覃莉等、

【摘要】目的探討一壯族常染色體顯性遺傳（ADRP）視網(wǎng)膜色素變性（RP）家系視紫紅質(zhì)（RHO）基因第58、347密碼子是否存在突變。 方法采集一連續(xù)4代發(fā)病的壯族ADRP家系29名成員外周血DNA，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法對(duì)RHO基因的上述密碼子進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果RHO基因第58、347密碼子在該壯族家系中未發(fā)現(xiàn)突變。結(jié)論該壯族家系A(chǔ)DRP發(fā)病與RHO基因第58、347密碼子不相關(guān)，其發(fā)病的分子遺傳學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

【關(guān)鍵詞】視網(wǎng)膜色素變性；常染色體顯性遺傳；RHO基因；限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

中圖分類號(hào)：R774.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.04.003

【Abstract】ObjectiveTo investigate whether mutation existed in codon 58 and codon 347 of rhodopsin （RHO） gene of retinitis pigmentosa （RP）in a Zhuang family with autosomal dominant retinitis pigmentosa （ADRP）.MethodsPeripheral blood DNA of 29 members was collected from a Zhuang family whose four generations had suffered from ADRP.Polymerase chain reaction （PCR）―Restriction fragment length polymorphism （RFLP） was applied to detect the codon 58 and codon 347 of RHO gene.Results No mutations were found in the codon 58 and codon 347 of RHO gene in this family.ConclusionThere is no relation between the morbidity of ADRP and the codon 58 and codon 347 of RHO gene in the Zhuang family.And further research is needed to be carried out on the molecular genetic mechanism of its onset.

【Key words】RP；ADRP；RHO gene；RFLP

視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）是一組以視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和色素上皮進(jìn)行性受損為主要特征的遺傳性眼病。我國(guó)的平均患病率約為 1/3784[1]，其遺傳方式主要為常染色體顯性遺傳（autosomal dominant RP，ADRP）、常染色體隱性遺傳（autosomal recessive RP，ARRP）、X染色體連鎖遺傳（Xlinked RP，XLRP）和雙基因遺傳。迄今為止，視紫紅質(zhì)（rhodopsin，RHO）基因突變引起的ADRP為265%，我國(guó) ADRP 患者約有 7%由此基因引起[2]，是ADRP基因中突變率最高的，故RHO成為ADRP分子缺陷研究的第一候選基因。本研究對(duì)廣西一ADRP壯族家系RHO基因Exon 1、5外顯子的第58、347密碼子是否存在與發(fā)病關(guān)聯(lián)的突變進(jìn)行初步篩查。

1對(duì)象與方法1.1對(duì)象 研究家系來自廣西壯族自治區(qū)貴港市。詢問家系成員病史并繪制家系圖譜（見圖1）。采集10例患者（男6例、女4例）和19例正常成員的外周血。所有研究對(duì)象均進(jìn)行常規(guī)體檢及眼部檢查（包括視力、眼底、眼壓等）。 圖1 壯族ADRP家系系譜圖。

1.2方法

1.2.1外周血DNA制備采集該家系中10例患者、19名正常成員靜脈血2 ml， 加ACD抗凝，用經(jīng)典的苯酚/氯仿法提取白細(xì)胞DNA，TE緩沖液溶解，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增RHO基因Exon 1、5的部分片段，由上海生物工程公司合成2對(duì)引物（見表1）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（30 μl）：模板DNA 1 μl，正反向引物各1 μl，Taq酶0.1 μl（5 U/μl），dNTP 3 μl（2.5 mmol/L），10×buffer（Mg2+）4 μl，無(wú)菌注射用水19.9 μl。反應(yīng)過程分3個(gè)階段：第1階段，95℃預(yù)變性 5 min；第2階段，以 93℃變性1 min，54.5℃退火 1 min，71℃延伸 100 s，為 1個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)；第3階段，71℃再延伸 5 min，8℃保存?zhèn)溆?。? μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠，用電壓100 V，電流150 mA電泳40～50 min，紫外光透射儀上觀察并拍攝DNA帶紋，證實(shí)PCR擴(kuò)增片段存在。

1.2.3限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RELP）PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后，各取10 μl分別加0.5（10 U/μl）DdeI， 1 μl（10 U/μl）MspI，37℃恒溫水浴中消化過夜，消化產(chǎn)物于12%聚丙酰胺凝膠90 V恒電壓下電泳1.5小時(shí)，EB染色20分鐘，紫外光透射儀上觀察并拍攝DNA帶紋。

2結(jié)果2.1瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果家系中患者和正常成員的RHO基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為Exon 1基因片段360 bp；、Exon 5基因片段277 bp（見圖2、圖3）。

2.2限制性內(nèi)切酶酶切電泳分析結(jié)果DdeI酶切Exon 1片段的消化產(chǎn)物電泳后呈現(xiàn)310 bp和50 bp DNA條帶兩個(gè)（見圖4）。MspI酶消化Exon 5片段后電泳可見56、100、121 bp三個(gè)DNA帶型格局（見圖5）。

3討論根據(jù)RP診斷標(biāo)準(zhǔn)，該家系4代，每代可見患者，男女發(fā)病率之比為8∶5，近似于1∶1，雙親無(wú)病的子女不患病，29名成員中10例被確診為ADRP患者。該家系患者中，夜盲為始發(fā)癥狀，漸出現(xiàn)視野縮小，視力減退，累及雙眼至最終雙眼的視力無(wú)光感，提示癥狀隨著年齡增長(zhǎng)而逐漸加重。該家系的臨床表型特點(diǎn)為：發(fā)病時(shí)間年齡差異大，第Ⅰ～Ⅲ代較晚（30～40歲左右），第Ⅳ代目前只有Ⅳ4（10歲左右）表現(xiàn)出RP的臨床癥狀。家系中Ⅱ11（72歲）、Ⅱ13（76歲）、Ⅲ22（43歲）、Ⅲ31（46歲）雙眼已無(wú)光感，前3名患者及先癥者Ⅱ7（75歲）合并青光眼，Ⅲ31合并白內(nèi)障。家系不同患者間的臨床表現(xiàn)存在差異，顯示表型異質(zhì)性。

ADRP最常見的致病基因RHO基因迄今已發(fā)現(xiàn)100 余種[4]突變與ADRP有關(guān)，其中 90%以上的突變表現(xiàn)為無(wú)義或錯(cuò)義突變，少數(shù)為微小缺失或插入突變。這些突變中，Pro23His 和 Pro347Leu 在歐美最為常見，我國(guó)以 Pro347 Leu 突變[5]為主，亦有第58密碼子突變的發(fā)現(xiàn)[6]，Pro 23 His突變尚未發(fā)現(xiàn)。因此本研究首先選取RHO基因Exon 1、5外顯子的第58、347密碼子進(jìn)行突變篩查。

本研究應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法分析RHO基因Exon 1、5外顯子的第58、347密碼子。DdeI酶在Exon 1片段內(nèi)有一個(gè)切點(diǎn)，該片段DdeI消化產(chǎn)物電泳后呈現(xiàn)310 bp和50 bp DNA條帶兩個(gè)。若第58密碼子發(fā)生C→G的點(diǎn)突變時(shí)則出現(xiàn)新的DdeI酶切識(shí)別位點(diǎn)，致新的酶切片段產(chǎn)生[3]。本研究所檢測(cè)的RP病例均呈現(xiàn)與正常對(duì)照相同的帶型格局，提示第58密碼子沒有產(chǎn)生新的DdeI酶切識(shí)別位點(diǎn)。Exon 5片段內(nèi)含有位于第314密碼子和347密碼子處的兩個(gè)MspI酶切位點(diǎn)，故MspI消化正常人Exon 5片段后電泳可見3個(gè)DNA條帶。若第347密碼子發(fā)生點(diǎn)突變將使該處的識(shí)別位點(diǎn)喪失[3]。本研究所檢測(cè)的RP病例均呈現(xiàn)與正常對(duì)照相同的56、100、121 bp三個(gè)DNA帶型格局，提示該處保持原有的MspI酶切位點(diǎn)。綜上所述患者與家系中的正常對(duì)照的擴(kuò)增序列完全一致，排除在Exon 1、5外顯子擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)存在丟失縮短或插入延長(zhǎng)及堿基突變的可能，表明RHO基因第58、347密碼子不存在與該ADRP家系的相關(guān)突變。

壯族人群在遺傳背景上表現(xiàn)為與漢族及周圍群體有所不同的獨(dú)特性[7～8]，不同地區(qū)、不同人群RHO基因突變存在差異性，且RP具有高度遺傳異質(zhì)性[9]，因此該壯族ADRP家系患者亦可能存在異于其他族群的RHO基因突變格局。我們下一步將應(yīng)用HTCSGE技術(shù)和DNA直接測(cè)序方法對(duì)RHO基因5個(gè)外顯子及其附近拼接序列進(jìn)行突變篩查，探討RHO基因與該壯族ADRP家系的關(guān)聯(lián)性。參考文獻(xiàn)[1] 覃泳杰，郭?？?常染色體遺傳型視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J].眼科研究，2009，27（12）：11591163.

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（收稿日期：2015-05-31修回日期：2015-08-08）

（編輯：梁明佩）

編者·讀者·作者

醫(yī)學(xué)論著“材料與方法”的撰寫要求

材料是表現(xiàn)研究主題的實(shí)物依據(jù)，方法是指完成研究主題的手段。材料與方法是科技論文的基礎(chǔ)，是判斷論文科學(xué)性、先進(jìn)性的主要依據(jù)。對(duì)材料和方法的唯一要求就是使讀者看懂，能夠據(jù)此進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。如果所采用的方法，是自己獨(dú)創(chuàng)的應(yīng)詳細(xì)交代，對(duì)在別人方法基礎(chǔ)上有所改進(jìn)或改良的方法，只需把改進(jìn)部分的細(xì)節(jié)作必要的介紹即可。對(duì)完全采用別人建立的方法，特別是經(jīng)典的方法可一筆帶過，注明出處。研究對(duì)象如為動(dòng)物：注明名稱、品種、數(shù)量、來源、年齡、性別、分組標(biāo)準(zhǔn)與方法；對(duì)象為生物或細(xì)胞：注明種、型、株、系、培養(yǎng)條件和實(shí)驗(yàn)室條件；對(duì)象為臨床病例：注明來源、數(shù)量、性別、年齡、病因、病程、病理診斷、分型標(biāo)準(zhǔn)、選擇標(biāo)準(zhǔn)。

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