王強，吳沂芮，朱靖剛，金珉，陸榮柱，肖杭（.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 03；.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 009）

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

雙酚A通過雌激素受體影響小鼠睪丸和附睪蘭尼堿受體基因的表達

王強1，吳沂芮1，朱靖剛1，金珉1，陸榮柱1，肖杭2
（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210029）

目的：觀察雙酚A對雄性小鼠睪丸和附睪中蘭尼堿受體（ryanodine receptors，RyRs）基因表達的影響及雌激素受體（estrogen receptor，ERα和 ERβ）在其中的作用。方法：將野生型小鼠、ERα基因敲除小鼠（αERKO）和 ERβ基因敲除小鼠（βERKO）均隨機分為雙酚A組［100 μg/（kg·d）］和對照組，經(jīng)口灌胃染毒 30 d后（對照組以玉米油灌胃），熒光定量PCR法檢測睪丸和附睪中RyR1，RyR2和RyR3 mRNA表達的變化。結(jié)果：雙酚A可使小鼠睪丸中RyR1和RyR3 mRNA表達水平均明顯升高，而RyR2 mRNA表達水平顯著降低，附睪中RyR1、RyR2和RyR3 mRNA表達水平明顯升高（P均＜0.05）。應(yīng)用 ERKO小鼠實驗結(jié)果顯示，雙酚A通過 ERα和 ERβ影響睪丸RyR2以及附睪RyR2和RyR3 mRNA的表達，對附睪RyR1 mRNA的調(diào)控則依賴于 ERα。結(jié)論:雙酚A可以影響雄性小鼠睪丸和附睪中蘭尼堿受體3種亞型的基因表達，ERα和 ERβ在此過程中發(fā)揮了重要作用。

雙酚A；蘭尼堿受體；雌激素受體基因；小鼠

［Abstract］Objective:To explore the possible effects of bisphenol A on ryanodine receptors（RyRs）in mouse testis and epididymis，the role of the two ERs was also investigated.Methods:Adult male wild type （WT），ERs knock out mice（αERKO and βERKO）were randomly divided into control and bisphenol A ［100 μg/（kg·d）for 30 days via intragastric administration］treatment groups.Quantitative real time PCR was used to examine RyR1，RyR2 and RyR3 genes of the testis and epididymis.Results:The mRNA expression of RyR1 and RyR3 were increased in bisphenol A-treated animals，however，RyR2 was evidently decreased.In the epididymis，the mRNA expression of RyR1，RyR2 and RyR3 were significantly increased （P＜0.05）.Bisphenol A up-regulation of RyR1 of the epididymis mRNA expression was dependent on ERα，whereas bisphenol A regulation of RyR2 of the testis and RyR2，RyR3 of the epididymis appeared to be dependent on both ERα and ERβ.Conclusion:The ERs signalling was necessary for the regulation of the RyR channels mRNA expression by bisphenol A，which could affect the male reproductive function.

［Key words］bisphenol A；ryanodine receptors；estrogen receptors；mouse

雙酚A是制造聚碳酸酯塑料、食品罐頭的內(nèi)襯以及一些紙質(zhì)收據(jù)的原料。材質(zhì)試驗研究發(fā)現(xiàn)，市售的奶瓶、奶杯、瓶子、薄膜等均可檢出雙酚A，而且蔬菜罐頭等食品中也可檢出雙酚A，表明食品包裝材料中的雙酚A會遷移至食品中。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同年齡、不同地區(qū)人群尿液和血液中均可檢測到雙酚A。雙酚A屬于環(huán)境雌激素，化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素結(jié)構(gòu)類似，能夠與雌激素受體（estrogen receptors，ERs）結(jié)合，影響細胞信號傳導(dǎo)途徑或模仿及干擾內(nèi)源性雌激素的作用。在低濃度長時間暴露的情況下，雙酚A可以對原代和子代生殖系統(tǒng)及其發(fā)育、對腦和神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生不良影響［1］。

國外研究發(fā)現(xiàn)，雙酚A能夠透過血睪屏障并直接干擾精子的生長發(fā)育及活性，從而對雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用［2］，引起生殖障礙及發(fā)育異常。我們前期的實驗結(jié)果也顯示，雙酚A可導(dǎo)致雄性小鼠睪丸組織發(fā)生病理變化，附睪臟器系數(shù)降低，精子畸形率升高；應(yīng)用雌激素受體基因敲除（αERKO和βERKO）小鼠模型發(fā)現(xiàn) ERα和 ERβ在雙酚A影響雄性生殖系統(tǒng)功能的過程中可能起了重要作用［3］。

胞內(nèi) Ca2+濃度的改變是雄性生殖細胞信號通路中重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因素，參與調(diào)節(jié)精子和生精細胞不同水平的生理活動［4］。蘭尼堿受體（ryanodine receptors，RyRs）是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)上的一種內(nèi)鈣釋放通道，能迅速將 Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)中釋放出來，從而發(fā)揮一系列的生理功能。根據(jù)分布和生物物理學(xué)特征的不同，RyRs可分為 3個亞型: RyR1、RyR2、RyR3。蛋白質(zhì)印跡和熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在小鼠睪丸發(fā)育到成熟過程中均有RyR1的表達，主要表達于精原細胞、粗線期精母細胞和圓形精子細胞［5］。實驗研究發(fā)現(xiàn)雙酚A可以引起神經(jīng)和生殖系統(tǒng)等多種細胞胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。Quesada等［6］發(fā)現(xiàn)雙酚A與膜雌激素受體結(jié)合后可以促進細胞內(nèi) Ca2+的迅速釋放進而導(dǎo)致細胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高。雙酚A通過外鈣內(nèi)流的途徑升高HT-22海馬神經(jīng)元細胞胞內(nèi) Ca2+濃度［7］；四溴雙酚A能夠升高小鼠睪丸支持細胞株 TM4細胞胞內(nèi)Ca2+濃度［8］。

本研究采用動物實驗探討環(huán)境雌激素雙酚A對雄性小鼠睪丸和附睪中RyRs基因表達的影響，并通過應(yīng)用ERα基因敲除小鼠（αERKO）和 ERβ基因敲除小鼠（βERKO）觀察 ERα和 ERβ在此過程中的作用，為以雙酚A為代表的環(huán)境雌激素生殖毒性機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

野生型小鼠（WT）、αERKO和βERKO小鼠，均為雄性，18～22 g，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心 SPF級屏障環(huán)境中。DMSO、玉米油和雙酚A為Sigma公司產(chǎn)品，總RNA提取試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量 PCR試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。梯度基因擴增儀（Biometra公司，德國），ABI7300熒光定量 PCR儀（ABI公司，美國）。

1.2 方法

雙酚A溶于 DMSO中配成母液（10 mg/mL），用玉米油稀釋成10 μg/mL。野生型小鼠隨機分成2組:雙酚A組和對照組，每組10只。雙酚A組小鼠連續(xù)30 d經(jīng)口灌胃雙酚A染毒，劑量為100 μg/ （kg·d）；對照組小鼠給予溶解于 DMSO的玉米油。ERKO小鼠分組和處理方法同野生型小鼠。處死小鼠后，分離睪丸和附睪。利用 Trizol法提取組織中的總 mRNA。按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑說明書對提取的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，然后應(yīng)用 ABI7300熒光定量PCR儀進行實時定量PCR，引物序列見表1，基因定量采用18s rRNA作為內(nèi)參，用公式 2-△△CT計算。每個樣品重復(fù)4次，用熔解曲線確定 PCR產(chǎn)物是否單一，根據(jù)標準曲線得出擴增效率。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù) ±標準差的形式表示，兩組間比較用t檢驗，多組間的比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3類小鼠睪丸和附睪組織RyRs mRNA的相對表達量

熒光定量 PCR實驗結(jié)果顯示，與野生型小鼠比較，αERKO和βERKO小鼠睪丸中RyR1和RyR2 mRNA的表達水平均明顯降低，RyR3 mRNA表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。RyR1和RyR2 mRNA表達水平在αERKO小鼠附睪中明顯升高，而在βERKO小鼠附睪中的表達顯著降低；RyR3 mRNA在αERKO和βERKO小鼠的表達水平均明顯降低（P均＜0.05）。見圖1。

圖1 3類小鼠睪丸和附睪組織各亞型蘭尼堿 mRNA的表達水平

2.2 雙酚A對各類小鼠睪丸和附睪RyRs mRNA表達的影響

采用熒光定量PCR實驗，觀察雙酚A對雄性野生型小鼠睪丸和附睪RyR1、RyR2和RyR3 mRNA表達的影響。結(jié)果顯示，與對照組（玉米油）比較，雙酚A組小鼠睪丸RyR1和RyR3 mRNA表達明顯升高，但RyR2 mRNA表達水平明顯降低（P均＜0.05）。附睪中RyR 3種亞型的表達水平均明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

與雙酚A影響野生型小鼠RyRs結(jié)果（升高）類似，雙酚A能明顯升高αERKO和βERKO小鼠睪丸組織中RyR1和RyR3 mRNA的表達（P＜0.05）。但睪丸中RyR2 mRNA表達水平亦明顯升高（P＜0.05），這個結(jié)果與野生型組的結(jié)果（降低）相反。雙酚A能夠使αERKO小鼠附睪中RyR1 mRNA表達明顯降低（P＜0.05），但βERKO小鼠附睪RyR1 mRNA表達明顯升高。與野生型小鼠結(jié)果（升高）不同，雙酚A明顯降低了αERKO和βERKO小鼠附睪RyR2和RyR3 mRNA的表達水平（P均＜0.05）。見圖2。

圖2 雙酚A對野生型和 ERKO小鼠睪丸和附睪蘭尼堿受體 mRNA表達的影響

3 討論

大量動物實驗證明雙酚A可以影響雄性生殖系統(tǒng)［9］。細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)及 Ca2+濃度在生精細胞分化成熟、精子頂體反應(yīng)和獲能過程中均發(fā)揮著重要作用。許多實驗研究結(jié)果顯示，雙酚A可以引起細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化并影響調(diào)控鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)的離子通道或受體的表達。雙酚A可以影響小鼠腎臟和十二指腸中兩種參與鈣轉(zhuǎn)運的基因TRPV5和CaBP-9k表達，提示雙酚A可以通過改變調(diào)控鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)的離子通道或受體表達來影響胞內(nèi) Ca2+濃度［10］。研究還發(fā)現(xiàn)雙酚A可以升高 HT-22細胞、大鼠海馬神經(jīng)元等多種細胞胞內(nèi)Ca2+濃度，并提示雙酚A引起胞內(nèi) Ca2+濃度升高可能是通過外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放兩類途徑。我們以前的實驗也發(fā)現(xiàn)雙酚A能夠呈濃度依賴性增加精母細胞系 GC-2細胞胞內(nèi)Ca2+濃度，并影響鈣調(diào)蛋白、鈣調(diào)蛋白激酶2及其磷酸化的表達［11］。本研究觀察了雙酚A對雄性小鼠睪丸和附睪中位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)上的內(nèi)鈣釋放通道RyRs表達的影響，探討雙酚A影響胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的可能作用途徑。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)雙酚A能夠模擬雌激素的作用，通過雌激素受體介導(dǎo)機制對雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用［3］。為了觀察雙酚A通過雌激素受體對雄性小鼠生殖系統(tǒng)中調(diào)控胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)具有重要作用的RyRs的影響，本研究采用動物體內(nèi)試驗和熒光定量 PCR檢測基因的表達。結(jié)果提示雙酚A通過 ERα和 ERβ影響睪丸RyR2和附睪RyR2、RyR3 mRNA表達，對附睪RyR1 mRNA的調(diào)控則依賴于 ERα。

蘭尼堿受體對保持胞內(nèi)鈣的平衡起著重要作用。我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙酚A可以影響蘭尼堿受體3種亞型的基因表達，ERα和 ERβ在此過程中發(fā)揮了重要作用，提示雙酚A可能會以蘭尼堿受體為作用靶點影響胞內(nèi)鈣離子濃度以及生殖細胞的功能。但雙酚A可能還通過其他途徑影響雄性生殖系統(tǒng)，這尚需進一步的研究來證實。

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Effects of bisphenol A on ryanodine receptors in mouse testis and epididymis:role of estrogen receptors

WANG Qiang1，WU Yi-rui1，ZHU Jing-gang1，JIN Min1，LU Rong-zhu1，XIAO Hang2
（1.School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.School of Public Health，Nanjing Medical University，Nanjing Jiangsu 210029，China）

R992

A

1671-7783（2015）01-0001-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y140276

國家自然科學(xué)基金資助項目（81400911）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項目（BK20140573）；中國博士后科學(xué)基金資助項目（2014M560407）；江蘇大學(xué)高級人才基金資助項目（12JDG083）；江蘇省博士后科研基金資助項目（1301045B）；現(xiàn)代毒理學(xué)教育部重點實驗室（南京醫(yī)科大學(xué)）開放基金資助項目（NMUMT201402）

王強（1983—），男，山東壽光人，講師，博士，主要從事毒理學(xué)研究。

2014-10-22 ［編輯］陳海林