張肖靜，李 冬，梁瑜海，張 杰，3

(1.環(huán)境污染治理與生態(tài)修復(fù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心 (鄭州輕工業(yè)學(xué)院)，450001鄭州;2.水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京工業(yè)大學(xué))，100124北京;3.城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(哈爾濱工業(yè)大學(xué))，150090哈爾濱)

全程自養(yǎng)脫氮工藝(completely nitrogen removal over nitrite，CANON)是近年來在厭氧氨氧化反應(yīng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，該工藝將亞硝化反應(yīng)和厭氧氨氧化反應(yīng)結(jié)合在同一個(gè)反應(yīng)器中，在單一系統(tǒng)內(nèi)完成總氮的去除［1-2］，其反應(yīng)式［3］

然而，該工藝的最大總氮去除率僅為89%，無法實(shí)現(xiàn)完全脫氮.此外，該工藝完全不消耗COD，而不含任何COD的廢水幾乎是沒有的.因此，在CANON工藝的基礎(chǔ)上，提出了同步亞硝化厭氧氨氧化反硝化(simultaneous partial nitrification，anammox and denitrification，SNAD)工藝［4-5］.該工藝將反硝化反應(yīng)

耦合進(jìn)CANON工藝，即將式(2)與式(1)兩種反應(yīng)結(jié)合，去除CANON反應(yīng)生成的硝氮，同時(shí)消耗一部分 COD，實(shí)現(xiàn)碳氮的同時(shí)去除［4，6］.SNAD 工藝已經(jīng)在幾個(gè)處理高溫高氨氮廢水的實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)中得到成功應(yīng)用［5，7-10］，目前關(guān)于低氨氮廢水的研究還較少，尤其是生活污水的研究未見報(bào)道.

本文在MBR內(nèi)首先啟動(dòng)了CANON工藝，之后通過逐漸加入COD轉(zhuǎn)變?yōu)镾NAD工藝，在其穩(wěn)定運(yùn)行后逐步引入生活污水，考察了常溫下MBR-SNAD工藝應(yīng)用于實(shí)際生活污水處理的可行性及系統(tǒng)內(nèi)的脫氮路徑，利用克隆-測(cè)序技術(shù)分析了處理生活污水的MBR系統(tǒng)內(nèi)的微生物特征，以期為該工藝的應(yīng)用提供技術(shù)指導(dǎo).

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

以SNAD工藝穩(wěn)定運(yùn)行的MBR用于處理生活污水，考察污染物去除效果及相應(yīng)的微生物特征，MBR反應(yīng)器裝置見圖1.反應(yīng)器高40 cm，內(nèi)徑13 cm，有效體積3 L.內(nèi)部放置聚偏氟乙烯中空纖維膜組件(廈門，鯤揚(yáng))，膜孔徑 0.1μm，有效面積0.2 m2，膜清水通量36 L/h.反應(yīng)器底部設(shè)曝氣環(huán)供氧，內(nèi)部設(shè)機(jī)械攪拌器混合泥水.連續(xù)進(jìn)水的同時(shí)，通過蠕動(dòng)泵經(jīng)由膜絲連續(xù)抽吸出水.整個(gè)反應(yīng)器置于直徑30 cm的水浴中，保證恒溫25℃運(yùn)行.實(shí)驗(yàn)過程中曝氣量為0.4 L/min左右，DO 為0.15 mg/L，HRT 為 3.0～3.1 h.

圖1 MBR反應(yīng)器裝置原理

1.2 實(shí)驗(yàn)用水

首先以1/2生活污水加1/2配水的條件運(yùn)行，其中配水中以(NH4)2SO4、NaHCO3及葡萄糖為主要基質(zhì)，并添加少量 KH2PO4、MgSO4·H2O、無水 CaCl2及微量元素溶液［11］，配水中氨氮質(zhì)量濃度為100 mg/L，COD為400 mg/L.運(yùn)行1個(gè)月之后，將進(jìn)水改為全部生活污水.該生活污水取自某家屬區(qū)化糞池沉淀后廢水，實(shí)驗(yàn)期間生活污水水質(zhì)見表1.

表1 實(shí)驗(yàn)期間生活污水水質(zhì)

1.3 分析方法

NH4+-N:納氏試劑分光光度法;NO2--N:N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3--N:紫外分光光度法;COD:5B-3B型COD快速測(cè)定儀;堿度:ZDJ-2D電位滴定儀;DO、pH、T:WTW多電極測(cè)定儀.

1.4 DNA提取和克隆測(cè)序

在實(shí)驗(yàn)的最后1 d從反應(yīng)器中取污泥，利用DNA提取試劑盒(上海生工)根據(jù)說明書步驟提取基因組DNA，提取出的DNA在0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，以檢查純度及長度是否正確.之后利用純化試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行純化，以去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì).

對(duì)純化后的DNA采用正義引物27 F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反義引物1492 R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行基因組16SrRNA的擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增條件如下:94℃，5 min;35個(gè)循環(huán)(94℃，30 s;55℃，40 s;72℃，90 s);72℃，8 min.之后利用純化試劑盒(上海生工)將PCR產(chǎn)物純化回收，采用pMD19-T克隆系統(tǒng)進(jìn)行克隆，克隆子送至上海生工公司在ABI3730系統(tǒng)上進(jìn)行測(cè)序.共測(cè)得22個(gè)有效序列，有效序列采用BLAST工具與GenBank數(shù)據(jù)庫中的注冊(cè)序列進(jìn)行比對(duì).

2 結(jié)果與討論

2.1 生活污水中污染物的同時(shí)高效去除

在穩(wěn)定運(yùn)行的MBR-SNAD系統(tǒng)，第1階段(第6～37天)首先加入1/2的生活污水及1/2的人工配水，第2階段(第38～96天)則改為全部生活污水，總氮去除效果如圖2所示.在反應(yīng)器引入1/2生活污水后，出水氨氮最初有幾天升高，這可能是由于生活污水中存在的有機(jī)物、表面活性劑等，使得微生物不能很快適應(yīng)水質(zhì)的變化.同時(shí)，總氮去除率和總氮去除負(fù)荷(RNR)也有一定程度的下降.然而，生活污水的引入并沒有對(duì)該系統(tǒng)造成太大的沖擊，RNR很快開始升高，而且一直呈現(xiàn)升高的趨勢(shì).運(yùn)行1個(gè)月時(shí)RNR基本穩(wěn)定，出水亞氮和硝氮幾乎均檢測(cè)不到.這些結(jié)果表明，反應(yīng)器里亞硝化、厭氧氨氧化和反硝化很好地完成了相互適應(yīng)的過程，在同一個(gè)系統(tǒng)內(nèi)協(xié)同合作，實(shí)現(xiàn)了異養(yǎng)脫氮與自養(yǎng)脫氮的耦合.1個(gè)月后，將進(jìn)水改為全部生活污水，進(jìn)水氨氮質(zhì)量濃度波動(dòng)較大，然而在兩個(gè)月的運(yùn)行期間，反應(yīng)器均能夠保持較高的RNR，基本穩(wěn)定在0.65 kg/(m3·d)，總氮去除率穩(wěn)定在93.3%，出水氨氮小于5 mg/L，能夠達(dá)到城市污水一級(jí)A排放標(biāo)準(zhǔn).可見，總氮去除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CANON工藝的理論最高去除率，這說明將生活污水引入CANON工藝，實(shí)現(xiàn)了反硝化與CANON工藝的耦合，即SNAD工藝，能夠提高總氮去除率，進(jìn)一步增強(qiáng)脫氮效果.

圖2 生活污水中總氮去除效果

生活污水中COD的去除效果如圖3所示，生活污水中COD在300 mg/L左右，質(zhì)量濃度波動(dòng)較大，但是出水COD一般能保持在50 mg/L以下，達(dá)到城市污水廠的一級(jí)A出水要求，COD去除率最終穩(wěn)定在87.2%左右.SNAD最大的優(yōu)勢(shì)是能夠利用COD反硝化CANON反應(yīng)產(chǎn)生的硝氮，既能提高總氮的去除率，又能減少降解COD消耗的溶解氧.之前的一些CANON工藝中，根據(jù)反應(yīng)式理論的最大總氮去除率為89%，實(shí)際中都要小于理論值.Chang等［12］的研究得出在常溫CANON生物濾柱中總氮去除率為70.14%，而本文穩(wěn)定在87.2%.之前的研究均采用先將COD去除，再進(jìn)行CANON工藝自養(yǎng)脫氮的方式，或者直接對(duì)人工配制的不含COD的廢水進(jìn)行研究，總氮去除率均在80%以下［12-13］.而本文在一個(gè)反應(yīng)器中同時(shí)實(shí)現(xiàn)了COD和總氮的高效去除，總氮去除率穩(wěn)定在93.3%，且不需要外加任何物質(zhì)，具有良好的發(fā)展前景.

由圖4可知，該系統(tǒng)對(duì)SS具有很好的去除能力，進(jìn)水濁度在14.1～145 NTU波動(dòng)，而出水濁度一直保持在1 NTU以下.這是由于膜組件的高效過濾作用，膜孔徑為0.1μm，絕大部分SS均得到有效去除.在城市污水廠中，一般先前設(shè)初沉池對(duì)SS進(jìn)行去除，再進(jìn)行生物反應(yīng).本實(shí)驗(yàn)中，只在配水桶中對(duì)生活污水進(jìn)行簡(jiǎn)單初沉之后，將大塊雜質(zhì)去除以免堵塞膜孔，之后即進(jìn)水反應(yīng)，得到較好的出水水質(zhì).如后續(xù)接化學(xué)除磷裝置，則可實(shí)現(xiàn)生活污水中所有污染物的同時(shí)高效去除.實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了MBR-SNAD系統(tǒng)是處理生活污水的適宜裝置，可以有效去除生活污水中的多種污染物，達(dá)到污水排放標(biāo)準(zhǔn).該系統(tǒng)可作為小區(qū)回用水裝置或者小型工業(yè)廢水處理裝置等，為含氮廢水的單獨(dú)處理提供了一個(gè)新思路.

圖3 生活污水中COD去除效果

圖4 生活污水中濁度去除效果

2.2 脫氮路徑分析

在處理生活污水的過程中，Δρ(硝氮)與Δρ(氨氮)比小于CANON反應(yīng)的理論值0.11，推斷反應(yīng)器內(nèi)存在反硝化反應(yīng).為進(jìn)一步考察反硝化在生活污水處理系統(tǒng)中的作用，對(duì)反應(yīng)器運(yùn)行的兩個(gè)階段進(jìn)行脫氮路徑分析，其計(jì)算基于 CANON反應(yīng)式(式(1))和反硝化反應(yīng)式(式(2)).由于之后的微生物檢測(cè)中沒有檢測(cè)到NOB，假設(shè)反應(yīng)器中不存在硝化過程，也不存在由反硝化生成的亞氮［6，8］.選各階段最后15 d的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，進(jìn)出水水質(zhì)見表2.

表2 各階段穩(wěn)定期的平均進(jìn)出水水質(zhì) mg·L-1

在階段1，反應(yīng)器出水中亞氮和硝氮均有積累，亞氮的積累是由AOB將氨氮氧化而anammox沒有及時(shí)轉(zhuǎn)化所致.因此，在階段I氨氮的轉(zhuǎn)化量分為兩部分，一部分轉(zhuǎn)化為亞氮(a)，一部分被anammox(b)利用.而轉(zhuǎn)化生成的亞氮又可分為殘留在反應(yīng)器中的部分(c)和被anammox利用的部分(d).由于anammox進(jìn)行厭氧氨氧化反應(yīng)消耗氨氮和亞氮的摩爾比為1∶1，被anammox利用的亞氮對(duì)應(yīng)的氨氮為d，其與anammox利用的氨氮之和為參與CANON反應(yīng)的氨氮量.因此，氨氮的轉(zhuǎn)化量包括殘留在反應(yīng)器中的亞氮(c)和參與CANON反應(yīng)的部分(b+d).

基于以上分析，參與CANON反應(yīng)的氨氮為

根據(jù)式(1)，CANON反應(yīng)去除的總氮為81.08×0.89=72.16 mg/L;

生成的硝氮為 0.11×81.08=8.92 mg/L;

因此，反硝化消耗的硝氮為 8.92+0.36-0.9=8.38 mg/L;

根據(jù)式(2)，反硝化1 g硝氮需消耗2.86 g COD，因此，反硝化消耗的 COD 為 7.4×2.86=21.16 mg/L;

COD 總?cè)コ繛?294.94-39.82=255.12 mg/L;

其余的COD去除則由異養(yǎng)菌氧化完成，即255.12-21.16=233.96 mg/L;

總氮去除量為 ρ進(jìn)水(NH4+)+ρ進(jìn)水(NO2-)+ ρ進(jìn)水(NO3-)-(ρ出水(NH4+)+ρ出水(NO2-)+ρ出水(NO3-))=94.62+0.36+0.36-(13.12+0.78+0.9)=80.54 mg/L.

所以，反硝化占總氮去除的比例為8.38/80.54=10.4%;厭氧氨氧化所占的比例為 72.16/80.54=89.6%.

在階段2，出水中亞氮和硝氮均為0.進(jìn)水中的亞氮由CANON反應(yīng)轉(zhuǎn)化，CANON反應(yīng)生成的硝氮及進(jìn)水中的硝氮?jiǎng)t均由反硝化反應(yīng)轉(zhuǎn)化.

因此，參與CANON反應(yīng)的氨氮和亞氮總和為

根據(jù)式(1)，CANON反應(yīng)去除的總氮為81.66×0.89=72.68 mg/L;

生成的硝氮為 0.11×81.66=8.98 mg/L.

因此，反硝化消耗的硝氮為 8.98+1.06-0.06=9.98 mg/L;

反硝化消耗的 COD 為 9.98×2.86=28.55 mg/L;COD 總?cè)コ繛?262.43-32.88=229.55 mg/L;

其余的COD去除則由異養(yǎng)菌氧化，即229.55-28.55=201 mg/L;

總氮去除量為ρ進(jìn)水(NH4+)+ ρ進(jìn)水(NO2

-)+ρ進(jìn)水(NO3

-)-(ρ出水(NH4+)+ρ出水(NO2

-)+ρ出水(NO3

-))=84.96+0.11+1.06-(3.41+0+0.06)=82.66 mg/L.

所以，反硝化占總氮去除的比例為 9.98/82.66=12.07%;厭氧氨氧化所占的比例為 72.68/82.66=87.93%.

由上述結(jié)果可知，在處理全部生活污水階段，反應(yīng)器中反硝化比例高達(dá)12.44%，而SNAD工藝中反硝化的理論最大比例僅為11%.出現(xiàn)該差異的原因是進(jìn)水中含有少量硝氮，而這部分硝氮也被反硝化轉(zhuǎn)化，因此增加了反硝化比例.同時(shí)，該階段的結(jié)果說明，系統(tǒng)內(nèi)的COD大多通過好氧氧化去除，經(jīng)反硝化去除的COD不足30 mg.因此，在實(shí)際應(yīng)用中，可以首先前接厭氧產(chǎn)能工藝，將生活污水中大部分COD轉(zhuǎn)化為能源，出水進(jìn)入MBR-SNAD系統(tǒng)進(jìn)行氨氮去除和COD的進(jìn)一步去除，從而實(shí)現(xiàn)能源回收和低耗脫氮.

2.3 生活污水處理系統(tǒng)中的微生物特征

該生活污水處理系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定后，取泥樣進(jìn)行微生物群落組成分析，克隆測(cè)序結(jié)果見表3.可以看出，克隆 1、2、3均 屬于亞 硝化 單 胞菌(Nitrosomonas)，屬于AOB，在該系統(tǒng)內(nèi)主要負(fù)責(zé)氨氮的好氧氧化.而克隆 4為厭氧氨氧化庫氏菌(Candidatus Kuenenia stuttgartiensis)，屬于 anammox菌［14］，主要負(fù)責(zé)將AOB生成的亞氮和剩余的氨氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)馀欧?克隆5和6屬于反硝化菌，同時(shí)克隆7也具有反硝化功能［15］，負(fù)責(zé)將anammox生成的硝氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)?，?shí)現(xiàn)TN的進(jìn)一步去除.由此可見，在測(cè)得的22個(gè)有效序列中包含有1/3的脫氮功能菌，因此，脫氮菌仍然是系統(tǒng)內(nèi)的優(yōu)勢(shì)微生物，該系統(tǒng)是以脫氮為主體的反應(yīng)系統(tǒng)，這與反應(yīng)器表現(xiàn)出高效的脫氮性能一致.另一方面，3個(gè)AOB的序列均屬于亞硝化單胞菌，說明AOB群落較單一，從側(cè)面也證明了是自養(yǎng)脫氮為主體的工藝，因?yàn)樽责B(yǎng)脫氮系統(tǒng)對(duì)于亞硝化單胞菌具有優(yōu)先選擇性.同時(shí)，3種脫氮菌的共存也證明了反硝化與CANON工藝的成功耦合，即SNAD工藝的成功實(shí)現(xiàn).3種微生物在該系統(tǒng)內(nèi)協(xié)同作用，完成了COD和TN的同時(shí)去除.

反應(yīng)器內(nèi)COD的去除主要是由好氧異養(yǎng)菌和厭氧反硝化菌兩類細(xì)菌完成.由2.2節(jié)的計(jì)算過程可知，通過反硝化去除的COD很少，COD的去除大部分由好氧異養(yǎng)菌完成.好氧異養(yǎng)菌的分類很多，且很多細(xì)菌均具有該能力，因此，目前沒有很好的微生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定或者劃分.在這22個(gè)序列中，有12個(gè)序列屬于變形菌門，證明了變形菌門的優(yōu)勢(shì)地位，此外還包含一些與未培養(yǎng)的序列相似度較高的序列.克隆22為菌膠團(tuán)，證明反應(yīng)器內(nèi)主要是以活性污泥法為主體的生態(tài)系統(tǒng).

表3 16S rRNA的克隆－測(cè)序結(jié)果

3 結(jié)論

1)MBR-SNAD工藝適宜處理生活污水，可實(shí)現(xiàn)C、N及 SS的同時(shí)高效去除.總氮去除負(fù)荷達(dá)到0.65 kg/(m3·d)，出水氨氮小于 5 mg/L;COD 去除率達(dá)87%，出水COD小于50 mg/L;濁度去除率達(dá)99%，出水濁度小于1 NTU.

2)處理生活污水的MBR-SNAD工藝中主要存在好氧氨氧化、厭氧氨氧化和反硝化多種脫氮路徑，其中自養(yǎng)脫氮比例為88%，異養(yǎng)反硝化比例為12%.

3)系統(tǒng)內(nèi)脫氮微生物為亞硝化單胞菌、厭氧氨氧化庫氏菌和反硝化菌，3種微生物協(xié)同作用完成了COD和TN的同時(shí)去除.

［1］THIRD K A，SLIEKERS A O，KUENEN J G，et al.The CANON system(completely autotrophic nitrogen-removal over nitrite)under ammonium limitation:interaction and competition between three groups of bacteria［J］.Systematic and Applied Microbiology，2001，24(4):588-596.

［2］KARTAL B，KUENEN J G，VAN LOOSDRECHT M C M.Sewage treatment with Anammox［J］.Science，2010，328(5):702-704.

［3］SLIEKERS A O，DERWORT N，CAMPOS-GOMEZ J L，et al.Completely autotrophic nitrogen removal over nitrite in one single reactor［J］.Water Research，2002，36(10):2475-2482.

［4］KUMAR M，LIN JG.Co-existenceofanammoxand denitrification for simultaneous nitrogen and carbon removal:strategies and issues［J］.J Hazard Mater，2010，178(1/2/3):1-9.

［5］CHEN H，LIU S，YANG F，et al.The development of simultaneous partial nitrification，ANAMMOX and denitrification(SNAD)process in a single reactor for nitrogen removal［J］.Bioresour Technol，2009，100(4):1548-1554.

［6］LAN C J，KUMAR M，WANG C C，et al.Development of simultaneous partial nitrification， anammox and denitrification(SNAD)process in a sequential batch reactor［J］.Bioresour Technol，2011，102(9):5514-5519.

［7］KELUSKAR R，NERURKAR A，DESAI A.Development of a simultaneous partial nitrification，anaerobic ammonia oxidation and denitrification(SNAD)bench scale process for removal of ammonia from effluent of a fertilizer industry［J］.Bioresour Technol，2013，130:390-397.

［8］WANG C C，LEE P H，KUMAR M，et al.Simultaneous partial nitrification，anaerobicammonium oxidation and denitrification(SNAD)in a full-scale landfill-leachate treatment plant［J］.J Hazard Mater，2010，175(1/2/3):622-628.

［9］DAVEREY A，HUNGNT，DUTTAK，etal.Ambient temperature SNAD process treating anaerobic digester liquor of swine wastewater［J］.Bioresour Technol，2013，141:191-198.

［10］DAVEREY A，SU S H，HUANG Y T，et al.Nitrogen removal from opto-electronic wastewater using the simultaneous partialnitrification，anaerobic ammonium oxidation and denitrification(SNAD)process in sequencing batch reactor［J］.Bioresour Technol，2012，113:225-231.

［11］VAN DE GRAAF A A，DE BRUIJN P，ROBERTSON L A，et al.Autotrophic growth of anaerobic ammonium-oxidizing micro-organisms in a fluidized bed reactor［J］.Microbiology-UK，1996，142:2187-2196.

［12］CHANG X，LI D，LIANG Y，et al.Performance of a completely autotrophic nitrogen removal over nitrite process for treating wastewater with different substrates at ambient temperature［J］.Journal of Environmental Sciences，2013，25(4):688-697.

［13］付昆明，左早榮，仇付國.陶粒CANON反應(yīng)器的接種啟動(dòng)與運(yùn)行［J］.環(huán)境科學(xué)，2014，35(3):995-1001.

［14］鄭平，張蕾.厭氧氨氧化菌的特性與分類［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2009，35(5):473-481.

［15］梁麗華，左劍惡.現(xiàn)代非培養(yǎng)技術(shù)在反硝化微生物種群結(jié)構(gòu)和功能研究中的應(yīng)用［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28(4):599-605.