程忠雨 周亮 湯海霞

·臨床研究·

16S rRNA基因在肺炎支原體鑒定中的應(yīng)用

程忠雨 周亮 湯海霞

目的 我們通過(guò)比較利用16S rRNA基因和血清學(xué)檢驗(yàn)方法在診斷肺炎支原體感染中的效果差異，期待找到一種快速有效的方法來(lái)鑒定支原體肺炎，并建立一套完善的支原體肺炎臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。方法 將我院呼吸科收治的140例患者分成兩組，16S rRNA基因組70例，用16S rRNA基因進(jìn)行檢驗(yàn)；血清學(xué)檢驗(yàn)組70例，用血清學(xué)檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn)。通過(guò)比較檢驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性率、靈敏度和檢驗(yàn)平均耗時(shí)判定診斷方法在診斷肺炎支原體感染中效果的差異。結(jié)果 血清學(xué)檢驗(yàn)組靈敏度為65%，假陽(yáng)性率為36%，檢驗(yàn)平均耗時(shí)為3 h；16S rRNA基因檢驗(yàn)組靈敏度為85%，假陽(yáng)性率為21%，檢測(cè)平均耗時(shí)為0.5 h。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)的處理方式，以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 16S rRNA基因檢驗(yàn)作為一種新型的診斷技術(shù)，在診斷肺炎支原體感染中相比傳統(tǒng)的血清學(xué)檢驗(yàn)方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，無(wú)論在靈敏度、檢驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性率和檢驗(yàn)耗時(shí)上都優(yōu)勢(shì)明顯，可考慮作為一種常用的支原體肺炎臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。

肺炎支原體；16S rRNA；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；血清學(xué)檢驗(yàn)方法；肺炎

肺炎支原體(M.Pneumonia)作為一種無(wú)細(xì)胞壁的寄生微生物，能夠引起很多哺乳動(dòng)物呼吸系統(tǒng)嚴(yán)重病變，同時(shí)也是引發(fā)人類肺炎的常見(jiàn)病原微生物之一[1]，比如上呼吸道感染、間質(zhì)性肺炎等。臨床上由肺炎支原體引發(fā)的疾病病癥通常不明顯，經(jīng)過(guò)2～3周的潛伏期后，才會(huì)引發(fā)相應(yīng)的癥狀，例如口干、發(fā)熱、咳嗽以及不明原因的頭痛和肌肉酸痛等。由肺炎支原體引發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病與普通流行性感冒所表現(xiàn)的癥狀具有相似點(diǎn)，因此不易做出相應(yīng)的臨床鑒別診斷。由于較難診斷為肺炎支原體感染，常常錯(cuò)過(guò)最佳的治療時(shí)期，導(dǎo)致并發(fā)癥的產(chǎn)生，最終給患者的身心造成嚴(yán)重的損害。常用的肺炎支原體檢測(cè)方法主要有血清學(xué)法，包括酶聯(lián)免疫吸附法、凝集素試驗(yàn)法和明膠顆粒凝集法等，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，診斷方法逐漸多元化，出現(xiàn)了PCR診斷法、核酸診斷試驗(yàn)法等。

16S rRNA基因是原核微生物的標(biāo)志性基因，具有高度保守性，常用來(lái)作為標(biāo)志性基因用于原核微生物的鑒別和分類。不同生物的16S rRNA基因具有不同的保守區(qū)和可變區(qū)，通過(guò)該區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物即可擴(kuò)增出特異的目的片段，從而判定原核微生物的種屬特性；另外我們也可以利用原核微生物的16S rRNA基因通用引物對(duì)其基因組進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增出來(lái)的目的片段進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果判定該微生物的種屬特性[2]。因此我們期待找到一種快速有效的方法來(lái)鑒定支原體肺炎，并具有快速的檢測(cè)速度和較高的檢測(cè)靈敏度，從而為建立一套完善的支原體肺炎臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 選取2013年至今我院呼吸科收治的140例患者，其中男78例，女62例，平均分成兩組。16S rRNA基因組70例，其中男40例，女30例；血清學(xué)檢驗(yàn)組70例，其中男38例，女32例。16S rRNA基因組和血清學(xué)檢驗(yàn)組均有口干、發(fā)熱、咳嗽以及不明原因的頭痛和肌肉酸痛等癥狀。16S rRNA基因組70例，用16S rRNA基因進(jìn)行檢驗(yàn)；血清學(xué)檢驗(yàn)組70例，用血清學(xué)檢查方法進(jìn)行檢驗(yàn)。兩組患者的年齡組成均大于3歲，并且性別和年齡分布均勻。

1.2 診斷方法

1.2.1 16S rRNA基因檢驗(yàn)法 患者住院后，我們?cè)诘?天清晨從患者深部呼吸道分泌物取樣檢測(cè)。首先我們將患者頭部后仰，采用鼻咽拭子采樣法進(jìn)行采樣，將樣品稀釋處理后，利用原核生物16S rRNA通用引物對(duì)其基因組進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增的目的片段測(cè)序后序列在國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。與肺炎支原體16S rRNA基因序列一致并伴有上述臨床癥狀的我們認(rèn)為是肺炎支原體感染[3]。

1.2.2 血清學(xué)檢驗(yàn)方法 機(jī)體感染肺炎支原體后，體內(nèi)會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)，血液中不但出現(xiàn)相應(yīng)的抗體還會(huì)產(chǎn)生凝集素，凝集素與相應(yīng)抗原(O型紅細(xì)胞)在一定的條件下反應(yīng)產(chǎn)生IgM型抗體。我們通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(MP－IgM＞1∶80)結(jié)合上述臨床癥狀的判定為肺炎支原體感染。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)的處理方式，如果P值小于0.05，則認(rèn)為兩種檢驗(yàn)(16S rRNA基因檢驗(yàn)法和血清學(xué)檢驗(yàn)方法)差異明顯，計(jì)數(shù)資料以百分比表示。

2 研究結(jié)果

通過(guò)比較檢驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性率、靈敏度和檢驗(yàn)平均耗時(shí)判定診斷方法在診斷肺炎支原體感染中效果的差異。結(jié)果顯示，血清學(xué)檢驗(yàn)組靈敏度為65%，假陽(yáng)性率為36%，檢驗(yàn)平均耗時(shí)為3 h；16S rRNA基因檢驗(yàn)組靈敏度為85%，假陽(yáng)性率為21%，檢驗(yàn)平均耗時(shí)為0.5 h(表1)。

表1 兩種方法檢測(cè)肺炎支原體結(jié)果

從上表中可以看出16S rRNA基因作為一種新型的診斷技術(shù)，在診斷肺炎支原體感染中相比傳統(tǒng)的血清學(xué)檢驗(yàn)方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，無(wú)論在靈敏度、檢驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性率和檢驗(yàn)耗時(shí)上都優(yōu)勢(shì)明顯，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可考慮作為一種臨床上常用的支原體肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[4]。

3 討論

由肺炎支原體誘發(fā)的肺炎在臨床患者中占有比較大的比例，但是由于其臨床癥狀不典型，往往被誤認(rèn)為其他原因所引起的肺炎，錯(cuò)過(guò)最佳的診療時(shí)間。近年來(lái)隨著人們對(duì)肺炎支原體流行病學(xué)特征認(rèn)識(shí)的加深，隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)肺炎支原體的檢測(cè)逐漸有了新的手段和方法。傳統(tǒng)的檢測(cè)肺炎支原體的方法主要以血清學(xué)手段為主[5]，但是該方法靈敏度低、耗時(shí)長(zhǎng)，很難滿足快速診斷的臨床需求，因此開(kāi)發(fā)一種高效、快速、準(zhǔn)確有效的肺炎支原體檢測(cè)方法變得十分迫切。本研究通過(guò)對(duì)臨床病例的分組研究，證明了16S rRNA基因作為一種新型的診斷技術(shù)相比傳統(tǒng)的血清學(xué)檢驗(yàn)方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，具有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

[1]王責(zé)年，馬進(jìn)強(qiáng)，蘇艾云.肺炎支原體感染的實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2009，8(4)：458-460.

[2]郭紅波，季偉，王美娟.蘇州地區(qū)兒童肺炎支原體感染的流行病學(xué)分析[J].江蘇醫(yī)藥，2010，36(2)：160-162.

[3]陳倩，施圣云，胡正，等.南京地區(qū)急性呼吸道感染兒童支原體、衣原體和常見(jiàn)呼吸道報(bào)道病毒病原學(xué)分析[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2010，12(6)：450-454.

[4]葉湘，張真，王群興，等.女性泌尿生殖道感染支原體屬的分布及耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22(3)：652-653.

[5]王勇，祝曉瑩，袁紅瑛.泌尿生殖道支原體感染及耐藥性研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009(6)：702-704.

2014-12-01)

1005-619X(2015)04-0369-02

10.13517/j.cnki.ccm.2015.04.012

264309 山東省榮成市第二人民醫(yī)院呼吸科