李蕓子，邱晶，孫競(jìng)，高靜（江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

丙戊酸鈉對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

李蕓子，邱晶，孫競(jìng)，高靜
（江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

目的：觀察丙戊酸鈉對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤 SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響并探討其分子機(jī)制。方法：100 μmol/L丙戊酸鈉作用 SH-SY5Y細(xì)胞3 h后，使用 400 nmol/L魚(yú)藤酮處理24 h誘導(dǎo) SH-SY5Y細(xì)胞損傷。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；分光光度法檢測(cè)線粒體復(fù)合體Ⅰ（mitochondrial complexⅠ，COXⅠ）活性；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)?；o酶 A心磷脂?；D(zhuǎn)移酶（Acyl-CoA lysocardiolipin acyltransferase 1，ALCAT1）、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）、核受體過(guò)氧化酶體 增殖子激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α）的表達(dá)水平；RT-PCR法檢測(cè)PGC-1α mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果：預(yù)防性給予丙戊酸鈉能明顯提高魚(yú)藤酮損傷的 SH-SY5Y細(xì)胞存活率，下調(diào)ALCAT1的表達(dá)水平，增強(qiáng) COXⅠ的活性，并上調(diào)SIRT1及 PGC-1α的表達(dá)水平，但對(duì) PGC-1α mRNA轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯影響。結(jié)論:丙戊酸鈉對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的 SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

丙戊酸鈉；?；o酶 A心磷脂?；D(zhuǎn)移酶；線粒體復(fù)合體Ⅰ；沉默信息調(diào)節(jié)因子1；PGC-1α

［Abstract］Objective:To study the effect and the molecular mechanism of sodium valproate on rotenone induced injury in SH-SY5Y cells.Methods:After pretreatment of 100 μmol/L sodium valproate，SHSY5Y cells were treated with 400 nmol/L rotenone；MTT assay was used to analyze cells viability；spectrophotometry was used to check mitochondrial complexⅠactivity；the expression of Acyl-CoA lysocardiolipin acyltransferase 1（ALCAT1），silent information regulator 1（SIRT1）and peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α（PGC-1α）were checked by Western blot；mRNA level of PGC-1α was analyzed by RT-PCR.Results:Pretreatment of 100 μmol/L sodium valproate for 3 h in SH-SY5Y cells could significantly increase cells viability，inhibit the expression of ALCAT1，elevate the activity of mitochondrial complexⅠ，increase the expression of SIRT1 and PGC-1α，but had no effect of mRNA level of PGC-1α.Conclusion:Sodium valproate had protective effect on rotenone induced injury in SH-SY5Y cells.

［Key words］sodium valproate；Acyl-CoA lysocardiolipin acyltransferase 1；mitochondrial complexⅠ；silent information regulator 1；PGC-1α

帕金森病是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病［1］。研究顯示，線粒體復(fù)合體Ⅰ（mitochondrial complexⅠ，COXⅠ）活性與帕金森病的發(fā)生密切相關(guān)［2］，導(dǎo)致帕金森病病理?yè)p傷過(guò)程中 COXⅠ活性下降的機(jī)制目前還不是很清楚。有研究指出心磷脂對(duì)于COXⅠ活性的維持是必需的［3］。而且，心磷脂對(duì)參與線粒體氧化磷酸化過(guò)程的很多關(guān)鍵酶活性具有重要的調(diào)控作用，這其中就包括對(duì)COXⅠ活性的調(diào)節(jié)［3］。?；o酶A心磷脂?；D(zhuǎn)移酶（Acyl-CoA lysocardiolipin acyltransferase 1，ALCAT1）是一種參與心磷脂重塑的?；D(zhuǎn)移酶，當(dāng)心磷脂的?；溄Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，即心磷脂重塑后可進(jìn)一步引起線粒體功能紊亂，進(jìn)而觸發(fā)多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生［4-5］。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）屬于Ⅲ型核組蛋白脫乙酰酶，是目前研究最為透徹的核組蛋白脫乙酰酶［6］。在哺乳動(dòng)物中，SIRT1的活性依賴(lài)于NAD+［7］。線粒體對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行多級(jí)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）直接通過(guò) COXⅠ進(jìn)行再氧化生成NAD+。因此，細(xì)胞內(nèi)COXⅠ的功能可以影響NAD+量的變化，進(jìn)而影響SIRT1的活性。

研究表明SIRT1參與了非組蛋白底物的脫乙?；@些非組蛋白包括核受體過(guò)氧化酶體 增殖子激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α）［8］。PGC-1α對(duì)線粒體的合成及其功能的維持有著關(guān)鍵作用。PGC-1α在腦組織中高表達(dá)，通過(guò)整合線粒體合成與維持線粒體功能等多條途徑，保護(hù)老化細(xì)胞［9］。最新研究表明［10］，激活或過(guò)表達(dá)神經(jīng)元中的 PGC-1α可明顯增加神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)線粒體的密度；此外，PGC-1α也可通過(guò)上調(diào)線粒體內(nèi)超氧化物歧化酶 2等多種抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)抗細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。因此 PGC-1α也被認(rèn)為是一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化調(diào)節(jié)因子［11］。

丙戊酸鈉是臨床上治療癲癇的經(jīng)典藥物。本實(shí)驗(yàn)室前期研究［12］發(fā)現(xiàn)，丙戊酸鈉具有明顯的保護(hù)線粒體功能的作用。為進(jìn)一步研究丙戊酸鈉在帕金森病樣損傷狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞及線粒體功能具有保護(hù)作用的分子機(jī)制，本研究采用從醉魚(yú)豆屬植物毛魚(yú)藤的根和葉中提取出的 COXⅠ選擇性抑制劑魚(yú)藤酮作用于SH-SY5Y細(xì)胞，構(gòu)建帕金森病樣細(xì)胞損傷模型，并從細(xì)胞存活率、COXⅠ活性、ALCAT1、SIRT1 及PGC-1α表達(dá)量等方面觀察丙戊酸鈉保護(hù)帕金森病樣損傷細(xì)胞的分子機(jī)制，為將丙戊酸鈉作為神經(jīng)保護(hù)劑應(yīng)用于預(yù)防和治療帕金森病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

CO2孵箱（德國(guó)Heraeus公司）；SpectraMax 190酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；冷凍離心機(jī)美國(guó) Beckman Coulter公司）；Mini-PROTEAN 3電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；PCR儀（Gene公司）；蛋白核酸定量?jī)x（島津公司）；DY602S穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀（南京新校園生物技術(shù)研究所）。

丙戊酸鈉和魚(yú)藤酮均為 Sigma公司產(chǎn)品；MEM∶F12培養(yǎng)基（1∶1，Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；MTT（Amresco公司）；COXⅠ酶活性試劑盒（Abcam公司）；Trizol RNA提取試劑盒（寶生物有限公司）；RT-PCR試劑盒（Fermentas公司）；PGC-1α和 GAPDH引物（Invitrogen公司）；抗SIRT1抗體（Santa Cruz公司，1∶200）；抗PGC-1α抗體（Santa Cruz公司，1∶200）；抗β-肌動(dòng)蛋白抗體（Abcam公司，1∶2 000）；抗ALCAT1抗體（Abcam公司，1∶100）。

1.2 SH-SY5Y細(xì)胞的培養(yǎng)

將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞（中科院上海營(yíng)養(yǎng)所柯尊記研究員惠贈(zèng)）接種于裝有含10％胎牛血清的MEM∶F12（1∶1）培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，2～3天傳代1次。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)將培養(yǎng)的細(xì)胞消化后得細(xì)胞懸液，分別接種于6孔、96孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，接種時(shí)細(xì)胞密度為3×104個(gè)/mL。

本實(shí)驗(yàn) SH-SY5Y細(xì)胞共設(shè)3組，對(duì)照組不加藥物，損傷組細(xì)胞加入魚(yú)藤酮，預(yù)處理組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入100 μmol/L的丙戊酸鈉，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后加入400 nmol/L的魚(yú)藤酮，作用24 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè) SH-SY5Y細(xì)胞活性

96孔 細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加100 μL MTT（用D-hank′s液溶解，質(zhì)量濃度為1 mg/mL），37℃繼續(xù)孵育4 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 100 μL，待結(jié)晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm處測(cè)光密度值。

1.4 分光光度法檢測(cè) COXⅠ酶活性

以培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，吸出培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞1次，每孔加胰酶消化20 s，將細(xì)胞移至離心管中，2 000 r/min離心10 min，沉淀即為細(xì)胞。以20 μL細(xì)胞沉淀為基準(zhǔn)，加入 20 μL RSB低滲緩沖液（NaCl 0.058 44 g，MgCl20.023 75 g，Tris-HCl 0.197 06 g，EDTA 0.730 62 g，雙蒸水100 mL，pH 7.5）冰上研磨5 min，再加入80 μL 2.5×MS緩沖液（甘露醇9.565 50 g，蔗糖5.990 26 g，Tris-HCl 0.197 06 g，EDTA 0.730 62 g，雙蒸水100 mL，pH 7.5），再研磨30 s，轉(zhuǎn)至 Eppendorf管中，再加入100 μL 1×MS緩沖液（甘露醇3.826 20 g，蔗糖2.396 10 g，Tris-HCl 0.078 82 g，EDTA 0.029 20 g，雙蒸水100 mL，pH 7.5）沖洗勻漿管，移至Eppendorf管中，2 000 r/min離心10 min取上清，13 000 r/min離心15 min，上清即為胞質(zhì)，沉淀為線粒體。將上清液凍干，用PBS溶解，取20 μL進(jìn)行考馬斯亮藍(lán) G-250蛋白定量。其他操作步驟參考COXⅠ酶活性試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用酶標(biāo)儀檢測(cè)30 min內(nèi)，450 nm處光密度值。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi) ALCAT1、SIRT1及 PGC-1α的表達(dá)水平

6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，輕輕吸出培養(yǎng)基，每孔加入1 mL D-hank′s溶液，用細(xì)胞刮子輕輕將貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)板上刮下，小心重懸細(xì)胞后將細(xì)胞懸液移入1.5 mL的 Eppendoff管中，4 000 r/min離心5 min，棄上清，加入一定量的細(xì)胞裂解液，置冰上裂解 20 min。12 000×g離心2 min，吸上清。取 2～5 μL進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)蛋白定量，其余樣品按比例加入3×SDS凝膠上樣緩沖液溶解，煮沸5 min。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體，化學(xué)發(fā)光儀曝光觀察蛋白的表達(dá)。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) PGC-1α的轉(zhuǎn)錄水平

采用 Trizol試劑盒提取細(xì)胞總 RNA，紫外分光光度計(jì)（D260 nm/D280 nm）檢測(cè)RNA純度。按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)將所提 RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，并將 cDNA立即用于 PCR檢測(cè)。

引物序列依據(jù)文獻(xiàn)［13-14］，人 PGC-1α上游序列:5′-TGAGAGGGCCAAGCAAAG-3′，下游序列: 5′-ATAAATCACACGGCGCTCTT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為116 bp；人 GAPDH上游序列:5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3′，下 游 序 列:5′-TTCACACCCATGACGAACAT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為457 bp。循環(huán)條件為95℃預(yù)變性 3 min，95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s進(jìn)行27個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10 min；EB染色，1.5％瓊脂糖凝膠電泳 PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察人PGC-1α和GAPDH PCR產(chǎn)物的表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，3組細(xì)胞各個(gè)檢測(cè)指標(biāo)間的比較采用單因素方差分析，組間比較應(yīng)用q檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組SH-SY5Y細(xì)胞活性的比較

MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，損傷組細(xì)胞活性明顯降低（q=6.815，P＜0.01）；預(yù)處理組細(xì)胞活性明顯高于損傷組（q=4.272，P＜0.05），與對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=2.543，P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組SH-SY5Y細(xì)胞的活性比較

2.2 各組 SH-SY5Y細(xì)胞 ALCAT1表達(dá)的比較

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，損傷組細(xì)胞ALCAT1的表達(dá)水平明顯升高（q=13.70，P＜0.01）；與損傷組比較，預(yù)處理組ALCAT1表達(dá)水平明顯降低（q=10.44，P＜0.05）。該結(jié)果提示丙戊酸鈉可以通過(guò)調(diào)控ALCAT1的表達(dá)影響心磷脂的重構(gòu)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞 ALCAT1相對(duì)表達(dá)量的比較

2.3 各組 SH-SY5Y細(xì)胞 COXⅠ活性的比較

COXⅠ活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，損傷組細(xì)胞COXⅠ活性在15到30 min內(nèi)明顯降低；與損傷組比較，預(yù)處理組細(xì)胞 COXⅠ活性各時(shí)段均明顯升高。見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞 COXⅠ活性的比較

2.4 各組細(xì)胞SIRT1及 PGC-1α表達(dá)的比較

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中SIRT1及PGC-1α表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，損傷組 SHSY5Y細(xì)胞中的SIRT1（q=21.65，P＜0.01）及 PGC-1α（q=7.303，P＜0.05）表達(dá)水平均明顯下降；與損傷組相比，預(yù)處理組中SIRT1（q=12.05，P＜0.01）和PGC-1α（q=6.316，P＜0.05）的表達(dá)明顯增加。見(jiàn)圖4。

圖4 各組細(xì)胞SIRT1及 PGC-1α相對(duì)表達(dá)量的比較

2.5 各組細(xì)胞 PGC-1α mRNA轉(zhuǎn)錄水平的比較

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，3組細(xì)胞中PGC-1α mRNA轉(zhuǎn)錄水平間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值 = 2.333，P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組細(xì)胞PGC-1α mRNA轉(zhuǎn)錄水平的比較

3 討論

本研究采用的COXⅠ抑制劑魚(yú)藤酮可在整體和細(xì)胞水平上較好地模擬帕金森病發(fā)病過(guò)程中的重要病理學(xué)、行為學(xué)變化，是公認(rèn)的帕金森病損傷模型［15］。本研究成功構(gòu)建了魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，魚(yú)藤酮作用后的細(xì)胞存活率和 COXⅠ活性明顯降低，給予丙戊酸鈉可明顯改善細(xì)胞存活并有效提高細(xì)胞 COXⅠ活性。

心磷脂是一種四鏈?；字?，廣泛存在于高等動(dòng)物、植物和微生物界。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，心磷脂在線粒體內(nèi)膜含量豐富［16］。ALCAT1可催化脂酰輔酶 A形成三脂酰心磷脂，即發(fā)生心磷脂重構(gòu)［17］。心磷脂重構(gòu)發(fā)生后一方面將影響線粒體氧化呼吸鏈中重要的氧化磷酸化酶系活力，進(jìn)而造成線粒體功能障礙；另一方面 ALCAT1可識(shí)別遭受活性氧攻擊后產(chǎn)生的心磷脂重塑靶蛋白，使其結(jié)構(gòu)進(jìn)一步改變，造成惡性循環(huán)［18］。研究顯示，氧化應(yīng)激和線粒體失能均可導(dǎo)致 ALCAT1過(guò)表達(dá)，進(jìn)而增加相關(guān)疾病發(fā)生的危險(xiǎn)［19］，而抑制 ALCAT1的表達(dá)可改善氧化應(yīng)激損傷［18］。本研究結(jié)果與以上報(bào)道一致的是魚(yú)藤酮作用后細(xì)胞中的 ALCAT1表達(dá)水平較對(duì)照組明顯上調(diào)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸鈉預(yù)處理可明顯下調(diào)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)損傷細(xì)胞中的 ALCAT1表達(dá)，提示丙戊酸鈉改善魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞 COXⅠ活性下降與下調(diào)ALCAT1表達(dá)水平有關(guān)。

在帕金森病的病理進(jìn)程中，因 COXⅠ氧化水平被抑制，NADH生成的NAD+下降，并導(dǎo)致受NAD+調(diào)控的SIRT1脫乙酰酶活性顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)［8，20］，SIRT1可通過(guò)與 PGC-1α形成復(fù)合物，促進(jìn)PGC-1α的脫乙?；?，增加其活性，進(jìn)而增強(qiáng)線粒體的能量代謝及增殖水平。本研究顯示魚(yú)藤酮誘導(dǎo)損傷細(xì)胞中的SIRT1和 PGC-1α表達(dá)水平明顯降低，值得注意的是我們發(fā)現(xiàn)丙戊酸鈉預(yù)處理可明顯上調(diào)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)損傷細(xì)胞中 SIRT1和 PGC-1α表達(dá)水平，但丙戊酸鈉對(duì) PGC-1α mRNA轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯影響，這從側(cè)面說(shuō)明丙戊酸鈉的作用是通過(guò)增強(qiáng)SIRT1的表達(dá)及SIRT1的脫乙酰酶活性，促進(jìn)SIRT1 與PGC-1α形成復(fù)合體，促進(jìn) PGC-1α的脫乙?；?，使得PGC-1α的表達(dá)水平增高。我們的研究結(jié)果與Nemoto等［8］的報(bào)道基本一致。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸鈉可通過(guò)抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的損傷細(xì)胞中ALCAT1的表達(dá)，提高COXⅠ的活性進(jìn)而上調(diào)了SIRT1和PGC-1α的表達(dá)，發(fā)揮其對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的損傷細(xì)胞的保護(hù)作用，具體機(jī)制有待于今后進(jìn)一步的研究。

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Sodium valproate had protective effect on rotenone induced injury in SH-SY5Y cells

LI Yun-zi，QIU Jing，SUN Jing，GAO Jing
（School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

R741.05

A

1671-7783（2015）01-0005-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140277

江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK20140574）；江蘇大學(xué)高級(jí)專(zhuān)業(yè)人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（13JDG063，13JDG001）［作者簡(jiǎn)介］李蕓子（1988—），女，碩士研究生；高靜（通訊作者），教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail:jinggao@ujs.edu.cn

2014-10-22 ［編輯］陳海林