羅史科，劉鮮花，伍 和，金 嫻，樊春卉，朱平安

（鹽田區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳518081）

銅綠假單胞菌（PA）是條件致病菌也是醫(yī)院感染細(xì)菌的重要成員，隨著抗菌藥物應(yīng)用人群的不斷擴(kuò)大，PA 對(duì)喹諾酮耐藥性有不斷上升的趨勢(shì)［1］。已獲得耐藥質(zhì)粒的PA 菌株對(duì)抵抗力弱的人群有時(shí)是致命的［2］。及時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌獲取耐藥性的能力，破解細(xì)菌耐藥質(zhì)粒是人類應(yīng)對(duì)PA 的途徑之一。因此研究PA 誘變獲取耐藥質(zhì)粒的過程及機(jī)制有一定的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2012年1月到2013年12月本院各科送檢細(xì)菌培養(yǎng)的合格臨床標(biāo)本，一共481份。

1.2 儀器與試劑 主要儀器包括DNA 自動(dòng)加熱循環(huán)器（美國(guó)Perkin Elmer公司）、紫外線分析儀、epp偏振照相儀、酶標(biāo)分光光度計(jì)，微型、水平和垂直電泳儀，MPRA4I高速冷凍離心機(jī)、真空干燥機(jī)、培養(yǎng)搖床、超低溫冰箱、法國(guó)梅里埃細(xì)菌鑒定儀。主要耗材和試劑包括血培養(yǎng)皿、普通瓊脂培養(yǎng)皿，PA標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853（由深圳北大醫(yī)院檢驗(yàn)科劉小平主任惠贈(zèng)），奈啶酸、環(huán)丙沙星藥敏紙片，質(zhì)粒提取試劑（深圳雅瑞爾科技公司提供），引物（上海Introvigen公司合成）。

1.3 方法

1.3.1 PA 菌的獲?。?］481份樣品接種于血培養(yǎng)皿，挑取單個(gè)菌落用梅里埃細(xì)菌鑒定儀鑒定為PA 菌株，均與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853比對(duì)，共獲得31份PA 樣品。

1.3.2 對(duì)喹諾酮敏感的PA 菌株的挑選 用K－B紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行。根據(jù)CLSI藥敏試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判斷敏感（S）、中介（I）或耐藥（R）［4］。31份PA 菌株經(jīng)奈啶酸、環(huán)丙沙星紙片藥敏試驗(yàn)后分為耐藥PA 菌株15份，敏感PA 菌株16份。16份對(duì)喹諾酮敏感PA 菌株則為備用菌，每一份備用菌用2 個(gè)2 mL EP管（塑料帶蓋離心管）加甘油分別保存然后將備用菌迅速放入－80 ℃。

1.3.3 敏感PA 菌株誘變?yōu)槟袜Z酮藥物菌株 （1）復(fù)蘇及編號(hào)：將16份備用菌每份取出一管按收取時(shí)間順序分別編為P1～P16號(hào)并迅速解凍復(fù)蘇；（2）接種并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)：將復(fù)蘇備用菌分別接種到對(duì)應(yīng)編號(hào)的普通瓊脂平板上，在每一個(gè)瓊脂平板中央加入環(huán)丙沙星藥物紙片；（3）中介菌落的轉(zhuǎn)種：挑選最靠近抑菌圈的PA 菌株，將P1～P16平板上的中介PA 菌株轉(zhuǎn)種到編號(hào)為A1－1～A1－16平板，A1－1～A1－16平板上的中介菌再次轉(zhuǎn)種編號(hào)為A2－1～A2－16平板，以此類推，直到出現(xiàn)完全耐藥PA 為止。

1.3.4 誘變耐藥PA質(zhì)粒的提?。?］取出誘變后耐藥的PA菌株放入增菌液過夜，增菌后PA 菌株提取質(zhì)粒。按堿裂解細(xì)菌、離心吸附柱結(jié)合DNA、洗去雜質(zhì)的步驟提取質(zhì)粒DNA，提取的質(zhì)粒光密度比值（A260／A280）在1.8～2.0之間。平均細(xì)菌提取的質(zhì)粒濃度有3.19μg／mL（一般情況下是2～5μg／mL）。

1.3.5 質(zhì)粒、染色體DNA 的PCR 擴(kuò)增、序列分析及核酸雜交

1.3.5.1 引物設(shè)計(jì)合成 依據(jù)GenBank提供的基因序列，使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)針對(duì)各喹諾酮耐藥基因（PMQR）基因變異體的共有序列的通用引物qnrA－F：ATC TCT CAC GCC ACC GTA TG，qnrA－R：GAT CATC ACG GGT TAG GTC A；qnrB－F：ACG ATG TAT GG T AGC CGT AA，qnrBR：GAT CGT GTC GTC CAG ATT GG；qnrS－F：ACG ACA TCG ATC GGC TGC GT，qnrS－R：TAG CTG TGC ACG CTT GAG GC；qnrC－F：GAG TTG TAC ATA TTG AGT CG，qnrCR：CAC CTA CGC ATG TAT AGT CA；qnrD－F：CGA GAC AAT CTA CGC GAA TA，qnrD－R：AGC ATG CTG AGC GCA TGC TA；aac（6′）－Ib－F：TTG CGA TGC TCT ATG AGT CGC TA，aac（6′）－Ib－R：CTC GAA TGC CTG GCG TGT TT；qepA－F：AAC TGC TTG ACC CCG TAT AT，qepA－R：GTC TAC GCC ATG GAC CTC AC 依照多重PCR 的要求優(yōu)化反應(yīng)條件，用于擴(kuò)展目的基因。合成的引物臨用前稀釋，將裝有引物的EP管5 000r／min離心1min，加入少量的去離子水，使引物濃度為10μmol／L，分裝后置于－20 ℃保存待用。

1.3.5.2 PMQR 基因的PCR 擴(kuò)增與測(cè)序 耐藥PA 菌株篩選PMQR 質(zhì)粒，進(jìn)行多重PCR 反 應(yīng)（qnrA／qnrB／qnrS／qnrC／qnrD）的反應(yīng)體系，共50μL：Premix Ex Taq 25μL，qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD 的引物（包括上、下游）各1μL。DNA模板4μL、水11μL。PCR 反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，53 ℃退火45s，72 ℃延伸60s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10min。

1.3.5.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 稱取1.20g瓊脂粉放入三角燒瓶中，加入0.5×TBE緩沖液100mL，微波爐加熱至完全熔化，取出冷卻至58 ℃左右，加入EB 母液（10 mg／mL）至終濃度為0.5μg／mL。緩慢倒入模具中。凝固后將內(nèi)槽和著凝膠一起放入電泳槽，負(fù)極與上樣孔在同一側(cè)。加入緩沖液0.5×TBE蓋過凝膠表面。取10×上樣緩沖液2μL與18μL PCR 產(chǎn)物混勻，加到凝膠板上樣孔內(nèi)，另外選一孔加入6μL dp1000Marker。用100V 直流電源電泳40min，當(dāng)溴酚藍(lán)染料泳動(dòng)至距離凝膠前沿2cm 處停止電泳，取出凝膠用紫外投射儀內(nèi)看結(jié)果并拍攝照片。

1.3.5.4 序列比對(duì)與分析 序列測(cè)序委托深圳華大基因公司完成，測(cè)序結(jié)果使用Chromas、DNAStar、VectorNT1、Suite8等軟件進(jìn)行查看及序列校正拼接，借助NCBI BLAST 程序（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）與GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，明確基因亞型、有無突變、突變位點(diǎn)及由此導(dǎo)致的氨基酸改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與圖表制作使用Microsoft Excel2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和圖表制作。

2 結(jié) 果

2.1 PA 完全耐藥株的出現(xiàn) 在第9次誘變轉(zhuǎn)種后出現(xiàn)A9－3、A9－9 2株完全耐藥株。

圖1 耐藥株質(zhì)粒DNA 電泳圖

2.2 耐藥菌株提取質(zhì)粒的電泳 見圖1。

2.3 耐藥株質(zhì)粒測(cè)序及比對(duì) 測(cè)序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，耐藥株質(zhì)?；?yàn)閝nrS，見圖2（見《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”）。

3 討 論

與PA 耐藥機(jī)制有 關(guān) 的 因 素［5－6］主 要 有（1）細(xì) 菌 產(chǎn) 生 抗 菌活性酶，如β－內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷鈍化酶等；（2）細(xì)菌改變抗菌藥物作用的靶位，如青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）、DNA 旋轉(zhuǎn)酶等結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而逃避抗菌藥物的抗菌作用；（3）外膜通透性降低；（4）生物膜形成；（5）主動(dòng)泵出系統(tǒng)。質(zhì)粒是宿主細(xì)胞核質(zhì)中存在的雙鏈DNA。喹諾酮類藥物作用于細(xì)菌的靶酶為革蘭陰性菌的DNA 旋轉(zhuǎn)酶及革蘭陽性菌拓?fù)洚悩?gòu)酶。PA 屬于革蘭陰性菌，其產(chǎn)生耐喹諾酮藥物主要是由于DNA 酶結(jié)構(gòu)改變，而質(zhì)粒的變異是導(dǎo)致DNA 酶改變的主要因素之一。本課題證明PA 在喹諾酮抑菌圈外（低于有效抑菌濃度）連續(xù)進(jìn)行9次轉(zhuǎn)種誘變，細(xì)菌有耐藥質(zhì)粒檢出，細(xì)菌已獲得耐藥性突變。與同一城市不同城區(qū)的PA 耐藥性略有不同，深圳市南山區(qū)PA 2011～2012年耐藥基因共檢測(cè)出11種［7］。ICU 患者及燒傷患者PA 耐藥率遠(yuǎn)高于其他患者［8］，耐藥感染致死率明顯高于其他細(xì)菌，對(duì)PA 不規(guī)范用藥導(dǎo)致耐藥應(yīng)引起足夠重視。蔣崗等［9］對(duì)廣州地區(qū)PA 常見8種耐藥基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)耐藥率均大于10%。吳俊等［10］研究廣州一家三甲醫(yī)院PA 耐藥機(jī)制時(shí)檢查出大型質(zhì)粒介導(dǎo)PA 菌株產(chǎn)金屬β－內(nèi)酰胺酶基因，感染患者病死率高達(dá)71%。PA 是容易獲得耐藥質(zhì)粒的一類條件致病菌，在ICU 及燒傷科感染率高，致死率高，連續(xù)低濃度用藥細(xì)菌細(xì)菌容易突變獲得耐藥性，使用PA 敏感的抗菌藥物一定要定時(shí)監(jiān)測(cè)血藥濃度并注意幾種敏感藥物要交替使用。

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