賈蔓箐，唐輝，*，李翠華，王國軍，趙紅濤

（1.新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，石河子大學藥學院，新疆石河子 832000；2.石河子大學化工學院，新疆石河子 832000）

棉油皂腳中植物甾醇的提取工藝研究

賈蔓箐1，唐輝1，*，李翠華2，王國軍1，趙紅濤1

（1.新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，石河子大學藥學院，新疆石河子 832000；2.石河子大學化工學院，新疆石河子 832000）

摘 要：為了探索從棉油皂腳中提取植物甾醇的工藝條件。以皂腳為原料，通過單因素和正交實驗優(yōu)化最佳工藝條件，并對粗品進行純化，以高效液相色譜法測定的甾醇含量為考察指標。植物甾醇提取的最佳工藝為：皂化料液比1∶3，90℃下皂化3 h，用乙酸乙酯進行萃取，料液比為1∶20，粗甾醇的提取率為75.6%，其中提取得到的β-谷甾醇和菜油甾醇的純度分別為（66.5±0.47）%、（5.67±0.08）%，其經(jīng)無水乙醇重結晶兩次后，純度可達91.8%。結果表明最佳提取工藝重現(xiàn)性較好；HPLC法測定甾醇含量結果準確可靠。

關鍵詞：棉油皂腳；植物甾醇；HPLC；提取

棉油皂腳是棉籽油生產過程中產生的下腳料，在堿煉脫酸過程中采用氫氧化鈉溶液將毛油中的游離脂肪酸中和為鈉鹽，主要成分為高級脂肪酸（脂肪酸鈉鹽）[1]，并且同時含有棉酚[2]、甾醇、磷脂等高附加成分。我國每年可排放植物油皂腳數(shù)百萬噸，尋找新的處理方法并提取出有效成分，不僅保護環(huán)境，還具有很高的經(jīng)濟價值。

植物甾醇是一類以環(huán)戊烷全氫菲（即甾核）為骨架的類似環(huán)狀醇結構的化合物，具有顯著的降膽固醇功效，還具有免疫調節(jié)，消炎退熱，防治心臟病等許多重要的生理功能[3-4]，近年來，甾醇在醫(yī)藥、食品、化工等領域被高度重視與關注[5]。在大多數(shù)已報道的研究中，一般都以脫臭餾出物作為提取原料，用不同的方法加以提取[6-10]。本實驗以棉籽油皂腳為原料提取植物甾醇，建立HPLC法準確定量，探索了一條合理工藝提取皂腳中的植物甾醇，以促進資源的合理利用。

1 材料與方法

1.1 材料

棉油皂腳（新疆康隆油脂公司，批號1：111203，批號2：120221）；β-谷甾醇對照品（上海源葉生物制品有限公司，批號：20120214）菜油甾醇對照品（日本和光Wako，批號：2301）

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

日本島津LC-15C高效液相色譜儀（包括在線脫氣機、紫外檢測器、LC solution工作站等）；德國Staotious BP211D電子分析天平；AR1140萬分之一電子分析天平：奧豪斯國際貿易有限公司；DKZW—C型電子恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；TP 300超聲波清洗器：天鵬電子新技術有限公司；德國EYELA旋轉蒸發(fā)儀；A-1000S水流抽氣機：made by EYELA；CCA-20低溫冷卻水循環(huán)泵；

1.2.2 試劑

甲醇色譜純（Fisher Science），重蒸水；所用其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 甾醇的提取工藝

取棉油皂腳100 g于圓底燒瓶內，加入適量1 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液，高溫回流，減壓蒸餾回收乙醇。加入蒸餾水稀釋，將得到的皂化液冷卻，有機溶劑萃取2次，水洗至中性，在常溫下減壓蒸餾回收有機溶劑，得到粗甾醇制品。

2.2 單因素實驗

選擇影響甾醇提取率的幾個因素：即皂化料液比（皂腳質量與1 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液的體積比）、皂化時間、萃取劑的選擇、萃取料液比（皂腳質量與有機溶劑的體積比）分別進行單因素實驗，采用HPLC法在210 nm處進行植物甾醇的含量考察各因素對甾醇提取率的影響。

2.3 正交試驗

為了全面考察影響因素，設計并進行L9（34）正交試驗，確定提取棉油皂腳中植物甾醇的最佳提取參數(shù)。設定因素水平表如表1。

表1 正交設計因素水平表Table 1 Table of factors and levels of orthogonal design

2.4 粗甾醇的精制

稱取一定量的粗植物甾醇，加入60℃無水乙醇充分溶解，降溫至-5℃結晶18 h～24 h。在低溫條件下迅速抽濾，并用無水乙醇沖洗濾渣表面，濾渣在真空烘箱中50℃下干燥。干燥后的濾渣重復上述重結晶步驟，即可得到精制甾醇。

2.5 植物甾醇的測定

2.5.1 色譜條件

色譜柱：WondaSil Analysis C18 Column（4.6 mm×150mm，5μm）；流動相：甲醇∶水=95∶ 5；流速 0.8mL/min；檢測波210 nm；進樣量20 μL；柱溫25℃。植物甾醇在此條件下有較好的分離，色譜圖如圖1所示。

圖1 甾醇對照品及粗品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference and sample

2.5.2 標準曲線的繪制

采用高效液相色譜法測定。β-谷甾醇：Y=3 543.3X+25 769（R=0.999 9）；菜油甾醇：Y=3 573.6X+29 579（R=0.999 8）。在 40.16 μg/mL～240.96 μg/mL 和30.02 μg/mL～181.2 μg/mL 范圍內線性關系良好，精密度分別為0.70%、0.49%。

2.5.3 供試品測定

分別取 3批原料（批號：111203），按“2.1”項下方法制備粗品甾醇，無水乙醇溶解，用微孔（0.45 μm）濾過按上述色譜條件進行測定。重復進樣3次，取平均值，根據(jù)回歸方程計算粗品中甾醇的純度及提取率。

3 結果與分析

3.1 提取條件單因素的考察

3.1.1 皂化料液比對甾醇提取率的影響

按2.1工藝提取植物甾醇，在反應溫度90℃，反應時間3 h的條件下對皂腳進行再次皂化，考察料液比（皂腳質量與1 mol/L氫氧化鉀－乙醇溶液的體積比）對皂化反應的影響，結果如圖2所示。

圖2 皂化料液比對提取率的影響Fig.2 The effect of solid-liquid on extraction

由圖2可知，當料液比小于1∶3時，隨著堿液量的增加，甾醇提取率也隨之增加，這是因為皂化的目的是除去脂肪酸和分解甾醇酯，皂化越趨完全，甾醇越易被提取，堿液量過少，皂化不完全，甾醇純度低且提取率低；當料液比大于1∶3時，隨著堿液量過多，會造成試劑浪費并且引入雜質，甾醇提取率反而略下降。所以選取料液比為1∶3。

3.1.2 皂化時間對甾醇提取率的影響

按2.1工藝提取植物甾醇，在皂化料液比1∶3，反應溫度90℃的條件下對皂腳進行皂化，考察皂化時間對皂化反應的影響，見圖3。

圖3 皂化時間對提取率的影響Fig.3 The effect of different time on extraction

由圖3可知，當反應時間小于3 h時，隨著反應時間的延長，甾醇提取率隨之增加，因為在皂化反應中物質的傳遞和反應需要一定時間，但是時間過長可能由于甾醇氧化或引入雜質導致結果有所降低，從生產考慮，皂化反應達到3 h時即可。

3.1.3 最優(yōu)萃取溶劑的選擇

按2.1工藝提取植物甾醇，在皂化料液比1∶3，反應溫度90℃回流3 h的條件下對皂腳進行皂化，分別選用乙酸乙酯、丙酮、氯仿、異丙醇、石油醚、乙醚進行萃取，考察最優(yōu)萃取溶劑見圖4。

圖4 不同有機試劑對提取率的影響Fig.4 The effect of different solvent on extraction

從圖4看出不皂化物中萃取植物甾醇效果：乙酸乙酯＞石油醚＞乙醚，并且乙酸乙酯毒性低，不溶于水，更加利于實際操作，故萃取溶劑選乙酸乙酯。

3.1.4 萃取料液比對甾醇提取率的影響

按2.1工藝提取植物甾醇，在皂化料液比1∶3，反應溫度90℃回流3 h的條件下對皂腳進行皂化，選用不同體積的乙酸乙酯進行萃取，考察萃取料液比對甾醇提取率的影響見圖5。

圖5 萃取料液比對提取率的影響Fig.5 The effect of solid-liquid on extraction

隨著萃取劑用量增加，甾醇提取率也增大。這是因為萃取劑用量越多，溶解在萃取劑中的甾醇越多，但在萃取料液比1∶20以后，甾醇提取率提升并不顯著，這是由于甾醇已基本溶于萃取劑中了，再增加萃取劑用量對甾醇的結果影響不大。由圖可知，萃取料液比為1∶20即可。

3.2 正交試驗

以料液比、反應時間和萃取劑用量設定的L9（34）正交試驗結果如表2。

由直觀分析和方差分析表可知，影響棉油皂腳中甾醇提取的主次因素依次為A（皂化料液比）＞B（皂化時間）＞C（萃取料液比），由表中可知，最優(yōu)工藝為A2B2C3，綜合考慮輔料成本與效益，后續(xù)操作等因素，得出最佳工藝條件為A2B2C2，即100 g原料，采用皂化料液比1∶3高溫回流3 h，乙酸乙酯進行萃取，萃取料液比為 1∶20 g/mL。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal experimental results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

3.3 工藝驗證性實驗結果

按照上述確定的最佳條件，進行3次平行試驗，棉油皂腳中植物甾醇提取率為75.6%，說明正交試驗篩選所得的工藝穩(wěn)定可行。

3.4 粗品甾醇的精制結果

對粗品甾醇進行重結晶精制，二次精制后純度可達91.8%，其中含有β-谷甾醇85.4%，菜油甾醇6.4%。

4 結論

1）選用HPLC法測定甾醇含量，此法快速、準確、重復性高，可用于測定棉油皂腳中甾醇含量及提取物純度的測定。

2）通過單因素和正交試驗，得到自棉油皂腳中提取甾醇的最優(yōu)條件：皂化料液比1∶3，高溫下回流皂化3 h，萃取料液比1∶20進行萃取，在此條件下，粗品植物甾醇的平均提取率為75.6%，β-谷甾醇和菜油甾醇的純度分別為（66.5±0.47）%、（5.67±0.08）%，對粗品甾醇進行重結晶，二次精制后純度達91.8%。

：

[1]凌慶枝,黃秀彥,高莉莉.菜籽油腳衍生氣相色譜-質譜分析研究[J].糧油加工,2008(6):61-63

[2]張歡,唐輝,賈蔓箐,等.HPLC測定棉油皂腳中棉酚含量[J].中國現(xiàn)代應用藥學,2011,28(2):162-164

[3]Kevin B.Hicks,Robert A.Moreau.Phytosterols and phytosterols:fuctional food cholesterol busters[J].Food Technology,2001,55(1):63-67

[4]賈代漢,周巖民,王恬.植物甾醇降膽固醇作用研究進展[J].中國油脂,2008,33(5):49-53

[5]彭鶯,劉富禎,高欣.天然植物甾醇的應用與提取工藝[J].化工進展,2002,21(1):49-53

[6]姜洪峰,錢俊青.菜籽油脫臭流出物中天然VE和植物甾醇提取工藝研究[J].中國糧油學報,2007,22(3):115-121

[7]張澤生,于衛(wèi)濤.超聲波法提取米糠中植物甾醇的工藝研究[J].食品研究與開發(fā),2007,28(1):43-46

[8]湯錦程,鐘鑫,吳雪輝,等.超聲波強化茶籽油油腳中甾醇的提取研究[J].中國油脂,2011,36(10):70-72

[9]趙文竹,于志鵬,劉靜波,等.均勻設計微波法提取玉米須中β-谷甾醇[J].食品研究與開發(fā),2010,31(9):19-22

[10]Toivo J,Lampi A M,Aalto S,et al.Factors affecting sample preparation in the gas chromatographic determination of plant sterols in whole wheat flour[J].Food Chemistry,2000,68(2):239-245

Study on Extraction Process of Phytosterols in Cottonseed Soapstock

JIA Man-qing1，TANG Hui1，*，LI Cui-hua2，WANG Guo-jun1，ZHAO Hong-tao1
（1.Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resources，College of Pharmacy of Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China；2.College of Chemistry of Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China）

Abstract：The process of extracting phytosterols from Cottonseed Soapstock has been established.Methods：The conditions have been optimized through single factor and orthogonal experiments.The crude extract was purified and the content of phytosterols was determined by HPLC.Results：Optimum extraction conditions were as follows：the Liquid-material ratio is 1∶ 3；saponification time is 3 h at 90℃；the extraction was carried out with ethyl acetate and the liquid-material ratio is 1∶ 20；the yield of the crude phytosterols is 75.6%and the purity of β-sitosterol and campesterol is （66.5±0.47） %and （5.67±0.08） %， respectively.The purity of total phytosterols has been enhanced from 70%to 91.8%after recrystallization with anhydrous ethanol twice.Conclusion：The optimized extraction process indicates satisfied repeatability and the method for determining phytosterols by HPLC is accurate and reliable.

Key words：cottonseed soapstock；phytosterols；HPLC；extraction

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.012

新疆建設兵團博士基金項目（2009JC14）；石河子大學重大科技攻關計劃項目（gxjs2010-zdgg04）

賈蔓箐（1988—），女（漢），碩士，研究方向：天然藥物分析。

2013-01-29