王惠君 ，盧 誠 ，黎 明 ，陳 友

（1.瓊州學(xué)院商學(xué)院，海南 三亞 572022；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101）

早在90年代石健泉[1]、熊子成[2]對(duì)廣西黃皮種質(zhì)資源進(jìn)行過調(diào)查，之后的20a間對(duì)黃皮的研究大都在黃皮果的營養(yǎng)價(jià)值[3]、化學(xué)成分[4-5]、栽培技術(shù)[6-7]、開發(fā)利用[8]等方面。隨著當(dāng)代社會(huì)快速發(fā)展，原有的優(yōu)良黃皮種質(zhì)資源不能滿足于市場的需求，迫切需要對(duì)原有優(yōu)良黃皮品質(zhì)進(jìn)行改良，尤其是黃皮果果品品質(zhì)的儲(chǔ)運(yùn)方面缺陷成為黃皮產(chǎn)業(yè)的瓶頸，同時(shí)廣西各地黃皮資源的質(zhì)量性狀參差不齊[9-12]，且果實(shí)口味各不相同，黃皮原材料將很難大規(guī)模開發(fā)利用。利用分子輔助育種方法用于發(fā)掘優(yōu)良品質(zhì)資源或改良有部分缺陷的優(yōu)良資源在現(xiàn)代栽培種植中就顯得具有緊迫性。分子遺傳多樣性方面的研究比較薄弱，綜合比較各類分子標(biāo)記的優(yōu)勢，本研究選用操作簡便具有較好的重復(fù)性且多態(tài)性較為豐富的ISSR[13-16]標(biāo)記技術(shù)做黃皮親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析，為今后的品種選育和分子輔助改良育種提供一定的分類依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

24份黃皮種質(zhì)，如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立

基因組DNA采用實(shí)驗(yàn)室成熟的方法改良CTAB法[17]提取，通過正交實(shí)驗(yàn)方法對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化后建立20μL反應(yīng)體系，其中ISSR引物為UBC公布的序列[14]。反應(yīng)體系如下：Taq酶量1.5U，DNA模板為50ng，引物濃度為 0.5μmol/L，dNTPs濃度為 0.3mmol/L，Mg2+濃度為2.0mmol/L，最后用超純水補(bǔ)充至20μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序如下設(shè)置：預(yù)變性溫度/時(shí)間-94℃/5min；變性溫度/時(shí)間-94℃/35s；退火溫度/時(shí)間-50℃/60s；延伸溫度/時(shí)間-72℃/90s，37 個(gè)循環(huán)，最后延伸-72℃（10min），擴(kuò)增產(chǎn)物將貯存于4℃條件下。

表1 24份黃皮種質(zhì)信息

1.2.2 數(shù)據(jù)的分析和處理

呈現(xiàn)為顯性標(biāo)記的ISSR分子標(biāo)記，在數(shù)據(jù)分析時(shí)根據(jù)該分子標(biāo)記特點(diǎn)的遷移率及有無來統(tǒng)計(jì)，無條帶統(tǒng)計(jì)為0，有條帶統(tǒng)計(jì)為1，強(qiáng)、弱條帶均統(tǒng)計(jì)為1，將數(shù)據(jù)以“0，1”輸入Excle 2003文檔中構(gòu)建矩陣數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)出總帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)、各引物多態(tài)性比率。用生物學(xué)NTEDIT軟件將該矩陣數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為可用于聚類分析軟件NTSYS-PC分析的NTS矩陣數(shù)據(jù)格式，然后將計(jì)算得出的遺傳相似系數(shù)數(shù)據(jù)按照UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，繪制出該物種的樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性分析

該實(shí)驗(yàn)從96個(gè)引物中，篩選出18個(gè)多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的ISSR引物對(duì)所收集的24份黃皮優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測。結(jié)果如下：共擴(kuò)增出的條帶172條，其中多態(tài)性條帶105條，多態(tài)性比率為61.0%。各引物平均能夠擴(kuò)增出9.56條多態(tài)性條帶，擴(kuò)增位點(diǎn)最少的引物是GXHP-8，其位點(diǎn)數(shù)為6，其中擴(kuò)增位點(diǎn)最多的引物是GXHP-6，其位點(diǎn)數(shù)為17。實(shí)驗(yàn)表明所供黃皮實(shí)驗(yàn)材料多態(tài)性豐富。18條ISSR引物產(chǎn)生的多態(tài)性條帶詳見表2、圖 1。

表2 18條ISSR-PCR引物擴(kuò)增結(jié)果

圖1 GXHP-3引物對(duì)24份優(yōu)質(zhì)黃皮品種ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 聚類分析

通過所選ISSR-PCR引物組合擴(kuò)增所得到的帶紋結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后轉(zhuǎn)換并獲得172個(gè)標(biāo)記的矩陣數(shù)據(jù)。將用構(gòu)建的矩陣數(shù)據(jù)導(dǎo)入NTSYS-PC軟件計(jì)算得到24份黃皮優(yōu)良品種種質(zhì)材料相關(guān)的遺傳相似系數(shù)（GS）詳情見表3。參照UPGMA聚類分析方法計(jì)算出所測定材料的親緣關(guān)系圖譜（如圖2所示）。24份優(yōu)質(zhì)黃皮品種間的遺傳相似系數(shù)取值范圍在0.660～1.000區(qū)間。南寧無核（1）、欽州無核（12）、玉林無核（7）、防城港無核（24）、河池?zé)o核（18）品種間相似度較高，遺傳相似系數(shù)在0.961以上。其中欽州無核（12）和南寧無核（1）之間的遺傳相似系數(shù)為1.000。山黃皮品種與其他品種間的遺傳相似性系數(shù)最小為0.660。以上數(shù)據(jù)可以說明，所搜集的24份優(yōu)質(zhì)黃皮種質(zhì)之間的親緣關(guān)系除了山黃皮外其他各品種的親緣關(guān)系相對(duì)較近。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.718時(shí)將黃皮優(yōu)質(zhì)品種資源分為3個(gè)大的群體，各個(gè)大的群體又包含不同的品種。其中第I大群體包括了4品種，由獨(dú)核、無核、水晶、牛奶組成；在第II大群體里由大圓頭、卵形、雞心形3個(gè)品種。在第III群僅有山黃皮1個(gè)品種。

3 討論

在I群體中包含獨(dú)核、無核、水晶、牛奶4個(gè)品種。在遺傳相似系數(shù)為0.96時(shí)，來源于5個(gè)不同地方的無核黃皮聚合在一起，其中來源于欽州無核和南寧無核黃皮GS系數(shù)為1.000。欽州無核在廣西栽培最多，極有可能南寧無核是從欽州引種的。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.931時(shí)，無核與獨(dú)核品種聚合在一起，說明這兩個(gè)品種遺傳背景較為相似，間接說明無核很有可能是獨(dú)核的一個(gè)變種。要想確定這兩個(gè)品種的具體關(guān)系還要做進(jìn)一步的研究。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.828時(shí)獨(dú)核和無核與水晶聚合在一起，說明獨(dú)核、無核與水晶的遺傳背景較近；當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.795時(shí)，獨(dú)核、無核、水晶與牛奶聚合在一起。其中同一品種牛奶黃皮品種由于來源不同，遺傳相似系數(shù)較遠(yuǎn)，很有可能是由地域阻隔等外界因素的影響對(duì)遺傳背景產(chǎn)生的變異。在II群體中包含有大圓頭、卵形和雞心黃皮3個(gè)品種。雖然有地域上的差異，但是從整體上看都是以相同品種的黃皮首先聚合在一起。其中只有一個(gè)雞心黃皮品種有交叉，在遺傳相似性系數(shù)為0.836時(shí)河池雞心（20）與卵形、大圓頭黃皮聚合在一起，當(dāng)遺傳系數(shù)為0.782時(shí)河池雞心（20）、卵形、大圓頭與南寧雞心（5）和玉林雞心（10）聚合在一起。在進(jìn)化地位上推斷，很有可能卵形和大圓頭是由雞心品種進(jìn)化而來。要想明確具體進(jìn)化情況要做進(jìn)一步的研究。在III群只有山黃皮一個(gè)品種，在南寧山黃皮（6）和梧州山黃皮（18）遺傳相似系數(shù)在0.893時(shí)才聚合，同時(shí)也可以說明由于山黃皮屬于小眾水果，有的山黃皮資源屬于半野生狀態(tài)，由于地域的阻隔，遺傳基因交流也相對(duì)較少。山黃皮與黃皮屬于同一個(gè)屬但不同種，在聚類分析的數(shù)據(jù)結(jié)果中山黃皮與其他各類黃皮的遺傳相似性系數(shù)為0.660，相似性相對(duì)較小，這一結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)標(biāo)記分類相吻合，也為山黃皮與黃皮的親緣關(guān)系提供了科學(xué)的技術(shù)支持。由于山黃皮與黃皮的遺傳的差異性相對(duì)較大，因而山黃皮可以作為優(yōu)質(zhì)黃皮品種改良的潛在基因庫。

表3 24份黃皮優(yōu)質(zhì)品種種質(zhì)間遺傳相似性數(shù)據(jù)

圖2 基于ISSR標(biāo)記的24份品種材料的UPGAME聚類分析圖譜

品種遺傳改良的各種方法中，作為最為原始的人工雜交方法是最為有效的。如果遺傳背景較為復(fù)雜的條件下，憑借傳統(tǒng)的方法如形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記等方法還余存較多的爭議，無法判斷兩兩品種之間的遺傳背景現(xiàn)狀。因而傳統(tǒng)遺傳改良育種方法帶有盲目性。為了解各個(gè)品種之間的親緣關(guān)系，我們可以采取分子標(biāo)記的方法，快速的對(duì)所提供的優(yōu)良品種在分子水平進(jìn)行分析各品種之間的親緣關(guān)系。利用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種間進(jìn)行遺傳改良育種，為今后更有目標(biāo)、有預(yù)見的引種和育種，進(jìn)而縮短育種年限和提高育種效率提供理論依據(jù)，同時(shí)也可為所研究品種間的親緣關(guān)系和進(jìn)化地位提供佐證。在此試驗(yàn)中選擇的廣西各地主要推廣的8個(gè)優(yōu)質(zhì)黃皮品種種質(zhì)資源進(jìn)行分析，從所得的聚類分析結(jié)果上與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法大致相同。

4 結(jié)論

在96個(gè)的ISSR-PCR引物中篩選出18個(gè)具有重復(fù)性和多態(tài)性較好引物，對(duì)24份優(yōu)質(zhì)推廣黃皮品種種質(zhì)資源材料進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析，共獲得172個(gè)位點(diǎn)，其中的105個(gè)是具有多態(tài)性的，多態(tài)性比率為61.0%。在遺傳相似性系數(shù)為0.718時(shí)將24份黃皮品種種質(zhì)資源分為3個(gè)大群。該試驗(yàn)結(jié)果不僅在黃皮形態(tài)學(xué)上分類鑒定提供了佐證，也為優(yōu)質(zhì)黃皮品種間的親緣關(guān)系給予初步鑒定，為優(yōu)質(zhì)黃皮品種種質(zhì)資源的開發(fā)研究領(lǐng)域提供新的方法。

［1］石健泉.廣西黃皮果資源調(diào)查［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1991，4（4）：15-19.

［2］熊子成.欽州地區(qū)黃皮種質(zhì)資源調(diào)查［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1992，12（1）：24-26.

［3］張永明，黃亞非，黃際薇，等，黃皮果氨基酸成分分析［J］.中藥材，2006，29（9）：921-924.

［4］鐘秋平，林美芳.黃皮果中總黃酮含量的測定及其黃酮種類的鑒別［J］.食品科學(xué)，2007，27（8）：411-413.

［5］馬超，劉杰鳳，周天，等.黃皮果多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（8）：290-292.

［6］黃慧茵，王承南，周歡，等，黃皮樹種子育苗技術(shù)［J］.經(jīng)濟(jì)林研究，2009，27（2）：147-149

［7］劉新強(qiáng)，黃文青.黃皮優(yōu)質(zhì)高效栽培技術(shù)［J］現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010 ，（3）：138-139.

［8］王文文，湯敬謙，張東峰.我國黃皮的生產(chǎn)及開發(fā)利用研究現(xiàn)狀［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（13）：5945-5946.

［9］江海林，江根玲，伍麗芳.黃皮早結(jié)豐產(chǎn)栽培［M］.廣州：廣東科技出版社，2000：11-12.

［10］吳健華，趙向陽.無核黃皮的形成機(jī)理及主要品種［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，35（2）：116-117.

［11］潘建平，袁沛元，曾楊，等.華南地區(qū)黃皮良種、生產(chǎn)現(xiàn)狀與發(fā)展對(duì)策［J］廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，（1）：103-104.

［12］潘建平.黃皮種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008.

［13］朱巖芳，祝水金，李永平，等.ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在植物種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用［J］.種子，2010，29（2）55-59.

［14］Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genmoe fingerinting by simple se-quence repeats（SSR）-anhored polymerease chain reaction amplification［J］.Genmoics，1994，20：176-183.

［15］盧家仕，卜朝陽，呂維莉，等，不同產(chǎn)地石斛屬種質(zhì)資源的 ISSR 遺傳多樣性分析［J］.中草藥，2013，44（1）：96-100.

［16］李偉，李莉，陳振江.ISSR標(biāo)記不同產(chǎn)地的大戟科狼毒種質(zhì)資源多樣性分析［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16（3）：50-52.

［17］劉曉靜，王海燕，張根良，等.改良CTAB法提取益智基因組 DNA［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，19（8）：111-112.