杜永華　敖光輝　魏琴等

摘要： 采用雙波長分光光度法和單波長分光光度法測定油樟[Cinnamomum longepaniculatum （Gamble） N Chao]葉中總黃酮含量，采用烘箱貯藏法測定油樟葉總黃酮對豬油、菜籽油的抗氧化活性。結果表明，雙波長分光光度法、單波長分光光度法均可用于油樟葉總黃酮含量的測定，雙波長法的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性、回收率更好，雙波長法測得脫脂油樟葉中總黃酮含量為19 21 mg/g。油樟葉總黃酮對豬油和菜籽油均具有一定的抗氧化活性，且呈濃度依賴性。

關鍵詞： 油樟；黃酮；雙波長分光光度法；抗油脂氧化

中圖分類號： R284 1；O657 32 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0308-03

油樟[Cinnamomum longepaniculatum （Gamble） N Chao]屬樟科樟屬香料植物，為中國特有樹種 ，主產(chǎn)于四川省宜賓市，其葉富含芳香油，已成為香料、醫(yī)藥、日用、化工產(chǎn)品的重要原料來源 [1-2]。目前對油樟葉資源的開發(fā)利用主要以提取芳香油為主，對提取芳香油后殘渣的開發(fā)利用較少，每年有大量廢葉殘渣被隨意拋棄，不僅浪費資源，而且破壞生態(tài)平衡 [3]。油樟葉提取芳香油后的殘渣具有多種生物活性，如抗微生物 [3]、抗癌 [4]、抗炎 [5]、鎮(zhèn)痛 [6]等。目前對提取芳香油后油樟葉渣的化學成分未見報道。黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗癌、抗炎、鎮(zhèn)痛、護肝、抗菌、抗病毒、防止動脈硬化等多種生物活性，被廣泛應用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領域 [7]。黃酮類化合物在抗油脂氧化方面有顯著效果，從植物中提取安全、天然的黃酮類物質(zhì)以取代人工合成抗氧化劑是油脂或含油食品添加劑的發(fā)展趨勢 [8-9]。本研究利用雙波長分光光度法測定油樟葉總黃酮含量，采用烘箱貯藏法測定其抗油脂氧化活性，旨在為綜合開發(fā)利用油樟資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1 1 材料

油樟葉采自四川省宜賓市翠屏區(qū)邱場鄉(xiāng)油樟種植基地。蕓香苷標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080—200707）；豬油（新鮮豬板油經(jīng)高溫濕法熬煉制備）、菜籽油（市售現(xiàn)場壓榨）均不含任何添加劑；其他化學試劑均為分析純。AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；LG-5A 真空冷凍干燥機（上海市離心機機械研究所有限公司）；HH4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市正基儀器有限公司）。

1 2 方法

1 2 1 油樟葉總黃酮的提取 將油樟葉用水上蒸餾法蒸餾3 h除去芳香油，殘渣于60 ℃烘干，粉碎，取60～80目油樟葉粉末，用石油醚（沸程30～60 ℃）索氏抽提1 h脫脂，殘渣 60 ℃ 烘干，稱取脫脂油樟葉粉10 g，加入體積分數(shù)為70%的乙醇300 mL，80 ℃水浴回流提取4 h，過濾濃縮至浸膏，加100 mL水溶解，用100 mL石油醚萃取，取水層定容至500 mL即得油樟葉總黃酮樣品測定液，將測定液用體積分數(shù)為85%的乙醇醇沉（以沉淀形式除去多糖、蛋白、鞣質(zhì)等），過濾，濾液減壓濃縮至膏稠狀，真空冷凍干燥得油樟葉總黃酮粗品。

1 2 2 標準曲線的建立

1 2 2 1 蕓香苷標準溶液的制備 精確稱取120 ℃干燥至恒質(zhì)量的蕓香苷標準品10 0 mg，置于50 mL容量瓶中，加體積分數(shù)為70%的乙醇溶液溶解，用70%乙醇定容至刻度，搖勻即得0 2 mg/mL蕓香苷標準溶液，4 ℃冰箱保存待用。

1 2 2 2 顯色體系及測定方法 參考中國藥典槐花中總黃酮測定方法 [10]，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色體系進行顯色，分別精確吸取不同量的蕓香苷標準溶液或樣品溶液置于25 mL容量瓶中，均加水至6 0 mL，加5% NaNO2鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10% AI（NO3）3溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加1 mol/L NaOH溶液10 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑空白為參比溶液，在不同波長下測定吸光度。

1 2 2 3 測定波長、參比波長的選擇 分別吸取3 mL蕓香苷標準液、3 mL樣品測定溶液，按上述顯色方法顯色，以試劑空白為參比溶液，在400～700 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描，選擇標準品液和樣品溶液顯色絡合物最大共同吸收波長為測定波長，選擇最大吸收波長下端某一點波長為參比波長 [11]。

1 2 2 4 標準曲線的制作 精確吸取蕓香苷標準溶液1 0、2 0、3 0、4 0、5 0、6 0 mL至25 mL容量瓶中，按上述顯色方法顯色后，分別在測定波長和參比波長下測定吸光度，求吸光度差ΔD（D測定波長-D參比波長），以ΔD為縱坐標，質(zhì)量濃度C（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，求出線性回歸方程。以在測定波長處的測定值為單波長分光光度法測定結果。

1 2 3 顯色穩(wěn)定性試驗 吸取樣品溶液2 mL至25 mL容量瓶中，按上述顯色方法顯色后，分別在室溫下放置0、30、60、90、120、150 min后測定吸光度差值ΔD，計算RSD值。

1 2 4 精密度試驗 分別精確吸取3 mL樣品溶液至5個25 mL容量瓶中，按上述顯色方法顯色后，測定吸光度差值ΔD，計算RSD值。

1 2 5 重現(xiàn)性試驗 精確稱取脫脂油樟葉粉末5 g，共5份，按油樟葉總黃酮的提取方法、顯色測定方法操作，分別測定吸光度差值ΔD，計算RSD值。

1 2 6 加標回收率試驗 分別精確吸取3 mL已知濃度的樣品溶液至3個25 mL容量瓶中，各加1 mL蕓香苷標準溶液，按上述顯色方法顯色后，測定吸光度差值ΔD，根據(jù)標準曲線計算溶液濃度，求平均回收率、RSD值。

1 2 7 樣品溶液的測定 精確吸取3 mL樣品溶液至25 mL容量瓶中，按上述顯色方法顯色后，測定吸光度差值ΔD，根據(jù)標準曲線回歸方程計算樣品中總黃酮含量，重復測定5次。

1 2 8 抗油脂氧化試驗 采用烘箱儲藏試驗法 [12]測定，稱取30 g豬油或菜籽油置于50 mL碘量瓶中，按0 08%、016%、0 32%、0 64%質(zhì)量百分比添加油樟葉總黃酮粗品，以0 02% 2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）、0 08%抗壞血酸（維生素C）為陽性對照，以純豬油或菜籽油為空白對照，70 ℃ 加熱攪拌30 min充分混勻，置于（70±1） ℃烘箱中，每隔12 h攪拌1次，并交換在烘箱中的位置，每24 h參照GB/T 5009 37—2003《食用植物油衛(wèi)生標準的分析方法》規(guī)定的方法測定油樣過氧化值（POV）。同時以BHT為協(xié)同增效劑，油樟葉黃酮和BHT分別按油樣質(zhì)量0 16%、0 02%加入油樣進行協(xié)同抗氧化試驗。參考GB 10146—2005《食用動物油脂衛(wèi)生標準》、GB/T 5538—2005《動植物油脂 過氧化值測定》 對豬油、菜籽油POV的規(guī)定，設定豬油、菜籽油氧化誘導終點POV為0 2 g/100 g。將油脂的氧化過程歸為一級反應，其反應方程如下：

[JZ]lnC=-kt+lnC0。

式中：C為油脂氧化后的過氧化值，C0為油脂初始過氧化值，k為速率常數(shù)，t為時間。根據(jù)該方程求出油脂氧化速率常數(shù)k，由回歸方程計算出油脂POV達到0 2 g/100 g時的氧化誘導時間。

抗氧化保護系數(shù)（PF）是添加抗氧化劑的油脂氧化誘導時間與空白油脂的氧化誘導時間之比，表示抗氧化劑的抗油脂氧化作用強弱，PF越高，抗氧化作用越強。評價標準為PF=1，無抗氧化作用；2≥PF>1，有一定抗氧化作用；3≥PF>2，有明顯抗氧化作用；PF>3，有顯著抗氧化作用 [13-14]。

2 結果與分析

2 1 總黃酮含量的測定

由圖1可知，蕓香苷標準品最大吸收波長為510 nm，樣品溶液的最大吸收波長發(fā)生了藍移，為490 nm，二者存在一定差異，可能由于樣品溶液中存在其他干擾成分導致吸收波長藍移。根據(jù)雙波長分光光度法波長選擇原則 [15]，樣品溶液在510 nm處也有較強吸收，選擇510 nm為測定波長，選擇其下端與蕓香苷標準品吸收曲線交叉處的等吸收點585 nm為參比波長。采用雙波長分光光度法、單波長分光光度法測定蕓香苷標準曲線回歸方程的r2分別為0 999 2、0 999 3，二者相近，可見在0 008 0～0 048 0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，2種方法測定蕓香苷的線性均良好（圖2）。雙波長法和單波長法的顯色穩(wěn)定性在0～150 min內(nèi)吸光度變化較大，樣品溶液吸光度RSD分別為7 48%、7 98%；0～60 min內(nèi)，樣品溶液吸光度RSD分別為4 51%、4 91%，表明在顯色0～60 min內(nèi)測定油樟葉總黃酮，2種方法的穩(wěn)定性均較好，但雙波長法優(yōu)于單波長法。精密度、重現(xiàn)性、加標回收率試驗表明，雙波長法RSD均小于單波長法，但2種方法RSD均小于5%，加標平均回收率分別為92 23%、90 11%?？梢姡瑴y定油樟葉總黃酮2種方法顯色60 min內(nèi)穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性、回收率均較好，雙波長法比單波長法更準確可靠。雙波長分光光度法測得脫脂油樟葉總黃酮提取液中總黃酮含量為19 21 mg/g，低于單波長法測得的含量（20 18 mg/g）（表1）。10 g脫脂油樟葉采用醇提法獲得總黃酮粗品382 mg，雙波長法測得其純度為3587 mg/g。孫崇魯?shù)炔捎谜辉囼炑芯苛伺c油樟同屬植物香樟[Cinnamomum camphora （Linn ） Presl]葉中總黃酮的提取工藝，其黃酮提取含量達39 68 mg/g [16]，高于本試驗制備的油樟葉中總黃酮含量，可見油樟葉總黃酮的提取工藝值得進一步研究。

2 2 抗油脂氧化試驗

由圖3、圖4可知，豬油、菜籽油經(jīng)高溫加速誘導后，隨著氧化時間的增加，各組POV值逐漸升高。豬油、菜籽油中添加不同濃度油樟葉總黃酮粗品后，相同時間內(nèi)加抗氧化劑油樣的POV值均低于純油空白組。同一時間下，隨著油樟葉總黃酮粗品添加量的增加，油樣POV值逐漸降低。由表2可知，添加抗氧化劑后，油樣氧化誘導時間、PF值均大于空白純油對照，測試濃度范圍內(nèi)抗氧化劑的PF值均大于1小于2，可見油樟葉總黃酮粗品對豬油、菜籽油均具有一定抗氧化活性，且有明顯劑量效應關系。0 08%油樟總黃酮對豬油、菜籽油的PF值與0 08%維生素C均相近，但較小，表明當油樟葉總黃酮粗品添加量達到0 08%時，其對豬油和菜籽油的抗氧化活性與維生素C相當，但活性較弱。0 32%油樟總黃酮對豬油的PF值與0 02%BHT相近，0 16%油樟總黃酮對菜籽油的PF值與0 02%BHT相近，表明油樟總黃酮對油脂的抗氧化活性與0 02%BHT相當，在豬油中添加量需達到032%，在菜籽油中添加量需達到0 16%。當油樟葉總黃酮添加量高于0 32%時，其對豬油、菜籽油的抗氧化活性強于0 02%BHT。油樟總黃酮低濃度添加量對豬油的PF值小于菜籽油，高濃度添加量（0 64%）則相反，表明油樟總黃酮中低濃度添加量對菜籽油的抗氧化效果好于豬油，高濃度添加量對豬油的抗氧化作用優(yōu)于菜籽油。

3 結論與討論

采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色體系測定樣品中總黃酮含量較為常見，對于組分較復雜的樣品溶液，采用單波長測定方法容易引起干擾，雙波長測定法可消除共存組分的干擾，獲得更高的可靠性 [15，17]。本試驗結果表明，雙波長分光光度法、單波長分光度法的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性、回收率均較好，2種方法均可用于油樟葉總黃酮含量的測定。但單波長測定法的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性、回收率RSD值均高于雙波長測定法，測得樣品中總黃酮含量高于雙波長法，這可能是由于油樟總黃酮提取液中含有較多其他干擾組分，影響了顯色反應體系，造成單波長法的可靠性偏低，測定結果偏高 [18]。測定液顯色后，與蕓香苷標準溶液相比，油樟總黃酮提取液的吸收光譜發(fā)生一定程度藍移，這一現(xiàn)象也表明油樟葉提取液中可能含有較多干擾吸收的組分。因此，對于油樟葉提取液的總黃酮含量測定，采用雙波長法比單波長法能更好地消除復雜組分等背景干擾。雙波長分光光度法測得脫脂油樟葉總黃酮含量為19 21 mg/g，其結果準確可靠，可作為油樟葉總黃酮含量測定方法。黃酮類化合物可通過消除鐵、銅等金屬離子的催化作用來提高氧化反應的活化能，從而阻礙氧化反應；也可將氫供給脂肪自由基（R·）和過氧化自由基（ROO·）后轉變?yōu)榉踊杂苫ˋ·），分別生成脂肪分子（RH）、氫過氧化物（ROOH），酚基自由基能降低自動氧化連鎖反應速度，從而抑制油脂進一步氧化 [18]。本試驗結果表明，油樟葉總黃酮對豬油、菜籽油均有一定抗氧化作用，具有一定量效關系。0 08%維生素C對豬油、菜籽油的抗氧化活性均較弱，可能是由于維生素C屬水溶性抗氧化劑，在油脂中溶解度低，有效濃度低導致抗油脂氧化活性弱。0 32%油樟總黃酮與0 02%BHT對豬油抗氧化作用相當，0 16%油樟總黃酮與0 02%BHT對菜籽油抗氧化作用相當；當油樟葉總黃酮添加量高于0 32%時，其對豬油、菜籽油的抗氧化活性均強于0 02%BHT。油樟總黃酮與BHT聯(lián)合使用具有協(xié)同抗豬油、抗菜籽油氧化作用。

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