韓善橋，趙曉航，石 峰，史成和

（中國人民解放軍海軍總醫(yī)院基礎醫(yī)學研究中心，北京100048）

金黃色葡萄球菌存在于人體鼻黏膜、皮膚及腸道等部位，是化膿性感染的常見病原菌之一，除引起癤、癰、膿腫等局部感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心內(nèi)膜炎和膿毒血癥等全身感染。金黃色葡萄球菌為侵襲性細菌，能產(chǎn)生腸毒素，對腸黏膜損傷性大，所致腸炎起病急，中毒癥狀重，主要表現(xiàn)為嘔吐、發(fā)熱、腹瀉等，因此，金黃色葡萄球菌快速檢測對臨床及時診治具有重要意義。分離培養(yǎng)法鑒定金黃色葡萄球菌操作復雜，檢測周期長且需細菌檢驗人員，難以在實驗室之外的特殊環(huán)境下進行。用測試片法鑒定金黃色葡萄球菌操作簡單，結果準確［1－4］。金黃色葡萄球菌測試片現(xiàn)應用于食品衛(wèi)生的檢測，用于臨床標本的檢測尚未見報道。本研究擬在探討金黃色葡萄球菌測試片在檢測臨床標本中的應用情況，為在特殊情況下進行金黃色葡萄球菌感染的快速檢測提供幫助。

1 材料與方法

1.1 標準菌株來源 金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、無乳鏈球菌、糞腸球菌、藤黃微球菌、大腸埃希菌、鼠傷寒沙門菌、福氏志賀菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、阪崎腸桿菌、肺炎克雷伯菌、弗氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、空腸彎曲菌、小腸結腸炎耶爾森菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、產(chǎn)單核細胞李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌和嗜水氣單胞菌，均購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 檢測標本來源 檢測標本來自臨床，包括尿液40份、腹水15份、傷口分泌物20份。

1.3 儀器與耗材 VITEK2Compact全自動微生物分析儀，法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。金黃色葡萄球菌測試片購自北京陸橋技術有限責任公司（在有效期內(nèi)使用）。培養(yǎng)基包括胰蛋白胨大豆肉湯、腦心浸出液肉湯、布氏肉湯、血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、胰蛋白胨大豆瓊脂和3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂，均購自北京陸橋技術有限責任公司（在有效期內(nèi)使用）。

1.4 方法

1.4.1 標準菌株復蘇 將金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌和無乳鏈球菌等標準菌株按操作說明進行復蘇。

1.4.2 測試片定量檢測 吸取標本1mL 于無紡布棉墊上，待液體吸收后，輕輕蓋上薄膜并將邊緣推平，將測試片正面平放于溫箱中，35 ℃培養(yǎng)24h，觀察結果。

1.4.3 測試片定性檢測 揭開測試片薄膜，吸取1 mL 無菌生理鹽水于無紡布棉墊上，待液體吸收后，接種待測標本，蓋上薄膜并將邊緣推平，將測試片正面平放于溫箱中，35℃培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況。

1.4.4 測試片靈敏度試驗 制備金黃色葡萄球菌新鮮菌液，用無菌生理鹽水將菌懸液濃度稀釋為10－5、10－6、10－7、10－8和10－9倍，分別吸取不同濃度菌懸液1.0 mL，接種測試片和胰蛋白胨大豆瓊脂平板，35 ℃培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)結果。

1.4.5 測試片特異性試驗 制備金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌和無乳鏈球菌等26種標準菌株新鮮菌液，用無菌生理鹽水稀釋成10－5倍菌懸液，分別吸取不同標準菌株菌懸液1.0mL接種測試片，35 ℃培養(yǎng)24h，觀察細菌生長情況。

1.4.6 標本接種 根據(jù)不同標本選擇最佳接種方法，35 ℃培養(yǎng)24h。（1）測試片直接接種標本：對于液體標本（尿液、腹水、腦脊液），直接接種標本1mL；（2）測試片加無菌生理鹽水再接種標本：對于拭子取樣標本，先將測試片加無菌生理鹽水1 mL，再接種標本；（3）標本經(jīng)倍比稀釋再接種：對于定量實驗或標本中細菌數(shù)多，應將標本作10倍倍比稀釋再接種。

1.4.7 測試片最佳培養(yǎng)時間觀察試驗 將測試片接種金黃色葡萄球菌后，在35 ℃溫箱分別培養(yǎng)15、18、24和30h，觀察細菌生長情況，選擇最佳培養(yǎng)時間。

1.4.8 測試片穩(wěn)定性試驗 將測試片完整包裝分別存放在4 ℃冰箱、25 ℃室溫和35 ℃孵箱3個不同溫度下，每7d檢測1次，共檢測2次。

1.4.9 細菌鑒定 將臨床標本分別接種測試片、血瓊脂平板或胰蛋白胨大豆瓊脂平板，35 ℃培養(yǎng)24h，血瓊脂平板或胰蛋白胨大豆瓊脂平板生長的細菌，使用全自動微生物分析儀鑒定。

1.4.10 測試片結果判定 測試片出現(xiàn)藍綠色菌落為金黃色葡萄球菌，為陽性結果；測試片為無色或未見藍綠色菌落為陰性結果。如果尿液中金黃色葡萄球菌數(shù)大于或等于104CFU／mL，可診斷泌尿道感染。如傷口分泌物中金黃色葡萄球菌數(shù)大于或等于103CFU／mL，表明傷口可能發(fā)生細菌感染。對于特殊體液標本（如腹水、腦脊液、關節(jié)液），如測試片上有細菌生長，則表明相應部位可能有細菌感染。

2 結 果

2.1 測試片靈敏度試驗 金黃色葡萄球菌測試片對其純菌液檢測下限為1CFU／mL，當臨床標本中金黃色葡萄球菌為大于或等于1CFU／mL時，測試片即可顯示陽性結果，見表1。

表1 金黃色葡萄球菌測試片靈敏度試驗結果（CFU／mL）

2.2 測試片特異性試驗 在被檢測的26種細菌中，除金黃色葡萄球菌呈藍綠色菌落，表皮葡萄球菌呈黑色菌落外，其余24種非目的菌（糞腸球菌、藤黃微球菌、無乳鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、阪崎腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、鼠傷寒沙門菌、福氏志賀菌、空腸彎曲菌、小腸結腸炎耶爾森菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、嗜水氣單胞菌、產(chǎn)單核細胞李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌）在測試片上均不生長。

2.3 細菌復活試驗 將測試片上的藍綠色菌落接種到血瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)24h，細菌生長良好。表明測試片上生長的細菌可以保留菌種，進一步做細菌藥敏試驗及流行病學調(diào)查。

2.4 最佳培養(yǎng)時間試驗 培養(yǎng)24h 后觀察結果比較好，見表2。

表2 不同培養(yǎng)時間金黃色葡萄球菌在測試片上的檢出率

2.5 測試片儲存穩(wěn)定性試驗 金黃色葡萄球菌均能在培養(yǎng)24h后出結果，與4 ℃存放檢測菌落數(shù)符合率在92%以上，見表3。

表3 不同存放時間和溫度對測試片檢測結果的影響

2.6 臨床標本檢測試驗 測試片法與分離培養(yǎng)法的陽性結果一致，見表4。

表4 測試片法與分離培養(yǎng)法檢測臨床標本結果比較（n）

3 討 論

傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法細菌鑒定需要對標本進行培養(yǎng)，待分離出純菌落后，才能進行細菌鑒定，雖然此方法經(jīng)典、可靠，但操作復雜、時間長，且需要在有條件的實驗室和細菌檢驗人員才能開展［5－7］。顯色培養(yǎng)基是利用細菌產(chǎn)生的特異酶與相應底物（由產(chǎn)色基團和細菌可代謝物質(zhì)組成）反應而顯色，直接觀察菌落顏色進行鑒定［8－9］，但仍需配制培養(yǎng)基和高壓滅菌，也不適合在野外和艦船上開展。測試片法鑒定細菌是以紙片、無紡布或冷水可凝膠等替代瓊脂作為載體，采用選擇性培養(yǎng)基和特異性的酶顯色劑作為主要原料，制成的一次性細菌快速鑒定產(chǎn)品［10］。它是在分離培養(yǎng)法和顯色培養(yǎng)基的基礎上發(fā)展而來的一項新技術，與分離培養(yǎng)法相比，測試片法克服了分離培養(yǎng)法在細菌培養(yǎng)、分離、鑒定等操作中比較復雜的缺點，只需加樣培養(yǎng)24h，直接觀察菌落顏色，即可對細菌作出鑒定，不需配制培養(yǎng)基，操作簡單，便于攜帶，檢測時間短，非檢驗人員均可操作，特別適合在艦船遠航及野外環(huán)境等特殊情況下開展。但細菌測試片法也存在一定不足，如測試片加樣后馬上蓋上薄膜，液體易溢出；測試片種類比較少，只能檢測十幾種常見細菌；對于一些混合細菌感染的標本，使用一種測試片不能同時檢測和鑒定多種病原菌等。

金黃色葡萄球菌測試片具有良好的特異性，在被測定的26種細菌中，除金黃色葡萄球菌呈藍綠色菌落、表皮葡萄球菌呈黑色菌落外，其余24種非目的菌均不生長。金黃色葡萄球菌測試片靈敏度高，對純菌的檢測靈敏度可達1CFU／mL，對菌落數(shù)目在1～9個范圍內(nèi)的菌液，測試片法與平皿法一樣均能檢測出來。對于一些無菌部位的體液標本，如腹水、腦脊液、關節(jié)液等，其檢出陽性結果具有一定臨床意義。用測試片法與培養(yǎng)法同時檢測臨床標本75份，其檢測結果一致。測試片在短時間使用和運輸中，無需采取特殊保存措施。因此，在一些特殊情況下，如野外環(huán)境訓練、搶險救災開展醫(yī)療服務，艦船遠航進行衛(wèi)勤保障，發(fā)生食物中毒后指導突發(fā)事件的處理等，金黃色葡萄球菌測試片都具有重要的應用價值。

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