張 娟，韋 清，劉君君

（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，廣東深圳518057）

免疫分析法以其高靈敏度和特異度在臨床檢測中得到廣泛的應用。然而，這項以抗原－抗體反應作為基本原理的技術，必然會受到內源抗體干擾影響［1］。據(jù)報道，內源性抗體干擾發(fā)生率為1%～40%，甚至更多（與受檢人群及檢測技術有關）［2－4］。隨著干擾阻斷劑技術的應用，干擾發(fā)生率降至2%以下［3，5］。干擾可導致檢測結果的假性升高或降低，甚至假陽性或漏檢，影響臨床醫(yī)生對疾病的診斷及病情評估，可能給患者帶來不必要的檢查和錯誤用藥［6］，還可能貽誤病情使其錯過最佳治療時期。內源性干擾抗體一般包括：嗜異性抗體，如類風濕因子（RF）、抗核抗體（ANA）；人抗動物抗體，如人抗鼠抗體HAMA；自身免 疫 性 抗 體，如 抗 甲 狀 腺 素 抗 體（anti－Tg）［1，7］。其中，嗜異性抗體特異性低、能與多種物種抗體結合，是內源性抗體干擾中最常見的一類；人抗動物抗體和自身免疫性抗體因其抗體高度特異性，對結果造成的干擾程度則分別與檢測試劑盒采用何種動物的抗體及項目特異性有關。自20世紀70年代發(fā)現(xiàn)免疫干擾后，一系列檢測和消除干擾抗體的方法（稀釋后是否線性、更換檢測方法、抗體中和、干擾抗體移除、添加阻斷劑等）應運而生［1，7－8］。這些方法并不能完全避免干擾，均為結果出現(xiàn)異常后對樣品的一種事后回溯手段［1］，而且針對的往往是單個樣品的研究，缺少臨床多個樣品的比較。本文運用EP14－A3［9］中描述的方法，選用市場上廣泛應用、口碑較好的廠商試劑作為參比系統(tǒng)，以化學發(fā)光免疫方法和內源性抗體RF干擾為例，從試劑盒自身抗干擾能力角度出發(fā)，提供一種綜合評估試劑盒抗干擾能力的方法，為臨床和試劑研發(fā)中評估抗內源性抗體干擾能力提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 儀器：邁瑞CL－2000i全自動化學發(fā)光免疫分析儀，羅氏Cobas e411全自動化學發(fā)光免疫分析儀，貝克曼ACCESSⅡ全自動化學發(fā)光免疫分析儀。試劑：在研試劑盒A（化學發(fā)光免疫分析法）及配套校準、質控品；參比試劑為羅氏硫酸脫氫表雄甾酮（DHEA－S）檢測試劑盒（電化學發(fā)光法）及配套校準品；在研試劑盒B（化學發(fā)光免疫分析法）及配套校準、質控品；參比試劑為貝克曼甲狀腺球蛋白（Tg）測定試劑盒（化學發(fā)光法）及配套校準品。試劑主要成分和原理見表1。

表1 試劑盒基本信息

續(xù)表1 試劑盒基本信息

1.2 方法

1.2.1 樣品準備 35份正常血清樣品，12份不同濃度的RF血清樣品，正常血清樣品的DHEA－S和Tg濃度盡量覆蓋RF血清樣品所含的DHEA－S和Tg濃度。

1.2.2 測試 測試前通過質控測定確保系統(tǒng)穩(wěn)定。按試劑盒說明書進行準備，將RF 干擾樣品隨機穿插在正常血清樣品中，將樣品先用待評估試劑在邁瑞CL－2000i全自動化學發(fā)光免疫分析儀上測2 次，再用參比試劑分別在對應儀器上測2次。分別記錄測試結果。

1.3 統(tǒng)計學處理 按EP9－A3方法［10］對重復測定結果離群點進行剔除，以對比系統(tǒng)測值的均值為橫坐標，待評價系統(tǒng)測值的均值為縱坐標，繪制散點圖，用JMP9.0軟件判斷是否適合線性回歸。若呈線性，則以的均值為橫坐標，以為縱坐標，繪制散點圖，觀察散點的分散度是否隨橫坐標濃度值的遞增而遞增（呈喇叭狀）。若遞增，則需將分別轉換成和，繪制新散點圖。運用MedCalc軟件對正常樣品散點圖進行戴明回歸分析，得到斜率和截距根據(jù)擬合的戴明回歸曲線，對已給定的值可以計算出一個預期的值，按公式計算的95%置信區(qū)間，式中：γ 為Ⅰ型錯誤發(fā)生概率（一般為0.05），n 為 樣本量；NH為測試 重復 次數(shù)為戴明 回歸線的標 準差［9］。最 后，以為橫坐標，為縱坐標繪制散點圖，將散點分別連線后即得到正常樣品單值95%置信區(qū)間的上下限曲線。

2 結 果

2.1 戴明回歸分析前數(shù)據(jù)處理 運用JMP9.0 軟件對DHEA－S和Tg正常樣品散點分別進行二次、一次方回歸分析，見表2、3，只有一次項系數(shù)與0 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），因此按線性模型回歸。以的均值為橫坐標，以為縱坐標，分別對DHEA－S和Tg正常樣品繪制散點圖，見圖1、2（見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”），散點的分散度沒有隨橫坐標濃度值的遞增而遞增，因此均無需進行對數(shù)轉換。

表2 JMP9.0對DHEA－S正常樣本回歸系數(shù)的分析（n＝35）

表3 JMP9.0對Tg正常樣本回歸系數(shù)的分析（n＝35）

2.2 戴明回歸和干擾判斷 對正常樣品散點圖進行戴明回歸分析，得到斜率和截距。根據(jù)擬合的戴明回歸結果，繪制正常樣品單值95%置信區(qū)間上下限曲線如圖3、4（見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”）中虛線所示。在圖3中，RF 樣品已超出95%置信區(qū)間上限，說明在研試劑A 抗RF 干擾能力較弱，在RF樣品識別上與參比試劑存在明顯差異性。圖4中，RF樣品與正常樣品聚合較好，RF樣品均處于95%置信區(qū)間以內，說明在研試劑B與參比試劑抗RF干擾能力相當。

3 討 論

本文運用EP14－A3方法評估了兩種化學發(fā)光試劑盒的抗內源性抗體干擾能力。結果顯示，RF對在研試劑A 整體表現(xiàn)為正干擾，對在研試劑B的干擾不明顯。RF是一類易與變性IgG 的Fc段非特異結合的自身抗體，不具種屬特異性［7］，以上評價結果從試劑開發(fā)原理上分析，在研試劑A 采用競爭法二抗體系且二抗為多克隆兔抗，多克隆兔抗含有的多種IgG Fc段易與RF結合，而使標記抗原不能與捕獲抗體相連，導致發(fā)光值假性降低，測值偏高，表現(xiàn)為明顯的正干擾。而RF 對在研試劑B干擾不明顯可能與試劑B 所用抗體為單克隆抗體、RF結合位點少，且試劑抗干擾配方優(yōu)化較好有關。

從圖3、4標出的RF濃度可知，干擾物的濃度與干擾程度并不呈正比，該結論與陳金超等［11］的報道一致。由于RF有多種類型（如IgM、IgG 及IgA），濃度相同但種類不同的RF對檢測的干擾程度可能并不相同［12］。此外，血清成分復雜，低濃度的RF干擾樣品中可能還存在其他未知干擾物（如其他干擾抗體、代謝物、藥物等）。因此，僅以少數(shù)幾份樣品得到的結果往往相互矛盾，不足以評價干擾，評估抗體干擾應建立在一定統(tǒng)計量的基礎上。

EP14－A3是用于評價處理樣品與血清樣品基質效應的指導性文件。內源性抗體干擾導致的結果就是基質差異。本文探討了EP14－A3方法應用于內源性抗體干擾評估中的可操作性。這種方法側重于臨床多樣本研究，在一定統(tǒng)計量基礎上評估了試劑RF干擾的風險，可作為一種簡便、直觀的試劑配方篩選補充手段，一定程度上對國內試劑研發(fā)中配方篩選和體系優(yōu)化提出更高要求，為在研試劑完善提供方向和目標，同時也為臨床醫(yī)院選取和評估待引進試劑提供了科學建議。該方法以參考方法為標準，使用也有前提：（1）方法學比對指標優(yōu)良；（2）對比系統(tǒng)或參考方法的抗干擾能力臨床認可度高。若能滿足上述條件，EP14－A3 是科學、直觀的內源性抗體干擾評估方法。

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