路堯，嚴(yán)沁，盧春（南京醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系，江蘇 南京 210029）

IκBα顯性負(fù)相重組慢病毒載體的構(gòu)建及其在 NF-κB信號(hào)通路中的功能驗(yàn)證

路堯，嚴(yán)沁，盧春
（南京醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系，江蘇 南京 210029）

目的：構(gòu)建表達(dá) IκBα顯性負(fù)相結(jié)構(gòu)（dominant-negative construct，IκBα-DN）的重組慢病毒載體，并檢測(cè)其對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)通路的影響。方法：PCR擴(kuò)增 IκBα-DN片段并插入至 pCDHCMV-MCS-EF1-copGFP載體中。將構(gòu)建的 pCDH-IκBα-DN重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒 psPAX2和包膜質(zhì)粒 pMD2.G共同轉(zhuǎn)染 293 T細(xì)胞，包裝表達(dá) IκBα-DN的重組慢病毒，并用梯度稀釋法檢測(cè)病毒滴度。以慢病毒 IκBα-DN感染 293 T細(xì)胞，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)IκBα蛋白的表達(dá)量。將慢病毒 IκBα-DN感染已轉(zhuǎn)染有 NF-κB蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的 293 T細(xì)胞，24 h后檢測(cè) IκBα-DN對(duì) NF-κB活性的影響。進(jìn)一步用慢病毒 IκBα-DN感染表達(dá)卡波氏肉瘤病毒（Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）編碼的病毒FLICE抑制蛋白（viral FLICE inhibitory protein，vFLIP）的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），以檢測(cè) IκBα-DN在 NF-κB信號(hào)通路中的功能。結(jié)果：限制性內(nèi)切酶鑒定以及核酸序列比對(duì)證實(shí)重組質(zhì)粒 pCDH-IκBα-DN構(gòu)建成功。通過(guò)三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)包裝表達(dá) IκBα-DN的重組慢病毒，病毒滴度約為 3×107efu/mL。以慢病毒 IκBα-DN感染 293 T細(xì)胞，免疫印跡結(jié)果表明胞質(zhì)中 IκBα蛋白的表達(dá)量明顯升高。蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，重組慢病毒介導(dǎo)的 IκBα-DN能有效抑制 NF-κB的活性。在表達(dá)KSHV vFLIP的 HUVECs中，IκBα-DN也能顯著減弱 NF-κB通路信號(hào)。結(jié)論:成功構(gòu)建的含IκBα-DN序列的慢病毒能夠有效地感染293 T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，且初步結(jié)果提示 IκBα-DN能增加胞質(zhì)內(nèi) IκBα的含量，并進(jìn)一步抑制 NF-κB信號(hào)的傳遞。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB；IκBα；顯性負(fù)相結(jié)構(gòu)；慢病毒；卡波氏肉瘤病毒

［Abstract］Objective:To construct the recombinant lentivirus carrying the dominant-negative construct of IκBα（IκBα-DN），and identify the role in NF-κB signaling pathway.Methods:The fragment of IκBα-DN sequence from expression vector pMIGR1-IκBα-DN was cloned into the lentivirus vector pCDH-CMVMCS-EF1-copGFP.The recombinant plasmid pCDH-IκBα-DN，packaging vector psPAX2 and envelope vector pMD2.G were co-transfected into 293 T cells.The transfection efficiency was determined by observing the expression of green fluorescent protein（GFP）.The total of 293 T cells were transduced with Lentivirus-IκBα-DN in the same multiplicity of infection（MOI）and IκBα protein was detected by Western blot. Next，Lentivirus-IκBα-DN was transduced into 293 T cells transfected with NF-κB luciferase reporter plasmid before and then the activity of NF-κB was detected.Similarly，human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）expressing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus（KSHV）encoding viral FLICE inhibitory protein（vFLIP）were infected with Lentivirus-IκBα-DN and the expression of IκBα protein was determined by Western blot.Results:The recombinant plasmid pCDH-IκBα-DN and the recombinant lentivirus carry-ing IκBα-DN were constructed successfully in succession.The titer of Lentivirus-IκBα-DN was 3×107efu/ mL.The expression of cytoplasmic IκBα protein in 293 T cells infected by Lentivirus-IκBα-DN was significantly increased.Further，the result of luciferase reporter assay indicated that Lentivirus-IκBα-DN inhibited the activity of NF-κB.The same result was found in HUVECs expressing vFLIP and infected by Lentivirus-IκBα-DN.Conclusion:The recombinant lentivirus containing IκBα-DN was successfully constructed，and was able to infect 293 T cells and HUVECs effectively.Our date indicated that IκBα-DN could increase the content of IκBα in cytoplasm，and further inhibit NF-κB signaling.

［Key words］NF-κB；IκBα；dominant-negative construct；recombinant lentivirus；Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus

核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的抑制性蛋白（inhibitor kappa B，IκB）家族包括8個(gè)成員，分別是p100、p105、IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBε、Bcl-3和 IκB-R［1］。NF-κB以 p50/p65異二聚體形式普遍存在于細(xì)胞質(zhì)中，與 IκBα結(jié)合而呈失活狀態(tài)［2］。經(jīng)多種刺激劑激活，IκBα被磷酸化與降解，使得NF-κB與 IκBα解離轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，并與靶基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上的 κB位點(diǎn)結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)參與調(diào)控細(xì)胞存活、增殖、分化以及血管生成等許多重要的生物學(xué)過(guò)程［3-6］。

卡波氏肉瘤病毒 （Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）是一種 γ2型皰疹病毒［7］，是卡波氏肉瘤（Kaposi's sarcoma，KS）的病原體［8］。KS以血管異常增生為主要特征，常發(fā)于皮膚并可累及黏膜淋巴結(jié)和內(nèi)臟器官［9］。KSHV編碼的多種蛋白具有致瘤效應(yīng)，如 K2基因編碼的病毒白細(xì)胞介素6 （viral interleukin-6，vIL-6）、K9基因編碼的病毒干擾素調(diào)節(jié)因子1（viral interferon regulatory factor 1，vIRF-1）以及 K13基因編碼的病毒 Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（viral FLICE inhibitory protein，vFLIP）等［9-10］。其中致瘤蛋白 vFLIP在潛伏期表達(dá)［10］，可與 IκB激酶復(fù)合物（inhibitor of kappa B kinase complex，IKK）相互作用并激活 NF-κB信 號(hào) 通 路［11-13］。為 研 究 NF-κB信 號(hào) 通 路 在vFLIP致瘤過(guò)程中的作用，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了能夠抑制IκBα磷酸化并阻止 NF-κB入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能的IκBα顯性負(fù)相結(jié)構(gòu)（dominant-negative construct，IκBα-DN）重組慢病毒載體，從而為闡明 KSHV的感染和致瘤機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)中所用的慢病毒包裝系統(tǒng)由3種質(zhì)粒構(gòu)成，分別為包裝質(zhì)粒 psPAX2、包膜質(zhì)粒 pMD2.G以及慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP。真核表達(dá)質(zhì)粒 pMIGR1-IκBα-DN，蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中所用NF-κB蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK為本實(shí)驗(yàn)室保存。實(shí)驗(yàn)中所用人胚腎上皮細(xì)胞（293 T細(xì)胞）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）均在37℃、5％ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別生長(zhǎng)于含有10％和20％滅活胎牛血清（美國(guó) Gibco公司產(chǎn)品）的 DMEM中（美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品），培養(yǎng)基中加入慶大霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）和青霉素（100 U/mL）。

1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)中的 PCR引物由蘇州金唯智科技有限公司合成；PCR酶購(gòu)自南京諾唯贊科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒及凝膠純化試劑盒為美國(guó)Omega公司產(chǎn)品；DNA連接酶與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000分別購(gòu)自美國(guó)Thermo公司和Invitrogen公司；抗 IκBα單克隆抗體與抗 Flag M2單克隆抗體均為美國(guó)Cell Signaling公司產(chǎn)品；抗α-微管蛋白單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司；Dual-Glo Luciferase Assay System為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 PCR擴(kuò)增 IκBα-DN序列 根據(jù)真核表達(dá)質(zhì)粒 pMIGR1-IκBα-DN分別設(shè)計(jì) IκBα-DN序列的上下游引物，其中上游引物為5′-TTGAATTCGCCACCATGTTTCAGCCAGCTGGGCAC-3′（下劃線部分為EcoR I識(shí) 別 序列），下 游引物為5′-CGGGATCCTTATTTGTCATCGTCGTCCTTATAATCCTTATCGTCATCATCCTTGTAATCTTTGTCGTCGTCATCCTTGTAGTCTAATGTCAGACGCTGGCCTCC-3′（下劃線部分為BamH I識(shí)別序列，斜體部分為標(biāo)簽蛋白 Flag序列）。以 pMIGR1-IκBα-DN質(zhì)粒為模板，通過(guò)上述上下游引物PCR擴(kuò)增出IκBα-DN序列，經(jīng)核酸電泳檢測(cè) PCR產(chǎn)物并切膠回收。

1.3.2 重組質(zhì)粒pCDH-IκBα-DN的構(gòu)建及鑒定

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ同時(shí)酶切PCR回收產(chǎn)物與慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，將純化后的雙酶切產(chǎn)物用 T4連接酶連接過(guò)夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，挑選氨芐西林抗性菌落進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)質(zhì)粒小提試劑盒提取出重組質(zhì)粒 pCDH-IκBα-DN。對(duì)獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，同時(shí)送蘇州金唯智科技有限公司進(jìn)行核酸序列測(cè)定。

1.3.3 重組慢病毒Lv-IκBα-DN的包裝與滴度測(cè)定

利用LipofectamineTM2000將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pCDH-IκBα-DN與包 裝質(zhì) 粒 psPAX2、包膜 質(zhì) 粒pMD2.G共同轉(zhuǎn)染入 293 T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染10 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)［14］。終止轉(zhuǎn)染 48 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達(dá)。收取細(xì)胞培養(yǎng)上清并經(jīng)0.45 μm濾器過(guò)濾，將包裝的重組慢病毒及其對(duì)照慢病毒分別命名為L(zhǎng)v-IκBα-DN和Lv-Mock。將病毒液進(jìn)行梯度稀釋，分別感染提前24 h鋪板的293 T細(xì)胞。通過(guò)熒光計(jì)數(shù)法測(cè)定兩者滴度。

1.3.4 重組慢病毒介導(dǎo)的 IκBα-DN在 293 T細(xì)胞中的表達(dá) 將293 T細(xì)胞鋪入 6孔板中，24 h后以相同感染復(fù)數(shù)的 Lv-IκBα-DN和 Lv-Mock病毒液分別感染。感染48 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)，同時(shí)提取蛋白進(jìn)行免疫印跡，檢測(cè) IκBα蛋白的表達(dá)情況。

1.3.5 重組慢病毒介導(dǎo)的 IκBα-DN在 HUVECs中的表達(dá) 依照“1.3.4”中的步驟感染HUVECs，48 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)，同時(shí)提取蛋白進(jìn)行免疫印跡，檢測(cè)IκBα蛋白的表達(dá)情況。

1.3.6 蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè) IκBα-DN對(duì) NF-κB活性的影響 提前24 h將293 T細(xì)胞鋪入48孔板中，利用 LipofectamineTM2000共同轉(zhuǎn)染入 NF-κB蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒以及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK。轉(zhuǎn)染24 h后依照“1.3.4”中的步驟感染 24 h。收集細(xì)胞，按照 Dual-Glo Luciferase Assay System說(shuō)明書(shū)中推薦步驟檢測(cè)熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計(jì)，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IκBα-DN序列的PCR擴(kuò)增

以真核表達(dá)質(zhì)粒 pMIGR1-IκBα-DN為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在約1 039 bp位置出現(xiàn)與預(yù)期一致的 IκBα-DN片段（圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增IκBα-DN序列

2.2 重組質(zhì)粒pCDH-IκBα-DN的鑒定

對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCDH-IκBα-DN進(jìn)行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后分別產(chǎn)生 2條片段，大小約7 742 bp和1 039 bp，即代表慢病毒載體 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP和 IκBα-DN序列（圖 2）。測(cè)序結(jié)果表明，全長(zhǎng)為1 039 bp的外源基因已克隆至慢病毒載體中。DNAssist軟件比對(duì)結(jié)果證實(shí)，插入的IκBα-DN片段與pMIGR1-IκBα-DN中的序列一致，引入的 Flag序列完全正確，表明重組質(zhì)粒pCDH-IκBα-DN構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒 pCDH-IκBα-DN的酶切鑒定

2.3 重組慢病毒的包裝與滴度測(cè)定

用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒與IκBα-DN重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入 293 T細(xì)胞，48 h后在熒光顯微鏡下可觀察到大約 80％293 T細(xì)胞表達(dá)綠色熒光（圖3）。分別收取重組慢病毒Lv-IκBα-DN以及對(duì)照慢病毒Lv-Mock的病毒液，過(guò)濾后感染 293 T細(xì)胞，48 h后通過(guò)熒光計(jì)數(shù)法測(cè)得Lv-IκBα-DN和 Lv-Mock的滴度分別為 3×107efu/ mL和2×107efu/mL。

2.4 重組慢病毒 Lv-IκBα-DN在293 T細(xì)胞中的表達(dá)驗(yàn)證

將Lv-IκBα-DN和 Lv-Mock病毒液分別感染293 T細(xì)胞，48 h后在熒光顯微鏡可觀察到約 90％細(xì)胞表達(dá)綠色熒光。同時(shí)收取細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫印跡，利用抗Flag M2單克隆抗體可在39×103處檢測(cè)到特異性條帶，且 IκBα蛋白表達(dá)水平上升，說(shuō)明重組慢病毒Lv-IκBα-DN和 Lv-Mock包裝成功，IκBα-DN能夠增加胞質(zhì)內(nèi) IκBα蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖4。

圖3 三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞后的綠色熒光蛋白的表達(dá)（×100）

圖4重組慢病毒介導(dǎo)的 IκBα-DN在 293 T細(xì)胞中的表達(dá)

2.5 蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè) IκBα-DN對(duì) NF-κB活性的影響

將NF-κB蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共同轉(zhuǎn)染入293 T細(xì)胞，并以Lv-IκBα-DN 和Lv-Mock病毒液分別進(jìn)行感染，24 h后檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，IκBα-DN顯著抑制了 NF-κB報(bào)告質(zhì)粒的活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。見(jiàn)圖5。

圖 5 蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè) IκBα-DN對(duì)NF-κB活性的影響

2.6 重組慢病毒 Lv-IκBα-DN在 HUVECs中的功能驗(yàn)證

用Lv-IκBα-DN和Lv-Mock病毒液分別感染穩(wěn)定表達(dá) KSHV vFLIP的 HUVECs（vFLIP）及其對(duì)照細(xì)胞（Mock），最終獲得 Mock-pCDH、Mock-IκBα-DN、vFLIP-pCDH、vFLIP-IκBα-DN四株細(xì)胞株。免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)重組慢病毒導(dǎo)入IκBα-DN序列后，被vFLIP所抑制的胞質(zhì)內(nèi) IκBα蛋白的表達(dá)明顯升高（圖6），證明IκBα-DN在HUVECs中可以得到有效表達(dá)，并且能夠在穩(wěn)定表達(dá) KSHV vFLIP的細(xì)胞中發(fā)揮抑制 NF-κB信號(hào)通路的作用。

圖6 重組慢病毒介導(dǎo)的 IκBα-DN在 HUVECs中的功能驗(yàn)證

3 討論

NF-κB信號(hào)通路在抵御病原微生物的天然免疫系統(tǒng)中起著重要的作用，而很多病原微生物也在不斷地進(jìn)化中形成了調(diào)控 NF-κB信號(hào)通路的應(yīng)對(duì)策略。其中，KSHV的生命周期和致病過(guò)程被證實(shí)與NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。KSHV是一種可以導(dǎo)致多種惡性腫瘤發(fā)生的病毒，NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活可導(dǎo)致 NF-κB靶基因的異常表達(dá)，這些基因往往與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、組織浸潤(rùn)以及腫瘤細(xì)胞的抗凋亡作用相關(guān)，如調(diào)控細(xì)胞增殖的細(xì)胞周期蛋白 D1和細(xì)胞周期蛋白 E，與炎癥反應(yīng)和血管生成相關(guān)的白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、細(xì)胞間黏附分子-1和內(nèi)皮細(xì)胞選擇素，以及與遷移侵襲相關(guān)的尿激酶、基質(zhì)金屬蛋白酶2/9和細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）。

目前研究表明，KSHV編碼的多種蛋白參與調(diào)節(jié) NF-κB信號(hào)通路，如 vFLIP、vGPCR、K1、vIRF3、FGARAT、K15、RTA［15］。其中，KSHV潛伏期蛋白vFLIP通過(guò)與NEMO綁定促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)IKK復(fù)合物的形成，進(jìn)而激活 NF-κB信號(hào)通路［16］。除此之外，KSHV vFLIP激活 NF-κB信號(hào)通路還需要上調(diào)宿主細(xì)胞環(huán)氧化酶2的表達(dá)［17］。另有研究表明，在KSHV感染的細(xì)胞中，被 vFLIP激活的 NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后除了調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、增殖及血管形成等生物學(xué)過(guò)程，同時(shí)也增強(qiáng)了鋅指蛋白A20的表達(dá)，表達(dá)量增加的 A20則可抑制 NF-κB通路信號(hào)，從而形成了對(duì) NF-κB信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)［18］。在經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路中，IκBα也是典型的能夠發(fā)揮抑制NF-κB入核作用的關(guān)鍵蛋白。IκBα可以通過(guò)C端含有的3～8個(gè)錨蛋白基序，覆蓋NF-κB的核定位序列，從而達(dá)到抑制NF-κB活性的目的［19-21］。

因此，許多研究中都采用 IκBα磷酸化的抑制劑來(lái)阻斷NF-κB信號(hào)通路，以滿足各自的研究需要。目前比較常用的為（E）-3-（對(duì)甲苯磺?；┍╇?，是一種高效的化學(xué)抑制劑，能夠不可逆地抑制IκBα的磷酸化反應(yīng)，從而阻止了 NF-κB的入核。這種化學(xué)抑制劑優(yōu)點(diǎn)是效率高，但有明顯的細(xì)胞毒性作用，會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，繼而會(huì)對(duì)隨后的表型實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾。因此，本課題組構(gòu)建了IκBα顯性負(fù)相結(jié)構(gòu)的重組慢病毒載體，它以慢病毒的方式導(dǎo)入細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)，既能夠成功地抑制IκBα的磷酸化又不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用。這種方法目前已經(jīng)比較成熟，已有研究者利用IκBα-DN成功使得胰腺癌 PC-3細(xì)胞株中 NF-κB低表達(dá)［22］，此外國(guó)外實(shí)驗(yàn)室為研究 NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞向肺部轉(zhuǎn)移過(guò)程中的免疫和炎癥反應(yīng)過(guò)程，就應(yīng)用了IκBα-DN這一技術(shù)并取得了很好的結(jié)果［23］。

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中將vFLIP基因通過(guò)慢病毒載體的形式整合入HUVECs，穩(wěn)定表達(dá)的vFLIP蛋白通過(guò)活化的IKK復(fù)合物泛素化、磷酸化并最終降解IκBα，從而使 NF-κB大量進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)與腫瘤形成相關(guān)基因的表達(dá)［24］。目前本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)通過(guò)同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量蛋白組學(xué)技術(shù)，對(duì)穩(wěn)定表達(dá) vFLIP的內(nèi)皮細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞株進(jìn)行了蛋白表達(dá)譜的測(cè)定，并篩選出部分與腫瘤形成有關(guān)的蛋白。vFLIP可能通過(guò) NF-κB信號(hào)通路調(diào)控其中某些關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，從而參與 KSHV的致瘤過(guò)程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證 NF-κB信號(hào)通路及其下游的關(guān)鍵靶基因在其中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了表達(dá)IκBα-DN的重組慢病毒載體，以抑制 IκBα的磷酸化與降解，從而抑制NF-κB信號(hào)的活化。在后續(xù)研究中，構(gòu)建的IκBα-DN重組慢病毒載體將應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)vFLIP對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活作用，有助于檢驗(yàn)所篩選出的關(guān)鍵蛋白是否參與了 vFLIP通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤生成的過(guò)程，從而為進(jìn)一步闡明KSHV相關(guān)惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］Baldwin AS Jr.The NF-κB and IκB proteins:new discoveries and insights［J］.Annu Rev Immunol，1996，14:649-683.

［2］Liu L，Eby MT，Rathore N，et al.The human herpes virus 8-encoded viral FLICE inhibitory protein physically associates with and persistently activates the IκB kinase complex［J］.J Biol Chem，2002，277（16）:13745-13751.

［3］Bullani RR，Huard B，Viard-Leveugle I，et al.Selective expression of FLIP in malignant melanocytic skin lesions［J］.J Invest Dermatol，2001，117（2）:360-364.

［4］Liu K，McDuffie E，Abrams SI.Exposure of human primary colon carcinoma cells to anti-Fas interactions influences the emergence of pre-existing Fas-resistant metastatic subpopulations［J］.J Immunol，2003，171（8）: 4164-4174.

［5］Irmler M，Thome M，Hahne M，et al.Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP［J］.Nature，1997，388（6638）:190-195.

［6］Sun Q，Zachariah S，Chaudhary PM.The human herpes virus 8-encoded viral FLICE-inhibitory protein induces cellular transformation via NF-κB activation［J］.J Biol Chem，2003，278（52）:52437-52445.

［7］Chang Y，Cesarman E，Pessin MS，et al.Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma［J］.Science，1994，266（5192）: 1865-1869.

［8］Katano H，Sata T.Human herpesvirus 8 virology，epidemiology and related diseases［J］.Jpn J Infect Dis，2000，53（4）:137-155.

［9］Ganem D.KSHV infection and the pathogenesis of Kaposi's sarcoma［J］.Annu Rev Pathol，2006，1:273 -296.

［10］Nicholas J.Human herpesvirus 8-encoded proteins with potential roles in virus-associated neoplasia［J］.Front Biosci，2007，12:265-281.

［11］馬新廷，郝婷婷，盧春，等.KSHV抗凋亡蛋白vFLIP編碼基因的克隆表達(dá)及抗 vFLIP多克隆抗體的制備與鑒定［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，22 （1）:1-8.

［12］Zhu X，Zhou F，Qin D，et al.Human immunodeficiency virus type 1 induces lytic cycle replication of Kaposi's-sarcoma-associated herpesvirus:role of Ras/c-Raf/MEK1/2，PI3K/AKT，and NF-κB signaling pathways［J］.J Mol Biol，2011，410（5）:1035-1051.

［13］王平，黃敏，盧春.含 HIV-1 Vif基因重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì) KSHV裂解性周期復(fù)制影響的初探［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，3 （3）:286-290，355.

［14］Zhu X，Guo Y，Yao S，et al.Synergy between Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus（KSHV）vIL-6 and HIV-1 Nef protein in promotion of angiogenesis and on-cogenesis:role of the AKT signaling pathway［J］.Oncogene，2014，33（15）:1986-1996.

［15］de Oliveira DE，Ballon G，Cesarman E.NF-κB signaling modulation by EBV and KSHV［J］.Trends Microbiol，2010，18（6）:248-257.

［16］Tolani B，Matta H，Gopalakrishnan R，et al.NEMO is essential for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-encoded vFLIP K13-induced gene expression and protection against death receptor-induced cell death，and its N-terminal 251 residues are sufficient for this process ［J］.J Virol，2014，88（11）:6345-6354.

［17］Sharma-Walia N，Patel K，Chandran K，et al.COX-2/ PGE2:molecular ambassadors of Kaposi's sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP［J］.Oncogenesis，2012，1:e5.

［18］Matta H，Gopalakrishnan R，Punj V，et al.A20 is induced by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-encoded viral FLICE inhibitory protein（vFLIP）K13 and blocks K13-induced nuclear factor-κB in a negative feedback manner［J］.J Biol Chem，2011，286（24）: 21555-21564.

［19］Bagneris C，Ageichik AV，Cronin N，et al.Crystal structure of a vFlip-IKKγ complex:insights into viral activation of the IKK signalosome［J］.Mol Cell，2008，30（5）:620-631.

［20］Field N，Low W，Daniels M，et al.KSHV vFLIP binds to IKK-γ to activate IKK［J］.J Cell Sci，2003，116 （18）:3721-3728.

［21］Matta H，Chaudhary PM.Activation of alternative NF-κ B pathway by human herpes virus 8-encoded Fas-associated death domain-like IL-1 β-converting enzyme inhibitory protein（vFLIP）［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（25）:9399-9404.

［22］謝傳高，魏樹(shù)梅，徐選福，等.顯性失活 IκBα質(zhì)粒對(duì)胰腺癌PC-3細(xì)胞株核因子-κB和環(huán)氧合酶-2表達(dá)的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2005，21（8）:1557 -1561.

［23］Connelly L，Barham W，Onishko HM，et al.NF-κB activation within macrophages leads to an anti-tumor phenotype in a mammary tumor lung metastasis model［J］. Breast Cancer Res，2011，13（4）:R83.

［24］金镠洋，嚴(yán)沁，盧春.KSHV vFLIP在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)及其功能驗(yàn)證［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2014，24（1）:6-11，17.

Construction of recombinant expression lentivirus vector carrying IκBα-DN and identification of its role in NF-κB signaling pathway

LU Yao，YAN Qin，LU Chun
（Department of Microbiology，Nanjing Medical University，Nanjing Jiangsu 210029，China）

R393

A

1671-7783（2015）01-0027-06

10.13312/j.issn.1671-7783.y140327

路堯（1986—），男，碩士研究生；盧春（通訊作者），教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail:clu@njmu.edu.cn

2014-08-27 ［編輯］何承志