胡梅　高杰　葛菊芬　許建　朱君芳　王娜

摘 要：為了提高辣椒游離小孢子培養(yǎng)時(shí)取材的準(zhǔn)確性，采用DAPI熒光染色法對(duì)4個(gè)不同品種類型的辣椒材料（Pimiento、HXR-WU-02、豬大腸及Chile Guajillo）5個(gè)不同長(zhǎng)度區(qū)組的花蕾進(jìn)行染色觀察，研究辣椒的花蕾長(zhǎng)度與其花粉中小孢子單核靠邊期比例之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，不同品種辣椒花蕾長(zhǎng)度與小孢子單核靠邊期比例之間存在差異性。且當(dāng)花蕾長(zhǎng)為4.0～4.49 mm時(shí)，4個(gè)供試?yán)苯菲贩NPimiento、HXR-WU-02、豬大腸及Chile Guajillo中在單核靠邊期的小孢子比例最高，分別為62.15%，68.04%，74.4%，60.23%。依據(jù)花蕾長(zhǎng)度與小孢子單核靠邊期比例的關(guān)系確定游離小孢子培養(yǎng)最佳時(shí)期所對(duì)應(yīng)的選蕾標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：辣椒；小孢子；花蕾長(zhǎng)度；發(fā)育時(shí)期

中圖分類號(hào)：S641.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.003

Relationgship between Length of Buds and Ratio of Uninucleate Microspore at Periphery in Capsicum annuum L.

HU Mei1， GAO Jie1， GE Ju-fen2， XU Jian1， ZHU Jun-fang1， WANG Na1

（1.College of Horticulture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi， Xinjiang 830052，China； 2. Urumqi Institute of Vegetable，Urumqi， Xinjiang 830075 ，China）

Abstract： In order to improve the accuracy of drawing materials when chili pepper isolated microspore culture，using DAPI fluorescent staining to stain and observe four different varieties of chili pepper （Pimiento， HXR-WU-02， pig intestine and Chile Guajillo） and the five different length interval of chili pepper′s bud， the relationship between length of chili pepper′s bud and ratio of uninucleate microspore at periphery in chili pepper was studied. The results showed that differences existed between length of bud in different varieties of chili pepper and ratio of uninucleate microspore at periphery in chili pepper .When the bud length is in 4.0～4.49 mm， the proportion of Uninucleate microspore at periphery of four varieties tested is the highest， and the ration is 62.15%， 68.04%， 74.4% and 62.15%， respectively. So the relationship between length of chili pepper′s bud and ratio of uninucleate microspore at periphery in chili pepper can define the standard of bud selection in correspondence with the optimal stage of anther culture.

Key words： Capsicum annuum L.； microspore； development stage； flower bubs

辣椒（Capsicum annuum L.）是茄科辣椒屬一年生或多年生草本植物，原產(chǎn)地在美洲中部和南部的熱帶地區(qū)，在明末傳入我國(guó)，并被普遍種植，是人們廣為熟知的一種蔬菜，也是中國(guó)栽培面積最大的蔬菜作物之一[1-3]。辣椒屬常異花授粉植物[2]。由于雜種優(yōu)勢(shì)十分明顯，雜交種一般比常規(guī)品種增加30%到50%的產(chǎn)量，同時(shí)抗病性、抗逆性提高和適應(yīng)性增強(qiáng)[4]。因此，研究單倍體育種的工作具有重要意義。

花培和小孢子游離培養(yǎng)是誘導(dǎo)單倍體植株[5]的重要方法之一。國(guó)內(nèi)辣椒花藥的培養(yǎng)始于1973年[6]。此后，許多學(xué)者對(duì)辣椒進(jìn)行了大量的花藥培養(yǎng)試驗(yàn)研究[7-8]，而今已成為獲取辣椒單倍體比較成熟的技術(shù)，在辣椒遺傳育種的工作中已被利用[9-10]。與花藥培養(yǎng)相比，游離小孢子培養(yǎng)可獲得純合單倍體植株，可避免花藥培養(yǎng)中母體組織帶來的雜合體[11]。因此，辣椒小孢子的發(fā)育在單倍體的誘導(dǎo)、遺傳物質(zhì)的建立、品種的選育和栽培方法的制定方面具有重要的意義[12]。目前有關(guān)報(bào)道辣椒游離小孢子培養(yǎng)獲得植株成功的較少[13]，主要是因?yàn)榧夹g(shù)體系的建立不完善，還不能應(yīng)用于遺傳育種或基礎(chǔ)性研究[1]。但是，有研究表明花蕾的選取標(biāo)準(zhǔn)是游離小孢子培養(yǎng)的重要技術(shù)之一[14-15]，而花蕾取材時(shí)期的選擇又是影響胚胎發(fā)生效率的主要因素之一[16]，以往的辣椒游離小孢子培養(yǎng)試驗(yàn)研究表明單核末期是最佳時(shí)間[17]。目前，在新疆還沒有辣椒小孢子培養(yǎng)研究的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)新疆及國(guó)外引進(jìn)的辣椒品種花粉細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，探討不同辣椒品種蕾長(zhǎng)和其小孢子單核靠邊期比例之間的相關(guān)性，以期為辣椒游離小孢子培養(yǎng)選取花蕾提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試?yán)苯菲贩N有Pimiento、Chile Guajillo、HXR-WU-02及新疆農(nóng)家品種豬大腸。Pimiento，品種類型為櫻桃椒，來源墨西哥；Chile Guajillo，品種類型為線椒，來源墨西哥；HXR-WU-02，品種類型為線椒，來源荷蘭；豬大腸，品種類型為長(zhǎng)角椒，來源天地和種業(yè)（新疆）。

1.2 方 法

1.2.1 植株培養(yǎng) 2014年5月1日，在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)樓組培實(shí)驗(yàn)室對(duì)辣椒種子進(jìn)行溫湯浸種，然后催芽。5月5日在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地的簡(jiǎn)易大棚內(nèi)將辣椒播種于穴盤，6月11日定植移栽在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地，其后采取正常的田間管理。

1.2.2 不同長(zhǎng)度區(qū)組的花蕾對(duì)應(yīng)花粉細(xì)胞發(fā)育時(shí)期的觀察 植株初花期，在上午8：00到10：00時(shí)摘取不同長(zhǎng)度的花蕾45～60個(gè)納入自封袋，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。然后使用游標(biāo)卡尺量取花蕾長(zhǎng)度，按花蕾不同長(zhǎng)度分為5組，分別是2.00～2.99 mm、3.00～3.99 mm、4.00～4.49 mm、4.50～4.99 mm、5.0～5.99 mm。每一組分別選擇10～20個(gè)花蕾，先用2%的NaClO沖洗10 min，再用無菌水清洗3～4次。而后旋轉(zhuǎn)注射器活塞（必須用沒有黑色橡膠的一端）壓榨花蕾使其完全破碎，添加2 mL NLN培養(yǎng)基提取花粉小孢子，在冷凍離心機(jī)離心3次（150 s），轉(zhuǎn)速為6 000 r·min-1。將上清液倒掉，留下沉淀物。再用移液槍吸10 μL的DAPI染色液加入到沉淀里，放置黑暗處15 min后制備切片，而后將切片置于冰箱且在4 ℃條件下保存，且第2天將切片放置在熒光顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)整理和分析

使用2003 Excel表格整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒花粉小孢子各發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特征

熒光顯微鏡鏡檢觀察結(jié)果表明（如圖1），此4份辣椒品種Pimiento、HXR-WU-02、豬大腸及Chile Guajillo的花蕾長(zhǎng)在2.00～2.99 mm時(shí)，花蕾中多數(shù)的花粉小孢子在單核早、中期，而少數(shù)的在四分體時(shí)期。四分體時(shí)期是花粉母細(xì)胞經(jīng)由減數(shù)分裂產(chǎn)生的被一層厚的胼胝質(zhì)包圍并呈對(duì)稱形排列在同一平面的四分小孢子，即四分體。單核早、中期的花粉小孢子體積變大，形成明顯的細(xì)胞壁，居于小孢子的中心含有一個(gè)較大的細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中無顯著可見的液泡?；ɡ匍L(zhǎng)為3.00～3.99 mm、4.00～4.49 mm時(shí)，花粉細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)液泡，核從中心被擠壓到靠近細(xì)胞壁的邊緣，即單核晚期，萌發(fā)孔顯現(xiàn)。花蕾長(zhǎng)度在4.50～4.99 mm、5.00～5.99 mm時(shí)，單核靠邊期的花粉細(xì)胞體積持續(xù)增加，細(xì)胞呈正圓形，通過有絲分裂產(chǎn)生生殖核和營(yíng)養(yǎng)核，此時(shí)為雙核期，前者較大且染色較深，后者較少且染色較淺。因此，通過對(duì)不同長(zhǎng)度區(qū)組的花蕾中花粉小孢子發(fā)育各時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特征的觀察和了解，且在不對(duì)花蕾進(jìn)行染色試驗(yàn)的情況下，可快速地判別出花蕾中花粉小孢子所處的發(fā)育階段?；ǚ坌℃咦拥男螒B(tài)變?yōu)檎龍A狀，細(xì)胞核被擠壓靠近細(xì)胞壁和顯現(xiàn)萌發(fā)孔是小孢子單核靠邊期的主要識(shí)別特征。

2.2 不同品種辣椒花蕾的不同長(zhǎng)度區(qū)組與單核靠邊期小孢子比例的關(guān)系

從表1可知，不同辣椒品種不同蕾長(zhǎng)的單核靠邊期花粉小孢子比例有著顯著性差異。Pimiento、HXR-WU-02、豬大腸及Chile Guajillo此4個(gè)辣椒品種的花蕾長(zhǎng)度在4.00～4.49 mm時(shí)與其它4個(gè)長(zhǎng)度區(qū)組之間差異顯著，在該長(zhǎng)度范圍內(nèi)，4個(gè)辣椒品種的單核靠邊期的小孢子所占比例分別為62.15%，68.04%，74.4%及60.23%。HXR-WU-02該辣椒品種的花蕾長(zhǎng)度在3.00～3.99 mm與4.50～4.99 mm和3.00～3.99與5.00～5.99 mm時(shí)，花蕾中單核靠邊期小孢子比例的差異性不顯著，且所對(duì)應(yīng)的花粉小孢子的單核靠邊期比例在40%到10%之間。Chile Guajillo的花蕾長(zhǎng)度在4.50～4.99與3.00～3.99 mm時(shí)沒有顯著的差異，而對(duì)應(yīng)的花粉小孢子在單核靠邊期的比例皆在30%左右。而當(dāng)花蕾長(zhǎng)在2.00～2.99 mm時(shí)，此4個(gè)辣椒品種的比例皆為0。因此，可把蕾長(zhǎng)作為后續(xù)的辣椒小孢子培養(yǎng)試驗(yàn)研究中的采樣指標(biāo)。

3 結(jié)論與討論

（1）經(jīng)對(duì)花蕾進(jìn)行DAPI染色后和在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：花粉小孢子的發(fā)育在同一長(zhǎng)度區(qū)組的花蕾中是連續(xù)性的即不同步。辣椒花蕾長(zhǎng)在2.00～2.99 mm、3.00～3.99 mm時(shí)，主要是單核早、中期花粉小孢子。但蕾長(zhǎng)在2.00～2.99 mm時(shí)少數(shù)的小孢子處于四分體時(shí)期，而在3.00～3.99 mm時(shí)少量的花粉小孢子處于單核靠邊期?；ɡ匍L(zhǎng)為4.00～4.49 mm時(shí)，處在單核晚期小孢子的比例超過60%，另外此時(shí)也尚有雙核花粉小孢子存在。當(dāng)蕾長(zhǎng)在4.50～5.99 mm時(shí)雙核花粉小孢子占絕大多數(shù)，單核晚期小孢子出現(xiàn)較少。

（2）本試驗(yàn)采用的DAPI染色法相較于張祖姣等[12]和楊智博等[18]的石蠟切片法、張菊平等[16]和張?zhí)煜璧萚19]的醋酸洋紅染色法或PHCH染色法而言，具有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、易于觀察等優(yōu)點(diǎn)。以往的研究發(fā)現(xiàn)：小孢子的發(fā)育階段與辣椒花蕾的外部形態(tài)密切相關(guān)[18-20]。但是，本試驗(yàn)主要觀察不同品種類型和長(zhǎng)度的辣椒花蕾中花粉小孢子發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特性，研究辣椒花蕾長(zhǎng)度與其花粉細(xì)胞單核靠邊期所占比例之間存在的關(guān)系。

（3）辣椒蕾長(zhǎng)與其單核晚期花粉小孢子比例之間的關(guān)系，可以視為小孢子是否適合誘導(dǎo)單倍體培養(yǎng)的指標(biāo)。若按照辣椒花蕾的長(zhǎng)度取材并應(yīng)用于后期的游離小孢子培養(yǎng)研究中會(huì)很方便、快捷，且降低污染。本次試驗(yàn)的結(jié)果是，4個(gè)供試?yán)苯菲贩NPimiento、HXR-WU-02、豬大腸及Chile Guajillo的蕾長(zhǎng)為4.00～4.49 mm且花蕾發(fā)育正常，其小孢子的單核靠邊期比例分別為62.15%，68.04%，74.4%及60.23%。

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