋白水解酶、糖酵解酶制劑互相配合來(lái)清除生物膜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們之間具有協(xié)同效果,可以清除61%~96%的細(xì)菌生物膜,效果是單獨(dú)超聲波處理(30%)的2~3倍 [47]。

        除此之外,Pechaud等將酶和機(jī)械(剪切應(yīng)力)一起應(yīng)用來(lái)處理異養(yǎng)需氧生物膜,發(fā)現(xiàn)最佳剪切應(yīng)力為2.5 Pa,以便最大限度地使生物膜脫落,同時(shí)避免由于機(jī)械處理而出現(xiàn)壓縮現(xiàn)象 [48]。這樣協(xié)同處理比單獨(dú)酶處理增加了80%的生物膜去除量(COD),并且能夠除去基底層的生物膜。

        國(guó)內(nèi)也有學(xué)者發(fā)現(xiàn),低頻超聲、環(huán)丙沙星單獨(dú)作用對(duì)銅綠假單胞菌的生物膜無(wú)殺菌作用;低頻超聲聯(lián)合環(huán)丙沙星后,對(duì)生物膜有很好的殺菌作用,而且低頻超聲對(duì)銅綠假單胞菌的生物膜結(jié)構(gòu)無(wú)影響,聯(lián)合環(huán)丙沙星后,能破壞生物膜的結(jié)構(gòu) [49]。

        4 結(jié)論

        細(xì)菌生物膜是細(xì)菌為了適應(yīng)新的生存環(huán)境而存在的,有很強(qiáng)的耐藥性。對(duì)細(xì)菌生物膜耐藥機(jī)制的了解,有利于更合理地選擇抗生素,有效地控制好臨床感染。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展,新的理論不斷被提出,我們有理由相信,將來(lái)可以很好地解決細(xì)菌生物膜這一問(wèn)題。清除生物膜的發(fā)展趨勢(shì)表現(xiàn)為:(1)我國(guó)資源豐富,今后應(yīng)更深入地探索一些天然活性物質(zhì)來(lái)清除生物膜;(2)生物方法目前還很少,可以探索一些如噬菌體等新的生物方法來(lái)抑制生物膜的生長(zhǎng);(3)目前微膠囊比較新穎,可以利用微膠囊定向靶位和控制釋放等優(yōu)點(diǎn)來(lái)清除生物膜。

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