韓 雪，熊燕妮，江瑞晶，曾 辰，陳禪友（江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

一株豇豆花苞內(nèi)生不動(dòng)桿菌的分離鑒定

韓 雪，熊燕妮，江瑞晶，曾 辰，陳禪友*
（江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

從武漢豇豆種植基地的豇豆花苞中篩選出花內(nèi)生菌（命名為wjhb），其在豇豆花苞中大量存在，在花瓣中為優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌。染色鑒定為革蘭陰性桿菌，可以在16～43℃生長(zhǎng)。生化試驗(yàn)顯示，該菌生化特征符合不動(dòng)桿菌特征；16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，經(jīng)軟件分析其16SrDNA序列與不動(dòng)桿菌序列相似度達(dá)98%。本試驗(yàn)分離得到的內(nèi)生不動(dòng)桿菌（wjhb），有望成為豇豆基因工程生防菌的理想宿主菌株。

豇豆花苞；內(nèi)生菌；不動(dòng)桿菌；革蘭染色；序列分析

豇豆（Vigna unguiculataL.），一年生蝶形花科草本植物，是豆科豇豆屬植物。我國(guó)各地普遍栽培，其嫩莢和種子供食用，含豐富維生素B、C和植物蛋白質(zhì)，深受廣大消費(fèi)者喜愛，其主要栽培在夏秋兩季，田間往往蟲害（如蚜蟲，豆螟等）非常嚴(yán)重，對(duì)豇豆高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培影響很大，生產(chǎn)者一般通過(guò)噴施農(nóng)藥來(lái)防治豇豆蟲害，導(dǎo)致產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)，是豇豆食品安全生產(chǎn)中的主要障礙。為解決豇豆抗蟲問(wèn)題，擬從內(nèi)生菌入手，探索提高豇豆抗蟲性的技術(shù)方法。

內(nèi)生菌是從表面消毒的植物組織中分離得到或從植物內(nèi)部獲得的，能夠定殖在健康植物細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)，不使植物的表型特征和功能發(fā)生改變的微生物。植物內(nèi)生菌由于可在植物體內(nèi)定殖，菌體受植物體保護(hù)，不易受外界條件影響，可長(zhǎng)期發(fā)揮生物學(xué)作用［1-2］；同時(shí)，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植株與內(nèi)生菌形成了一種共生或互生的關(guān)系，內(nèi)生菌從宿主植物中獲得養(yǎng)分和穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境［3-4］；因此，利用內(nèi)生菌作為載體，制備基因工程益生菌和基因工程生防菌已經(jīng)成為內(nèi)生菌及生物防治的研究熱點(diǎn)［5-6］。

目前，豇豆預(yù)防蟲害的原則是治花不治莢，因此對(duì)于豇豆花的蟲害防治是豇豆蟲害防治的重點(diǎn)，本試驗(yàn)從武漢豇豆種植基地的豇豆花苞中篩選出內(nèi)生不動(dòng)桿菌（wjhb），在豇豆花苞中大量存在，在豇豆花瓣中也為優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌，經(jīng)染色鑒定為革蘭陰性桿菌，可以在16～43℃下生長(zhǎng)，16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析結(jié)果為不動(dòng)桿菌，不分解淀粉，可分解油脂，在豆莢、種子、根、莖、葉中未分離出此菌。該內(nèi)生不動(dòng)桿菌有望成為豇豆基因工程生防菌宿主菌株。

1 材料與方法

1.1 表面消毒處理

用燒杯取豇豆花沖洗表面污垢，移至無(wú)菌瓶中。0.1%升汞振蕩浸泡花3～4 min，無(wú)菌水沖洗3～4遍，再75%酒精振蕩浸泡花3～4 min，無(wú)菌水沖洗5～6遍。

1.2 內(nèi)生菌的分離

將表面消毒處理后的花移至無(wú)菌研缽中，剪碎，加入生理鹽水和石英砂研磨，2 000 r/min離心10 min，取上清涂布于NA培養(yǎng)基平板，取等量最后一次水洗的無(wú)菌水作為空白對(duì)照。30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)得到的單菌株做平板劃線，分離提純并保種。

1.3 革蘭染色

菌液至載玻片烘干固定，結(jié)晶紫染色1 min，革蘭碘液進(jìn)行媒染1 min，酒精脫色，沖凈，番紅復(fù)染2 min，洗凈，油鏡鏡檢。

1.4 細(xì)菌基因組抽提

細(xì)菌用沸水煮10 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清。

1.5 16SrDNA擴(kuò)增

采用16SrDNA通用引物為27F，5′—GAGTTTGATCCTGGCTCAG—3′和1492R，5′—ACGGCTACCTTGTTACGACTT—3′。

1.6 聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)

利用特異性檢測(cè)引物，對(duì)提取的基因組進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)參數(shù)為:94℃5 min，按94℃30 s，58℃45 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃10 min延伸。

1.7 序列分析

16SrDNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)Blast在Genebank中搜索相似序列，并通過(guò)多序列對(duì)比軟件Clustal分析，得到該菌種屬情況。

1.8 生長(zhǎng)溫度范圍

菌落涂于LB固體平板，于不同溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況，記錄菌落生長(zhǎng)情況。

1.9 糖/酸發(fā)酵試驗(yàn)

分別接種糖/酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)16 h，另外保留1支不接種的培養(yǎng)基對(duì)照。

1.10 硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)

取枸椽酸鐵鹽半固體培養(yǎng)基，穿刺接種，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h觀察。

1.11 V-P試驗(yàn)

接種于葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中，置于37℃，培養(yǎng)24 h觀察，在培養(yǎng)液中加入40%KOH溶液10～20滴。再加入等量的α-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃恒溫箱中保溫15～30 min，觀察結(jié)果。

1.12 吲哚試驗(yàn)

接種于蛋白胨水培養(yǎng)液中，置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h觀察，觀察時(shí)，加入乙醚1 mL，充分振蕩，靜置待乙醚浮于上層時(shí)，沿管內(nèi)壁慢慢加入吲哚試劑10滴，觀察結(jié)果。

1.13 枸椽酸鹽利用試驗(yàn)

接種枸椽酸鈉斜面，置于37℃，培養(yǎng)24～48 h觀察。

1.14 淀粉水解試驗(yàn)

接種于淀粉培養(yǎng)基涂平板，置于37℃恒溫箱，培養(yǎng)16 h觀察。

1.15 油脂水解試驗(yàn)

劃線于油脂培養(yǎng)基（使用花生油）上，于37℃恒溫箱，培養(yǎng)16、24 h觀察。

2 結(jié)果

2.1 革蘭染色結(jié)果

革蘭染色后，油鏡下可以看到菌體為短桿狀（見圖1），為革蘭陰性菌。

圖1 革蘭染色結(jié)果Fig.1 Result of Gram staining

2.2 16SrDNA測(cè)序結(jié)果

16SrDNA測(cè)序結(jié)果表明，該內(nèi)生菌為不動(dòng)桿菌，從所構(gòu)建的16SrDNA基因進(jìn)化樹上來(lái)看，其與不動(dòng)桿菌16SrDNA相似度達(dá)到98%，屬于不動(dòng)桿菌。

2.3 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

由生化試驗(yàn)結(jié)果（見表1）可知，分離得到的內(nèi)生不動(dòng)桿菌可進(jìn)行糖發(fā)酵，不能產(chǎn)H2S，V-P試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)結(jié)果為陰性，可利用枸椽酸和分解油脂，不分解淀粉。

表1 生化特性分析結(jié)果Tab.1 Results of biochemical character analysis

2.4 菌落生長(zhǎng)溫度范圍

在LB固體培養(yǎng)基中，菌體營(yíng)養(yǎng)體可在16～43℃溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)。

3 結(jié)語(yǔ)

近來(lái)，植物內(nèi)生菌研究成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)微生物研究的新熱點(diǎn)，但由于相關(guān)研究起步晚，很多植物和農(nóng)作物中內(nèi)生菌的研究還是空白，目前，并未見豇豆中內(nèi)生菌的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)分離得到一株豇豆花的內(nèi)生不動(dòng)桿菌，可以在豇豆花中進(jìn)行定殖，在各期花中屬于優(yōu)勢(shì)菌株，但在豆莢、豆、葉片和根系中沒(méi)有分離到此菌。此內(nèi)生菌生長(zhǎng)溫度范圍為16～43℃，適合武漢地區(qū)豇豆開花結(jié)莢的夏秋兩季。通過(guò)16SrDNA測(cè)序結(jié)果顯示，該內(nèi)生菌為不動(dòng)桿菌。生理生化試驗(yàn)表明，該菌可發(fā)酵糖、不產(chǎn)氣、分解枸椽酸和油脂。此外，分離得到的豇豆花內(nèi)生不動(dòng)桿菌（wjhb）可在豇豆花中定植生長(zhǎng)，但不存在豆、葉及根系中，因此，是豇豆基因工程生防菌的理想宿主菌株。

（References）

［1］ 徐玲玲，單慶紅，郭斌.植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及應(yīng)用展望［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（13）:5641-5643.

［2］ 楊威，劉蘇閔，郭堅(jiān)華.細(xì)菌定殖能力與其生物防治功能相關(guān)性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生物防治，2010，26（S1）:90-94.

［3］ BABALOLA O O.Beneficial bacteria of agricultural importance［J］.Biotechnol Lett，2010，32（11）:1559-1570.

［4］ SOLTER L F，MADDOX J V，VOSSBRINCK C R.Physiological host specificity:a model using the European corn borer，Ostrinia Nubilalis（Hübner）（Lepidoptera:Crambidae）and microsporidia of row crop and other stalk-boring hosts［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2005，90（2）:127-130.

［5］ 劉峰，蔣宇揚(yáng)，劉世英.植物內(nèi)生菌抗蟲工程研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2004，15（4）:417-420.

［6］ 陳澤斌，靳松，張永福.植物內(nèi)生菌生物防治研究進(jìn)展及存在的問(wèn)題［J］.昆明學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，36（3）:40-42.

（責(zé)任編輯:陳 曠）

Isolation of an EntophyteAcinetobactersp.from Cowpea Flowers

HAN Xue，XIONG Yanni，JIANG Ruijing，ZENG Chen，CHEN Chanyou*
（School of Life Sciences，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

The entophyte bacteria（wjhb）was isolated from the cowpea flowers in cowpea planting base in Wuhan，which was the dominant strain in the cowpea florescence.The proper temperature range for the entophyte bacteria culture was 16～43℃and the Gram staining result was negative.The biochemical experiment results showed the entophyte bacteria belonged toAcinetobactersp.and the biochemical character was up to theAcinetobactersp..The 16SrDNA sequence PCR results showed the similarity of 16SrDNA sequence withAcinetobactersp.reached 98%.The entophyteAcinetobactersp.（wjhb）in this paper is an ideal candidate of the host for cowpea engineered bio-control bacteria.

cowpea；endophytic bacteria；Acinetobactersp.；Gram staining；sequence analysis

S643.4

A

1673-0143（2015）05-0398-03

10.16389/j.cnki.cn42-1737/n.2015.05.003

2015-09-21

湖北省教育廳指導(dǎo)性項(xiàng)目（B2014080）；湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心開放基金資助項(xiàng)目（201412）；武漢市黃鶴英才項(xiàng)目

韓 雪（1979—），女，副教授，博士，研究方向：微生物學(xué)。

陳禪友（1963—），男，教授，博士，研究方向：植物遺傳學(xué)。E-mail：ccy@jhun.edu.cn