楊加鵬 曹宇 黃云超 李光劍 葉聯(lián)華 趙光強(qiáng) 雷玉潔 陳小波 田林瑋

云南省宣威地區(qū)是中國乃至世界肺癌的高發(fā)區(qū)，據(jù)2005年當(dāng)?shù)亓餍胁W(xué)資料顯示，肺癌發(fā)病率來賓鎮(zhèn)為128.31/10萬[1,2]。肺癌已成為制約當(dāng)?shù)厣鐣?huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和影響社會(huì)民生的重要因素。有研究[3-5]表明，其原因可能與所燒燃煤相關(guān)。宣威地區(qū)地處云南東北部，擁有豐富的煤炭資源，該區(qū)煤層屬于滇東黔西晚二疊紀(jì)聚煤區(qū)，該煤區(qū)C1煤層中納米二氧化硅的富集[3]。在宣威各鄉(xiāng)鎮(zhèn)的肺癌發(fā)病率也不盡相同（寶山鎮(zhèn)18/10萬，文興鎮(zhèn)5.83/10萬），呈點(diǎn)狀高發(fā)。尋找該地區(qū)肺癌的發(fā)病原因以及發(fā)病機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。然而煤炭是當(dāng)?shù)刂饕纳钊剂?，燃煤是?dāng)?shù)厥覂?nèi)污染的主要來源。一些研究[4,5]表明宣威肺癌高發(fā)與室內(nèi)煙煤燃燒產(chǎn)生的多環(huán)芳烴等污染物以及納米級(jí)二氧化硅有關(guān)。

本研究根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍胁≠Y料，取不同肺癌發(fā)病率地區(qū)所產(chǎn)煤樣，進(jìn)行燃燒試驗(yàn)，對(duì)可吸入細(xì)顆粒物（PM2.5）成分進(jìn)行分析，探討可吸入細(xì)顆粒物特征；了解細(xì)顆粒物在宣威地區(qū)的肺癌患者的術(shù)后標(biāo)本中的賦存情況。

1 材料與方法

1.1 材料 分別選取宣威市來賓鎮(zhèn)老林煤礦C1煤層、寶山鎮(zhèn)虎場(chǎng)煤礦K7煤層、文興鎮(zhèn)太平煤礦采集M30煤層、原煤各30份，每份2 kg（由云南省煤炭研究院提供）；過氯乙烯塵測(cè)濾膜，購自北京康農(nóng)興牧科技發(fā)展中心公司；病理組織由昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科提供。

1.2 儀器和設(shè)備 Sartorius電子分析天平德國Sartorius公司；XL30ESEM-TMP掃描電子顯微鏡荷蘭飛利浦公司；Phoenix+DIM一體化能譜及電子背散射衍射儀美國EDAXH800透射電子顯微鏡日本日立公司；ZSX100e型波長色散X射線熒光光譜儀日本理學(xué)（Rigaku）公司；TTR-?型轉(zhuǎn)靶多功能X射線衍射儀日本理學(xué)（Rigaku）公司；空氣污染檢測(cè)儀（PM2.5切割器、采樣系統(tǒng)）TE-6070VFC/Tisch Environmental Equipment. Ltd, USA。

1.3 煙煤燃燒方法 將所取煤樣切割成約5 cm×5 cm×5 cm的方形小塊，置于開放式火塘中，用液化氣噴燈引燃，每個(gè)煤樣燃燒時(shí)間約為30 min，同時(shí)采用空氣污染檢測(cè)儀對(duì)室內(nèi)空氣進(jìn)行恒流采樣（30 min, 100 L/min）。

1.4 空氣采樣方法 將校正好的空氣細(xì)顆粒物采樣儀器放置在模擬燃燒室內(nèi)（3.5 m×4 m×5 m），固定在三角架上，使采樣頭（PM2.5切割器、采樣系統(tǒng)：切割粒徑Da50=（2.5±0.2）μm；單次采樣結(jié)束后更換濾膜，各煤樣分別采樣濾膜30張。將完好的濾膜分別放入單獨(dú)的封口袋中，密封并置于4 ℃冰箱中保存。采樣前后對(duì)濾膜進(jìn)行稱重備用。重量法測(cè)定空氣中可吸入細(xì)顆粒物的濃度。

1.5 空氣濾膜檢測(cè)方法 采用X射線熒光光譜儀（X-ray fluorescence spectrometry, XRF）對(duì)濾膜進(jìn)行分析F（9）-U（92）之間所有元素的檢測(cè)分析。采用X射線衍射儀（X-ray diffraction, XRD）對(duì)濾膜上晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定分析功能的檢測(cè)分析。采用掃描電子顯微鏡SEM對(duì)濾膜上的顆粒物形態(tài)進(jìn)行觀察。透射電子顯微鏡對(duì)濾膜進(jìn)行觀察，同時(shí)行能量分散X射線（EDX）分析檢測(cè)。透射電子顯微鏡對(duì)濾膜進(jìn)行觀察宣威地區(qū)的肺癌組織標(biāo)本，尋找可吸入顆粒物，并對(duì)顆粒物進(jìn)行定位。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以Mean±SD的方式顯示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組煙煤燃燒產(chǎn)生的PM2.5 三組煙煤燃燒后經(jīng)重量法計(jì)算空氣中每30 min的PM2.5濃度分別為C1煤（8.244±1.460）mg/m3、K7煤（5.066±0.984）mg/m3、M30煤（5.071±0.869）mg/m3；將C1組與K7、M30組經(jīng)過比較空氣中PM2.5濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029）。

2.2 各組PM2.5的X射線熒光光譜儀結(jié)果 通過X射線熒光光譜儀（XRF）對(duì)三種不同的濾膜進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)C1煤層燃燒產(chǎn)物中濾膜上的雜質(zhì)有Si和O元素富集，其他兩個(gè)地方的較少（圖1），此外，三組濾膜上否發(fā)現(xiàn)了C、S、O的聚集，部分濾膜上有Ca、Al元素的聚集（圖1）。

2.3 各組PM2.5的X射線衍射結(jié)果 通過XRD對(duì)三種不同的濾膜進(jìn)行檢測(cè) 發(fā)現(xiàn)C1煤燃燒煙塵中含有結(jié)晶型SiO2細(xì)顆粒物，而K7和M30煤燃燒煙塵中未檢測(cè)到結(jié)晶型SiO2細(xì)顆粒物存在（圖2）。

2.4 三組濾膜上顆粒物的形態(tài)各不相同 掃描電鏡觀察三種煙煤燃燒的PM2.5的情況，C1煤層的燃燒產(chǎn)物與K7和M30煤層相比所產(chǎn)生的顆粒物形態(tài)不規(guī)則，成團(tuán)塊狀，含有較多的雜質(zhì)（圖3，圖4）。透射電鏡下觀察C1煤燃燒后煙塵中PM2.5形態(tài)及能譜分析，通過透射電鏡觀察C1煤煙塵中分離出的含硅顆粒物形態(tài)，發(fā)現(xiàn)這些顆粒物表面不光滑，形態(tài)欠規(guī)整，取其中顆粒物測(cè)量直徑為30.74 nm；用透射電鏡裝配的能譜儀分析，此顆粒物中含有Si、Ca、O等元素，其中以Si元素含量最高（圖5）。

2.5 電子顯微鏡觀察結(jié)果 對(duì)宣威地區(qū)的肺癌患者的術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行電子顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，在宣威市來賓地區(qū)的肺癌患者術(shù)后病理標(biāo)本中，可觀察到有納米級(jí)細(xì)顆粒存在，主要分于患者肺部組織的細(xì)胞核內(nèi)，部分在胞漿內(nèi)（圖6）。

圖1 XRF結(jié)果。A：C1煤燃燒產(chǎn)物的XRF；B：K7煤燃燒產(chǎn)物的XRF；C：M30煤燃燒產(chǎn)物的XRF。Fig1 XRF results. A: Result of the C1 Coal combustion products XRF; B: Result of the K7 Coal combustion products XRF; C: Result of the M30 Coal combustion products XRF. XRF: X-ray fluorescence spectrometry.

圖2 XRD結(jié)果。A：C1煤層XRD檢測(cè)結(jié)果；B：K7煤層XRD檢測(cè)結(jié)果；C：M30煤層XRD檢測(cè)結(jié)果。Fig2 XRD results. A: C1 coal XRD test results; B: K7 coal XRD test results; C: M30 coal XRD test results.

圖3 可吸入顆粒物圖片。A：過氯乙烯濾膜上截留的C1煤燃可吸入顆粒物（×1,500）；B：過氯乙烯濾膜上截留的K7煤燃可吸入顆粒物（×1,500）；C：過氯乙烯濾膜上截留的M30煤燃可吸入顆粒物（×1,500）。Fig3 Respirable particulate matter pictures. A: Ethylene perchloride membrane on intercept C1 coal burning particulate matter (×1,500); B: Ethylene perchloride membrane on intercept K7 coal burning particulate matter (×1,500); C: Ethylene perchloride membrane on intercept M30 coal burning particulate matter (×1,500).

3 討論

圖4 顆粒物局貌。A：C1顆粒物局貌（×10,000）；B：K7顆粒物局貌（×10,000）；C：M30顆粒物局貌（×10,000）。Fig4 Particle board looks. A: C1 particle board looks; B: K7 particle board looks; C: M30 particle board looks.

圖5 二氧化硅顆粒物。A：經(jīng)分離提純后濾膜上（C1煤）的二氧化硅顆粒物（×40,000）；B：二氧化硅顆粒物局貌（×100,000）；C：TEM-EDX（C1）。Fig5 Silica particles. A: After purification filter membrane (C1 coal) of silicon dioxide particles (×40,000); B: Bureau of silica particles (×100,000); C:TEM, EDX (C1).

圖6 肺內(nèi)細(xì)顆粒物。A：宣威市來賓鎮(zhèn)肺癌病理切片電鏡圖；B：細(xì)顆粒物局部全貌；C：細(xì)顆粒物形態(tài)。Fig6 The fine particulate matter of lung. A: Lung cancer electron micrographs of laibin town Xuanwei; B: Partial picture of fine particulate matter; C:Form of fine particulate matter.

肺癌已成為制約云南省宣威地區(qū)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和影響社會(huì)民生的重要因素。該地區(qū)是中國乃至世界肺癌的高發(fā)區(qū)，尋找肺癌的發(fā)病原因以及發(fā)病機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究結(jié)果提示：肺癌高發(fā)區(qū)出產(chǎn)的C1煤層的燃燒的粉塵較肺癌相對(duì)低發(fā)的地區(qū)的煤燃燒后的可吸入顆粒物濃度高。劉等[6]對(duì)不同煤進(jìn)行了燃燒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同熱力作用，釋放的可吸入顆粒物不同。不同燃燒溫度下生成的PM2.5質(zhì)量粒徑分布均呈雙峰分布；隨著燃燒溫度的提高，PM2.5質(zhì)量濃度增加。呂等[7]研究發(fā)現(xiàn)煤粉越細(xì)、燃燒時(shí)間越長、燃燒溫度越高，生成的PM10、PM2.5、PM1的量均越大；煤粉中添加CaO后，對(duì)顆粒物的凝并和團(tuán)聚起到了一定的作用，降低了可吸入顆粒物的排放量。徐等[8]研究表明，CaO對(duì)顆粒物凝并和團(tuán)聚有一定作用，使得靜電除塵器前粗顆粒物所占煙塵總量的百分比增加。燃燒室中加入吸附劑能通過形成復(fù)雜化合物團(tuán)聚超細(xì)顆粒物，并有效防止某些金屬物質(zhì)氣化，并建議對(duì)于不同反應(yīng)器使用幾種不同種類的吸附劑（例如硅鋁礦石、鋁土礦、石灰石和熟石灰）對(duì)超細(xì)顆粒物進(jìn)行團(tuán)聚控制[9]。可以對(duì)宣威肺癌高發(fā)區(qū)燃煤中加入CaO等吸附劑來降低燃燒產(chǎn)生的PM10、PM2.5的釋放，從而降低人體呼吸道對(duì)可吸入顆粒物的吸入暴露。

研究結(jié)果提示: C1煤層燃燒產(chǎn)物有氧元素以及硅聚集，三組濾膜上均發(fā)現(xiàn)了碳，硫，氧的聚集，此外還發(fā)現(xiàn)鈣元素、鋁元素。在空氣采樣中，碳元素多為黑炭（black carbon, BC）。BC通常被認(rèn)為是 PM2.5的組分之一[10]。Jacobsen等[11]對(duì) ApoE-/-小鼠氣管滴注CB，經(jīng)彗星實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CB能夠誘導(dǎo)支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞 DNA損傷。Totsuka等[12]對(duì)C57BL/6J小鼠氣管滴注 CB，經(jīng)彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CB能夠誘導(dǎo)肺臟出現(xiàn) DNA損傷。硫元素則多以化合物形式存在，以硫鋁酸鈣和硫化鈣存在較為多見[13]。形成一些顆粒大小不等的顆粒物，對(duì)粘膜長生機(jī)械損傷的作用。劉等[14]研究表明，在煤燃燒過程中，由于可吸入顆粒物結(jié)構(gòu)分子易被破壞，則較易從煤中揮發(fā)；以無機(jī)態(tài)存在的微量金屬元素，在較高的溫度下才會(huì)有較高的揮發(fā)性[15]。此次發(fā)現(xiàn)的Al、Ca元素可能來自無機(jī)物高溫分解。但此次檢測(cè)中未見明顯的有害重金屬物質(zhì)的檢出，由此粗略推測(cè)，該地區(qū)的肺癌的發(fā)生與煙煤中的重金屬元素并沒有明顯的相關(guān)性。

研究結(jié)果提示：發(fā)現(xiàn)C1煤層燃燒后，留在濾膜表面的雜質(zhì)較多，且形態(tài)不規(guī)整，被呼吸道吸入后，顆粒物還可造成呼吸道粘膜組織的損傷[16]；進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，最終可能導(dǎo)致氣管內(nèi)皮癌變[17]。而 Timblin等[18]發(fā)現(xiàn)用低濃度PM2.5染毒肺泡上皮細(xì)胞后，伴隨細(xì)胞增生，原癌基因c-jun、junB、fra1和fra-2以及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)也升高，這些原癌基因的過度表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞增生過度，同時(shí)造成細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。顆粒物通過本身的成分，如金屬、多環(huán)芳烴和碳黑等刺激機(jī)體可產(chǎn)生的活性氧化成分，另外機(jī)體在清除顆粒物的過程中，也可以產(chǎn)生這種大量的活性氧和活性氮產(chǎn)物，這些活性成分進(jìn)一步激活了呼吸系統(tǒng)靶細(xì)胞的氧化反應(yīng)信號(hào)通路[19]。細(xì)顆粒物含有的有機(jī)物作用于呼吸道上皮細(xì)胞，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而活化癌基因，影響調(diào)節(jié)基因和抑癌基因的表達(dá)，增加癌變發(fā)生的危險(xiǎn)性[20]。在C1煤層的燃燒產(chǎn)物中，找到硅和氧的化合物，對(duì)其進(jìn)行測(cè)量后可見納米級(jí)的SiO2。既往研究表明，納米級(jí)的SiO2有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，李等[5]研究發(fā)現(xiàn)，SiO2具有氧化損傷的作用，粉塵中的SiO2可能在吸入人體后產(chǎn)生氧化損傷的毒性作用，在宣威地區(qū)肺癌發(fā)生過程中起到了一定的作用。暴露在納米SiO2中可增加ROS水平和還原型谷胱甘肽水平。增加生產(chǎn)丙二醛和乳酸脫氫酶的釋放，從細(xì)胞層面顯示脂質(zhì)過氧化和膜損傷[21]。

納米SiO2顆?？芍麓笫蠓尉奘杉?xì)胞和肺泡II型上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，隨粒徑的減少，超微結(jié)構(gòu)改變?cè)矫黠@。納米SiO2顆?？芍麓笫蠓谓M織細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。納米SiO2顆?？芍路谓M織細(xì)胞雙核及多核發(fā)生。可通過Fas/Fast死亡受體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。孫等[23]曾在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大鼠氣管及肺組織損傷與大鼠吸入污染物的時(shí)間長短及濃度呈正相關(guān)性關(guān)系。納米SiO2在宣威肺癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生促進(jìn)作用[24]。

在宣威肺癌患者的術(shù)后標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)納米級(jí)細(xì)顆粒物，主要分布于細(xì)胞核等處。進(jìn)一步佐證了細(xì)顆?？赡茉谛貐^(qū)肺癌的發(fā)病過程中起到了某種作用。S?rensen等[25]研究表明，中等程度的PM的濃度可以誘導(dǎo)氧化性DNA損傷?？梢酝茰y(cè)細(xì)顆粒物是直接所用與細(xì)胞核，從而造成細(xì)胞的DNA損傷的。細(xì)顆粒物可能通過機(jī)械損傷、免疫毒性、氧化損傷及其附著的有害化學(xué)物質(zhì)作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變[26]。

綜上，在宣威地區(qū)中有不同流行病學(xué)背景的煤樣，進(jìn)行燃燒試驗(yàn)后，C1煤層燃燒的產(chǎn)物較其他肺癌低發(fā)地區(qū)雜質(zhì)更多，顆粒物中存在Si，氧元素的富集，部分的濾膜上發(fā)現(xiàn)游離的納米級(jí)SiO2。當(dāng)?shù)胤伟┑母甙l(fā)可能與當(dāng)?shù)厝耸褂脽熋合嚓P(guān)。與細(xì)顆粒物的機(jī)械損傷、氧化活性、附著的有害化學(xué)物質(zhì)、癌基因激活及DNA的損傷相關(guān)。我們從改善煙煤燃燒的環(huán)境，燃燒溫度，添加CaO等催化劑等方面來入手，為宣威地區(qū)肺癌高發(fā)區(qū)的防癌、控癌提供理論依據(jù)。