崔海英+張雪婧+趙呈婷等

摘要： 細(xì)菌生物膜是一種包裹在細(xì)胞外多聚物基質(zhì)中的、黏附于有生命或無(wú)生命物體表面的細(xì)菌群體，相對(duì)于游離狀態(tài)的細(xì)菌，生物膜狀態(tài)下的耐藥性更強(qiáng)，給臨床治療帶來(lái)困難。近年來(lái)，細(xì)菌生物膜的研究得到了迅速發(fā)展，細(xì)菌生物膜的檢測(cè)技術(shù)及清除方法日益完善且效果更佳。本文介紹了細(xì)菌生物膜研究的最新進(jìn)展，包括細(xì)菌生物膜的耐藥機(jī)理、檢測(cè)技術(shù)、清除方法，并對(duì)生物膜的清除進(jìn)行了展望，為研究細(xì)菌耐藥性、控制生物膜感染提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 細(xì)菌生物膜；耐藥機(jī)理；檢測(cè)技術(shù)；清除方法

中圖分類號(hào)： Q936 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0011-04[HS）]

抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)，給臨床治療帶來(lái)困難。美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心的專家研究表明，65%～80%的人類細(xì)菌感染與生物膜相關(guān)，50%的院內(nèi)感染與醫(yī)療器械裝置上的生物膜相關(guān)聯(lián) [1-2]。在惰性表面形成生物膜后，生物膜保護(hù)細(xì)菌免受宿主的獲得性免疫應(yīng)答以及吞噬細(xì)胞的捕食，使其耐藥性提高10～1 000倍 [3]，引起了人們極大的關(guān)注。

細(xì)菌生物膜（bacterial biofilm，BBF）是指細(xì)菌為了適應(yīng)生存環(huán)境，黏附于有生命或無(wú)生命物體表面后，被細(xì)菌胞外自身產(chǎn)生的多聚物基質(zhì)包裹的有組織的細(xì)菌群體 [4-5]。細(xì)菌生物膜中水分含量可高達(dá)97%；除了水和細(xì)菌外，生物膜中還含有蛋白質(zhì)、多糖、肽聚糖、DNA、脂、磷脂等物質(zhì) [6]。本文就細(xì)菌生物膜的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，涉及細(xì)菌生物膜的耐藥機(jī)理、檢測(cè)技術(shù)以及清除方法，并對(duì)細(xì)菌生物膜清除方法的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 細(xì)菌生物膜的耐藥機(jī)理

1.1 細(xì)菌生物膜的屏障作用

細(xì)菌吸附在惰性表面后，自身會(huì)產(chǎn)生大量的多糖、脂類等多聚物包裹在細(xì)菌外，從而形成了1層天然的屏障，這是生物膜的顯著特點(diǎn)之一，這種特點(diǎn)可以防止抗生素嵌入在細(xì)菌外壁上。革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌）比革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞膜外多1層細(xì)胞外膜（多聚糖），就可以有效阻止抗生素的進(jìn)入，或降低進(jìn)入藥物的殺菌性。Suci等利用紅外光譜研究表明，抗生素環(huán)丙沙星滲透進(jìn)生物膜的速度與滲透進(jìn)游離細(xì)菌內(nèi)部的速度相比有明顯降低，這是由于部分環(huán)丙沙星被結(jié)合到生物膜組分中 [7]。還有研究表明，胞外多糖是帶負(fù)電荷的，會(huì)吸收多肽鏈中帶正電荷的氨基側(cè)鏈，形成1道屏障，從而阻礙親水性的抗生素滲透入菌體發(fā)揮殺菌作用，使抗生素的殺菌能力顯著降低 [8]。

但是現(xiàn)在有越來(lái)越多的試驗(yàn)證明，屏障作用不是生物膜的主要耐藥機(jī)理。Walters等研究表明，氟喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星是能夠穿透銅綠假單胞菌生物膜的 [9]。Anderl等發(fā)現(xiàn)，盡管環(huán)丙沙星、氨芐青霉素可以穿透整個(gè)有β-內(nèi)酰胺酶突變體的肺炎克雷伯菌生物膜，但是這個(gè)突變體仍然耐氨芐青霉素 [10]。

1.2 細(xì)菌生物膜中表型的表達(dá)

一些細(xì)菌為了適應(yīng)環(huán)境的改變，特定的基因表達(dá)能夠使它們具有耐藥性。生物膜細(xì)菌聚集、黏附以后，為了適應(yīng)新的生存環(huán)境，特定的基因表達(dá)發(fā)生變化，使生物學(xué)行為發(fā)生改變，這稱為生物膜表型。細(xì)菌特有的表型能夠激發(fā)出生物膜的耐藥機(jī)理，Beaudoin等發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌ndvB基因與細(xì)胞外多聚糖的形成有關(guān) [11]，如果表達(dá)水平上發(fā)生了改變，多聚糖的形成會(huì)發(fā)生變化，就會(huì)導(dǎo)致抗生素遠(yuǎn)離生物膜外特定的靶細(xì)胞或者與其發(fā)生螯合反應(yīng)，從而降低了抗生素的作用，提高了生物膜的耐藥性。

另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌擁有編碼群體感應(yīng)的2個(gè)重要調(diào)節(jié)基因 LuxS、pga操縱子，在生物膜中表達(dá)有所增強(qiáng)，會(huì)引起信號(hào)合成酶、β-1-6-N-乙酰-葡聚糖胺合成酶增多，使初始黏附和生物膜成熟效果增加，導(dǎo)致生物膜中的菌株表現(xiàn)出強(qiáng)的耐藥性。人工去除細(xì)菌中的luxS基因，會(huì)使所培養(yǎng)的浮游菌株耐藥性降低，而生物膜菌株耐藥性下降不是很明顯，表明耐藥性并不是單一的耐藥性基因所控制的 [12]。

1.3 細(xì)菌生物膜的抗生素外排泵系統(tǒng)

抗生素外排泵系統(tǒng)就是指細(xì)菌能夠產(chǎn)生外排系統(tǒng)將進(jìn)入細(xì)胞生物膜的抗生素排出體外，這是細(xì)菌自我保護(hù)的一種手段。自從1980年McMurray等首次提出主動(dòng)外排系統(tǒng)是大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的基本耐藥機(jī)理之后，主動(dòng)外排系統(tǒng)得到了廣泛深入的研究。Mah認(rèn)為，銅綠假單胞菌基因組中有12個(gè)RND外排泵編碼 [13]，主要起耐藥作用的是MexAB-OprM、MexCD-OprJ [14]。Gillis等也發(fā)現(xiàn)，MexCD-OprJ、MexXY基因是銅綠假單胞菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素阿齊霉素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理 [15]。此外，突變?cè)黾覯exAB-OprM外排泵的活性也已被證明是銅綠假單胞菌對(duì)氨基糖苷類抗生素、氟喹諾酮類藥物的主要抗性機(jī)理 [16]。

國(guó)內(nèi)也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，AdeABC外排泵是鮑氏不動(dòng)桿菌的主要外排系統(tǒng)，其過(guò)度表達(dá)可增加對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥性；外排系統(tǒng)adeIJK的過(guò)度表達(dá)與鮑氏不動(dòng)桿菌對(duì)四環(huán)素、氟喹諾酮類、克林霉素類、β-內(nèi)酰胺類等抗菌藥物的耐藥性也有所相關(guān) [17-18]。

1.4 細(xì)菌密度感應(yīng)效應(yīng)（QS）

QS系統(tǒng)是細(xì)菌間信息傳遞的一種機(jī)制，通過(guò)監(jiān)測(cè)其群體的細(xì)胞密度來(lái)調(diào)節(jié)其特定的基因表達(dá)。此外，QS信號(hào)分子的分子量低、化學(xué)種類廣泛，包括：?；呓z氨酸內(nèi)酯、呋喃硼酸酯、順式不飽和脂肪酸和肽 [19]。Cristina等研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌的群體效應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)稱為Agr系統(tǒng)，包括膜結(jié)合蛋白（AgrB）、QS肽（AgrD）、雙組分信號(hào)傳輸系統(tǒng)[包括傳感器組氨酸激酶（AGrC）、響應(yīng)調(diào)節(jié)器（AGrA）] [20]。在銅綠假單胞菌中，QS系統(tǒng)由2個(gè)信號(hào)系統(tǒng)（LasI/LasR、RhlI/RhlR）組成，這2個(gè)信號(hào)系統(tǒng)又分別產(chǎn)生特征性的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯信號(hào)分子、N-丁?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（BHL）、N-（3-氧代十二酰）-L-高絲氨酸內(nèi)酯（OdDHL），一起應(yīng)對(duì)生存環(huán)境的改變。此外，這2個(gè)信號(hào)系統(tǒng)都由LuxI合成酶組成，并負(fù)責(zé)AHL的合成，AHL是細(xì)菌QS系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子，調(diào)節(jié)環(huán)境變化 [21]。此外，賈寧等研究表明，AgrD、RNAⅢ系統(tǒng)在提高紅霉素耐藥性的過(guò)程中起著重要作用 [22]。

1.5 其他機(jī)理

細(xì)菌生物膜耐藥是多種機(jī)理共同參與的結(jié)果，除以上幾種機(jī)理之外，還有營(yíng)養(yǎng)及氧氣的限制 [23]、分泌抗生素水解酶 [24]、免疫防御體制、普遍應(yīng)激反應(yīng) [25-26]等機(jī)制也可影響生物膜的耐藥性。

2 細(xì)菌生物膜的檢測(cè)技術(shù)

2.1 染色法

染色法就是利用生物膜內(nèi)的物質(zhì)能夠與某些染料結(jié)合的性質(zhì)，通過(guò)染色的方法對(duì)細(xì)菌的生物膜進(jìn)行定量，最常見的染色劑為結(jié)晶紫、剛果紅、銀鹽。結(jié)晶紫法的操作為：先用1%的結(jié)晶紫溶液浸潤(rùn)生物膜生成的表面，靜置30 min后，用清水洗去多余的染料，將剩余的水吸干并除去后，用乙醇或乙酸溶液溶解附著于生物膜上的染料，所得有色溶液用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)定590 nm處的吸光度 [27]。這種方法簡(jiǎn)便快捷，適用于試管法及96孔板法形成的生物膜的檢測(cè)。王業(yè)梅等用銀染法動(dòng)態(tài)觀察了銅綠假單胞菌生物被膜的形成及形成后的生物被膜，結(jié)果初步顯示了生物被膜形成的過(guò)程及形成后清晰完整的生物被膜 [28]。銀染法的優(yōu)點(diǎn)是試劑價(jià)格低廉，同時(shí)易于試驗(yàn)操作，試驗(yàn)條件要求不高，并且敏感性較好，普通的微生物實(shí)驗(yàn)室就可進(jìn)行操作。

2.2 熒光法

熒光染色劑主要是由SYTO9、碘化丙啶構(gòu)成，SYTO9能夠穿透所有的細(xì)菌膜，使細(xì)胞染為綠色；而碘化丙啶只能穿透受損細(xì)胞的細(xì)胞膜，這樣2個(gè)物質(zhì)結(jié)合反應(yīng)，使細(xì)胞染為紅色 [29]。這樣就使觀察細(xì)菌生物膜有了選擇性：通過(guò)觀察不同顏色的細(xì)胞，能夠區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞；另外用熒光標(biāo)記的抗體或凝集素更可以特異性地識(shí)別生物膜中的某些成分而使其顯色 [30]。目前出現(xiàn)了一種新的熒光法——肽核酸（PNA）探針熒光原位雜交技術(shù)，能夠檢測(cè)和鑒定慢性傷口生物膜中的細(xì)菌種類及細(xì)菌的分布情況 [31]。PNA探針比DNA探針有更高的疏水性，使其更容易穿透疏水性的細(xì)胞壁，從而進(jìn)入靶細(xì)胞的內(nèi)部。肽核酸熒光原位雜交（PNA FISH）技術(shù)作為一種準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置條件要求也不高，易于操作。

2.3 激光共聚焦顯微鏡（CLSM）

激光共聚焦顯微鏡擁有電鏡和普通光鏡均沒(méi)有的優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是目前研究細(xì)菌較為理想的方法。該方法可以對(duì)細(xì)菌及生物膜中各種成分進(jìn)行不同顏色的熒光染色，且能夠避免對(duì)細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)的破壞；能夠?qū)?xì)菌及其生物膜進(jìn)行無(wú)損傷的連續(xù)斷層掃描，并且所得生物膜的各種平面圖像可以進(jìn)行3D圖像重建。同時(shí)使用激光共聚焦顯微鏡，我們可以對(duì)生物膜的各種指標(biāo)如生物膜的厚度、比表面積、各種熒光的強(qiáng)度等參數(shù)進(jìn)行量化，能夠較為方便地得到細(xì)菌形成生物膜的動(dòng)態(tài)過(guò)程中的各種量化數(shù)據(jù) [32]。激光共聚焦顯微鏡不僅提高了分辨率，顯著改變了視野的深度和廣度，并且其所觀察的樣品無(wú)須進(jìn)行脫水等處理，而且能夠最大程度地保持觀察對(duì)象的完整性，從而使結(jié)果更接近真實(shí)情況。宋菲等采用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)細(xì)菌及生物膜的菌體和多糖成分分別標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌及其生物膜形成過(guò)程中的多糖形成及細(xì)菌分布情況的觀察，并且這種方法可以在操作過(guò)程中大大降低生物膜的減少與缺損程度 [33]。

2.4 原子力顯微鏡（AFM）

原子力顯微鏡是利用微懸臂感受和放大懸臂上尖細(xì)探針與受測(cè)樣品原子之間的作用力而達(dá)到檢測(cè)的目的，具有原子級(jí)的分辨率。由于原子力顯微鏡既可以觀察導(dǎo)體，又可以觀察非導(dǎo)體，從而彌補(bǔ)了電鏡的不足 [34]。與電子顯微鏡相比，原子力顯微鏡有很多優(yōu)勢(shì)：樣品制備簡(jiǎn)便，樣品導(dǎo)電與否都適用于該儀器；操作環(huán)境不受限制，既可以在真空，又可以在大氣中進(jìn)行；可以對(duì)所測(cè)區(qū)域的面粗糙度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)等 [35]。Abe等利用原子力顯微鏡來(lái)測(cè)量飲用水中的生物膜；用原子力顯微鏡來(lái)測(cè)量機(jī)械剪應(yīng)力，從而估計(jì)生物膜的糾纏率 [36]。Ansari等利用原子顯微鏡觀察棗蜜對(duì)白色念珠菌的細(xì)胞膜，結(jié)果表明棗蜜可以影響白色念珠菌的細(xì)胞形態(tài)、減少其形成生物膜的厚度 [37]。

3 清除生物膜的方法

目前細(xì)菌生物膜已成為人們關(guān)注的話題，而清除細(xì)菌生物膜的方法也已成為人們研究的熱點(diǎn)，主要有以下幾點(diǎn)。

3.1 物理方法

清除細(xì)菌生物膜的物理方法主要有機(jī)械法、超聲波法、電擊法等。機(jī)械法為最原始的方法，但也是最有效的方法。

例如每天的刷牙活動(dòng)，就是通過(guò)不斷地摩擦而去除牙菌斑；用眼鏡布擦眼鏡也是類似的機(jī)械方法。超聲波可以通過(guò)空穴和起泡作用來(lái)消除生物膜 [38]。朱秀菊研究發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度聚焦超聲（HIFU）能在一定程度上殺滅銅綠假單胞菌并且破壞其生物膜結(jié)構(gòu) [39]。HIFU的生物學(xué)效應(yīng)主要是熱效應(yīng)、空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)，而且高強(qiáng)度者殺菌作用強(qiáng)。同樣，Wirthlin等也發(fā)現(xiàn)，電擊能夠減少牙模型上污染的細(xì)菌數(shù)量 [40]。Kang等還發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)高壓的CO2氣體的絕熱膨脹，使1個(gè)噴嘴中產(chǎn)生的氣溶膠噴射到在硅芯片上已生長(zhǎng)了24h的大腸桿菌的生物膜上，可以明顯清除生物膜 [41]。

3.2 化學(xué)方法

化學(xué)方法就是指通過(guò)某些化合物來(lái)清除生物膜，是最常用的清除生物膜的方法。一般用的有酶、活性肽、精油及其他化學(xué)試劑。

Son等研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁降解酶SAL-2對(duì)金黃色葡萄球菌有特異性裂解活性，也包括耐甲氧西林菌株，并且約 1 μg/mL 的最小抑制濃度就可以降解生物膜 [42]。Borges等表明，異硫氰酸酯可以降低大腸桿菌、銅綠假單胞菌的黏附能力，并在生物膜上呈現(xiàn)出較高的電位，以減小由革蘭氏陰性細(xì)菌形成的生物膜質(zhì)量 [43]，可以使大腸桿菌降低60%的生物膜活性。五倍子不同提取組分對(duì)5種口腔浮游細(xì)菌均有良好的抑制作用，其中五倍子多酚性化合物、五倍子B對(duì)5種口腔生物膜細(xì)菌的抑制作用最好，其次為五倍子C、五倍子D [44]。

乳鐵蛋白對(duì)銅綠假單胞菌有殺菌活性，同時(shí)還能抑制其生物被膜的形成，其作用與濃度呈正相關(guān)；FeCl3促進(jìn)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)和生物被膜的形成；乳鐵蛋白與鐵結(jié)合后，對(duì)其生物被膜的形成有抑制作用 [45]。納米銀離子對(duì)表皮葡萄球菌的生物膜形成和形態(tài)、結(jié)構(gòu)的完整性有抑制作用，但是隨著時(shí)間的推移，其抗菌作用逐漸減弱。高濃度組較低濃度組抗菌效果更加明顯，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng) [46]。

3.3 協(xié)同方法

所謂協(xié)同方法，就是將物理方法與化學(xué)方法或物理方法或其他的一些方法所結(jié)合起來(lái)的方法。Oulahal-Lagsir等通過(guò)嘗試將超聲波、蛋白水解酶、糖酵解酶制劑互相配合來(lái)清除生物膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們之間具有協(xié)同效果，可以清除61%～96%的細(xì)菌生物膜，效果是單獨(dú)超聲波處理（30%）的2～3倍 [47]。

除此之外，Pechaud等將酶和機(jī)械（剪切應(yīng)力）一起應(yīng)用來(lái)處理異養(yǎng)需氧生物膜，發(fā)現(xiàn)最佳剪切應(yīng)力為2.5 Pa，以便最大限度地使生物膜脫落，同時(shí)避免由于機(jī)械處理而出現(xiàn)壓縮現(xiàn)象 [48]。這樣協(xié)同處理比單獨(dú)酶處理增加了80%的生物膜去除量（COD），并且能夠除去基底層的生物膜。

國(guó)內(nèi)也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，低頻超聲、環(huán)丙沙星單獨(dú)作用對(duì)銅綠假單胞菌的生物膜無(wú)殺菌作用；低頻超聲聯(lián)合環(huán)丙沙星后，對(duì)生物膜有很好的殺菌作用，而且低頻超聲對(duì)銅綠假單胞菌的生物膜結(jié)構(gòu)無(wú)影響，聯(lián)合環(huán)丙沙星后，能破壞生物膜的結(jié)構(gòu) [49]。

4 結(jié)論

細(xì)菌生物膜是細(xì)菌為了適應(yīng)新的生存環(huán)境而存在的，有很強(qiáng)的耐藥性。對(duì)細(xì)菌生物膜耐藥機(jī)制的了解，有利于更合理地選擇抗生素，有效地控制好臨床感染。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，新的理論不斷被提出，我們有理由相信，將來(lái)可以很好地解決細(xì)菌生物膜這一問(wèn)題。清除生物膜的發(fā)展趨勢(shì)表現(xiàn)為：（1）我國(guó)資源豐富，今后應(yīng)更深入地探索一些天然活性物質(zhì)來(lái)清除生物膜；（2）生物方法目前還很少，可以探索一些如噬菌體等新的生物方法來(lái)抑制生物膜的生長(zhǎng)；（3）目前微膠囊比較新穎，可以利用微膠囊定向靶位和控制釋放等優(yōu)點(diǎn)來(lái)清除生物膜。

參考文獻(xiàn)：

[1] Paredes J，Alonso-Arce M，Schmidt C，et al. Smart central venous port for early detection of bacterial biofilm related infections[J]. Biomedical Microdevices，2014，16（3）：365-374.

[2]Epstein A K，Hochbaum A I，Philseok K，et al. Control of bacterial biofilm growth on surfaces by nanostructural mechanics and geometry[J]. Nanotechnology，2011，22（49）：494007-494014.

[3]Ehrlich G D，Ahmed A，Earl J，et al. The distributed genome hypothesis as a rubric for understanding evolution in situ during chronic bacterial biofilm infectious processes[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology，2010，59（3）：269-279.

[4]Hiby N. A personal history of research on microbial biofilms and biofilm infections[J]. Pathogens and Disease，2014，70（3）：205-211.

[5]Donlan R M，Costerton J W. Biofilms：survival mechanisms of clinically relevant microorganisms[J]. Clinical Microbiology Reviews，2002，15（2）：167-193.

[6]García A B，Percival S L. Zoonotic infections：The role of biofilms[J]. Biofilms and Veterinary Medicine，2011，6：69-110.

[7]Suci P A，Mittelman M W，Yu F P，et al. Investigation of ciprofloxacin penetration into Pseudomonas aeruginosa biofilms[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1994，38（9）：2125-2133.

[8]陳鐵柱，李曉聲，曾文魁，等. 細(xì)菌生物膜耐藥機(jī)制的研究與進(jìn)展[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（12）：2205-2208.

[9]Walters M C，Roe F，Bugnicourt A，et al. Contributions of antibiotic penetration，oxygen limitation，and low metabolic activity to tolerance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to ciprofloxacin and tobramycin[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2003，47（1）：317-323.

[10] Anderl J N，F(xiàn)ranklin M J，Stewart P S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2000，44（7）：1818-1824.

[11]Beaudoin T，Zhang Li，Hinz A J，et al. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms[J]. Journal of Bacteriology，2012，194（12）：3128-3136.

[12]孫鳳軍. 大腸桿菌生物膜的形成及其耐藥質(zhì)粒傳遞和調(diào)控的研究[D]. 重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2009.

[13]Mah T F. Biofilm-specific antibiotic resistance[J]. Future Microbiology，2012，7（9）：1061-1072.

[14]de Kievit T R，Parkins M D，Gillis R J，et al. Multidrug efflux pumps：expression patterns and contribution to antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2001，45（6）：1761-1770.

[15]Gillis R J， White K G. Molecular basis of azithromycin-resistant Pseudomonas aeruginosa biofilms[J]. Antimicrobial agents and chemotherapy，2005，49（9）：3858-3867.

[16]Islam S，Oh H，Jalal S，et al. Chromosomal mechanisms of aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis patients[J]. Clinical Microbiology and Infection，2009，15（1）：60-66.

[17]李 明，王 超，劉躍平，等. 鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，22（4）：449-452.

[18]楊鳳春，任愛民. 主動(dòng)外排泵系統(tǒng)介導(dǎo)鮑氏不動(dòng)桿菌多藥耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22（11）：2478-2480.

[19]Chopp D L，Kirisits M J，Moran B，et al. A mathematical model of quorum sensing in a growing bacterial biofilm[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2002，29（6）：339-346.

[20]Cristina S G，Maite E，Inigo L. Biofilm dispersion and quorum sensing[J]. Current Opinion in Microbiology，2014，18：96-104.

[21]Jolivet-Gougeon A，Bonnaure-Mallet M. Biofilms as a mechanism of bacterial resistance[J]. Drug Discovery Today Technologies，2014，11：49-56.

[22]賈 寧，徐志凱，袁云娥，等. 表皮葡萄球菌全面調(diào)節(jié)子的表達(dá)在生物被膜耐藥性中的作用[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（7）：600-602.

[23]Van Acker H，van Dijck P，Coenye T. Molecular mechanisms of antimicrobial tolerance and resistance in bacterial and fungal biofilms[J]. Trends in Microbiology，2014，22（6）：326-333.

[24]Cloete T E. Resistance mechanisms of bacteria to antimicrobial compounds[J]. International Biodeterioration & Biodegradation，2003，51（4）：277-282.

[25]Stewart P S. Mechanisms of antibiotic resistance in bacterial biofilms[J]. International Journal of Medical Microbiology，2002，292（2）：107-113.

[26]Hiby N，Bjarnsholt T，Givskov M，et al. Antibiotic resistance of bacterial biofilms[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，2010，35（4）：322-332.

[27]楊 朵，張 正. 兩種檢測(cè)肺炎克雷伯菌生物膜方法的比較[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2008，12（10）：1297-1298.

[28]王業(yè)梅，程惠娟，朱小明.銀染法觀察銅綠假單胞菌生物被膜[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2012，24（12）：1078-1079.

[29]Wu P G，Imlay J A，Shang J K. Mechanism of escherichia coli inactivation on palladium-modified nitrogen-doped Titanium dioxide[J]. Biomaterials，2010，31（29）：7526-7533.

[30]何永貴. 肽核酸熒光原位雜交技術(shù)：1種檢測(cè)慢性傷口感染生物膜的新工具[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（1）：85-86.

[31]李京寶，韓 峰，于文功. 細(xì)菌生物膜研究技術(shù)[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2007，47（3）：558-561.

[32]Shukla S K，Rao T S. Effect of calcium on Staphylococcus aureus biofilm architecture：a confocal laser scanning microscopic study[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2013，103：448-454.

[33]宋 菲，向 軍，陸樹良. 激光共聚焦顯微鏡和改良微孔板法觀察細(xì)菌生物膜形成[J]. 中國(guó)感染與化療雜志，2010，10（5）：368-372.

[34]Ushiki T，Hitomi J，Ogura S，et al. Atomic force microscopy in histology and cytology[J]. Archives of Histology and Cytology，1996，59（5）：421-431.

[35]劉歲林，田云飛，陳 紅，等. 原子力顯微鏡原理與應(yīng)用技術(shù)[J]. 現(xiàn)代儀器，2006，12（6）：9-12.

[36]Abe Y，Skali-Lami S，Block J C，et al. Cohesiveness and hydrodynamic properties of young drinking water biofilms[J]. Water Research，2012，46（4）：1155-1166.

[37]Ansari M J，Al-Ghamdi A，Usmani S，et al. Effect of jujube honey on Candida albicans growth and biofilm formation[J]. Archives of Medical Research，2013，44（5）：352-360.

[38]段高飛，韓 峰，李京寶，等. 細(xì)菌生物膜相關(guān)感染的防治方法研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，40（5）：107-111.

[39]朱秀菊. 高強(qiáng)度聚焦超聲對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的影響[D]. 重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2011.

[40]Wirthlin M R，Gasper C，Hoover C I. Electrically enhanced biofilm removal in a contaminated model dental unit waterline[J]. The Journal of the Western Society of Periodontology/Periodontal Abstracts，2011，59（1）：4-9.

[41]Kang M Y，Jeong H W，Kim J，et al. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols[J]. Journal of Aerosol Science，2010，41（11）：1044-1051.

[42]Son J S，Lee S J，Jun S Y，et al. Antibacterial and biofilm removal activity of a podoviridae Staphylococcus aureus bacteriophage SAP-2 and a derived recombinant cell-wall-degrading enzyme[J]. [JP2]Applied Microbiology and Biotechnology，2010，86（5）：1439-1449.

[43][JP2]Borges A，Simes L C，Saavedra M J，et al. The action of selected isothiocyanates on bacterial biofilm prevention and control[J]. International Biodeterioration & Biodegradation，2014，86，Part A：25-33.

[44]趙 今，朱 昞，周學(xué)東，等. 五倍子不同組分對(duì)口腔細(xì)菌生物膜的清除效應(yīng)[J]. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2007，23（1）：23-27.

[45]張書楠，王硯穎，廖素華，等. 鐵離子對(duì)隱形眼鏡上銅綠假單胞菌生物膜的影響[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（11）：1351-1353，1356.

[46]劉維勤，余加林，劉官信，等. 納米銀離子對(duì)表皮葡萄球菌生物膜形成過(guò)程的影響[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2011，23（10）：870-873.

[47]Oulahal-Lagsir N，Martial-Gros A，Bonneau M，et al. “Escherichia coli-milk” biofilm removal from stainless steel surfaces：synergism between ultrasonic waves and enzymes[J]. Biofouling，2003，19（3）：159-168.

[48]Pechaud Y，Marcato-Romain C E，Girbal-Neuhauser E，et al. Combining hydrodynamic and enzymatic treatments to improve multi-species thick biofilm removal[J]. Chemical Engineering Science，2012，80：109-118.

[49]劉立婷.低頻超聲聯(lián)合環(huán)丙沙星對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的殺菌作用及其結(jié)構(gòu)的影響[D]. 重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2011.