蔣銀芬，丁志祥，孫曉春（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 1013；.常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 常州 13003）

橋本甲狀腺炎患者血清白介素-17A、γ-干擾素及miRNA-146a的檢測(cè)意義

蔣銀芬1，2，丁志祥2，孫曉春1，*
（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 常州 213003）

目的：探討白介素-17A（IL-17A），γ-干擾素（IFN-γ）及 miRNA-146a與橋本甲狀腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）的關(guān)系以及指標(biāo)間的相關(guān)性。方法：應(yīng)用流式細(xì)胞儀 CBA法檢測(cè) 32例 HT患者和 30例健康對(duì)照血清 IL-17A、IFN-γ的表達(dá)水平，應(yīng)用熒光定量 PCR法檢測(cè)血清中miRNA-146a的相對(duì)表達(dá)水平并檢驗(yàn)其與 IL-17A和 IFN-γ的相關(guān)性。結(jié)果：HT患者血清中 IL-17A和IFN-γ的水平分別為（3.42±0.97）pg/mL和（7.20±1.73）pg/mL，明顯高于對(duì)照組的（2.38±0.35）pg/mL和（5.60±0.70）pg/mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）；HT患者血清miRNA-146a的相對(duì)表達(dá)為 0.11±0.26，低于對(duì)照組 0.27±0.13，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。HT患者 IL-17A與 IFN-γ表達(dá)有相關(guān)性（r=0.307，P=0.015）；而 miRNA-146a與 IL-17A（r=-0.059，P=0.648）、IFN-γ（r=-0.218，P=0.089）之間均無(wú)明顯相關(guān)性。結(jié)論:IL-17A、IFN-γ在HT患者血清中均呈高表達(dá)，而miRNA-146a低表達(dá)，提示三者參與了HT的發(fā)病進(jìn)程，有可能作為 HT診斷的參考指標(biāo)。

橋本甲狀腺炎；IL-17A；IFN-γ；miRNA-146a

橋本甲狀腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）又名慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，是一種以自身甲狀腺組織為抗原的慢性自身免疫性疾病。在環(huán)境和某些遺傳因素共同作用下產(chǎn)生自身抗體及相關(guān)細(xì)胞因子，破壞正常甲狀腺組織。研究發(fā)現(xiàn)Th1和 Th2及相關(guān)細(xì)胞因子參與了自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展［1］，其中 IL-17A和 IFN-γ是主要的相關(guān)細(xì)胞因子。miRNA是一類短?。?0～24 nt）的非編碼 RNA，在自身免疫性甲狀腺炎中發(fā)揮重要的作用［2-3］。而 miRNA-146a是主要參與免疫調(diào)節(jié)的 miRNA分子之一［4］。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)患者血清中 IL-17A、IFN-γ 及miRNA-146a的表達(dá)水平初步探討其在 HT診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

HT組來(lái)自2014年1月至 7月來(lái)常州市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科治療的患者共 32例，其中男13例，女19例，平均年齡（42.2±11.8）歲。HT的診斷符合《中國(guó)甲狀腺疾病診治指南》的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)排除其他自身免疫性疾病、感染、腫瘤、妊娠等其他內(nèi)科疾病及使用激素者。對(duì)照組為同期體檢的健康者共30例，其中男12例，女18例，平均年齡（40.3±10.7）歲。HT組與對(duì)照組的年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 標(biāo)本采集和處理

晨起空腹采集靜脈血4mL，即時(shí)分離血清，分兩管，-70℃凍存，分別用于細(xì)胞因子和miRNA-146a的檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

IL-17A和 IFN-γ試劑盒（BD公司），核酸提取試劑盒（碩世生物科技有限公司），RevertAid First Strand cDNA synthesis kit（Thermo公司），SYBR Green熒光定量 PCR檢測(cè)試劑盒（TaKaRa公司），miRNA-146a檢測(cè)引物（廣州市銳博生物科技有限公司），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI 7500）。

1.4 IL-17A和 IFN-γ的測(cè)定

嚴(yán)格按照 BD公司提供的 BDTMCytometric Bead Array（CBA）Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit說明書操作。

1.5 miRNA-146a的檢測(cè)

①血清總RNA的提取按說明書進(jìn)行，獲純化的核酸溶液-80℃保存?zhèn)溆?。②逆轉(zhuǎn)錄按照Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer的miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用說明書進(jìn)行操作。首先將總RNA作適當(dāng)?shù)臐舛日{(diào)整，然后選擇25 μL反應(yīng)體系在去RNA酶的 PCR管中進(jìn)行反應(yīng)體系的配置，包括 5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，dNTP混合液，RNA酶抑制劑，逆轉(zhuǎn)錄酶，無(wú) RNA酶水。將反應(yīng)體系混勻后 42℃60 min，70℃ 10 min。③定量 PCR檢測(cè)按照 Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer的 miRNA qPCR使用說明書進(jìn)行操作。選擇 20 μL反應(yīng)體系，包括SYBR Green Mix，miRNA第1鏈 cDNA，上、下游引物，無(wú)RNA酶水。循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性2 min，94 ℃20 s，60℃34 s，共循環(huán) 40次，以 U6作為內(nèi)參。miR-146a相對(duì)表達(dá)以2-△CT表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)和相關(guān)性分析；以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清 IL-17A、IFN-γ及 miRNA-146a表達(dá)水平的比較

HT組患者 IL-17A，IFN-γ水平均較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HT組 miRNA-146a水平明顯低于對(duì)照組，見表1。

表1 兩組血清IL-17A，IFN-γ及miRNA-146a水平的比較

2.2 miRNA-146a表達(dá)水平與 IL-17A、IFN-γ的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HT患者 IL-17A與IFN-γ表達(dá)有相關(guān)性（r=0.307，P=0.015）。而miRNA-146a與IL-17A（r=-0.059，P=0.648）、IFN-γ（r= -0.218，P=0.089）之間均無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系。

3 討論

HT是自身免疫性甲狀腺病的一種，是一種器官特異性免疫疾病，在患者血清中可檢測(cè)出高效價(jià)的自身抗體。如不進(jìn)行積極的治療，一般都會(huì)發(fā)展成甲狀腺功能減退而導(dǎo)致終生服用激素。

Th17細(xì)胞以及其產(chǎn)生的IL-17參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病的發(fā)?。?-6］。文獻(xiàn)報(bào)道Th17在自身免疫性甲狀腺病中較正常組升高［7］。Th17細(xì)胞主要分泌細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F、IL-22等，以分泌 IL-17A為主要特征。其為強(qiáng)烈的促炎因子，介導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了 HT患者血清 IL-17A的表達(dá)情況，結(jié)果顯示HT患者較對(duì)照組明顯增高，這與陳紫君等［8］研究結(jié)果相符合。其機(jī)制可能是 IL-17A強(qiáng)烈的促炎性作用導(dǎo)致濾泡上皮細(xì)胞破壞萎縮，導(dǎo)致甲狀腺自身免疫功能紊亂，最終導(dǎo)致了 HT的發(fā)生。Caturegli等［9］研究發(fā)現(xiàn)高水平的 IFN-γ會(huì)抑制甲狀腺細(xì)胞的鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致小鼠甲狀腺結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，甲狀腺功能障礙，同時(shí)向易感小鼠的甲狀腺內(nèi)注射IFN-γ會(huì)誘導(dǎo)發(fā)生甲狀腺炎。本組 HT患者血清 IFN-γ較對(duì)照組明顯增高，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符［10］。文獻(xiàn)還表明［11］，HT患者外周血 Th1、Th2、Th17和 Treg均呈高表達(dá)，而Th1、Th2和 Th17又分泌高水平的 IL-4、IL-17A和 IFN-γ。這些觀點(diǎn)與結(jié)論與本文的研究結(jié)果基本一致。

miRNA可通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等多個(gè)層面對(duì)免疫反應(yīng)執(zhí)行較為柔和和精細(xì)的微調(diào)［12］，且人類血清中的 miRNA參與了自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)生與發(fā)展［2-3］，文獻(xiàn)表明miRNA-146a在 HT的發(fā)病中發(fā)揮作用［4］。本研究結(jié)果顯示，HT患者血清 miRNA-146a表達(dá)水平與健康對(duì)照組比較明顯下調(diào)，與 IL-17A和 IFN-γ表達(dá)水平并無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。我們通過 miRNA與靶基因的預(yù)測(cè)軟件分析，也進(jìn)一步證實(shí) IL-17A和 IFN-γ也確實(shí)非miR-146a作用的靶基因。與我們的研究結(jié)果一致，Bernecker等［13］提出 miRNA-146a在 HT患者血清中表現(xiàn)為下調(diào)。

綜上所述，IL-17A和 IFN-γ在 HT患者血清中均呈表高達(dá)，而miRNA-146a低表達(dá)，提示三者均可能參與了HT的發(fā)病進(jìn)程，對(duì) HT的診斷可起到一定的參考價(jià)值。但是，在發(fā)病機(jī)制上，IL-17A與 IFN-γ之間存在一定的相關(guān)性，但 miRNA-146A與前兩者并無(wú)直接的相關(guān)性。

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R581.4

B

1671-7783（2015）01-0072-02

10.13312/j.issn.1671-7783.y140247

*:通訊作者，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail:xiaochun@ujs.edu.cn

2014-09-17 ［編輯］何承志