吳 華，高志鵬，陳 高，宋 倫，陳禪友*（1.江漢大學 生命科學學院，湖北 武漢 430056；2.湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056；3.北京工商大學 理工學院化妝品系，北京 100048）

·豆類植物研究·

不同消毒處理對豇豆種子無菌培養(yǎng)的效應

吳 華1，3，高志鵬1，2，陳 高1，2，宋 倫1，2，陳禪友*1，2
（1.江漢大學 生命科學學院，湖北 武漢 430056；2.湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056；3.北京工商大學 理工學院化妝品系，北京 100048）

比較了不同消毒劑和處理方式對“龍紋”豇豆種子的消毒效果及無菌生長的效應。結(jié)果表明：先消毒再浸種的效果較好，其中0.1%的升汞消毒8 min的效果最佳（污染率為11%，萌發(fā)率為77%）。消毒后將種子接種在附加有300 mg/L頭孢噻肟鈉的培養(yǎng)基中，能有效減少培養(yǎng)過程中的污染率（7%），同時不影響無菌幼苗的生長，10 d后85%無菌苗株高可達3 cm以上。

豇豆；消毒劑；升汞；次氯酸鈉；頭孢噻肟鈉；無菌培養(yǎng)

豆類植物研究

主持人開欄寄語：豆類及其制品是人類食物蛋白的良好來源，是人類三大食用作物之一，具有非常高的營養(yǎng)價值和生理功能特性。食用豆類（food legumes）是以收獲籽粒兼作蔬菜供人類食用的豆科作物之統(tǒng)稱，均屬豆科（Leguminesae）蝶形花亞科（Papilionoideae）。我國是豆類植物的生產(chǎn)大國和消費大國，遺傳資源豐富，栽培歷史悠久，是一些豆類植物的起源或次生起源中心，栽培面積大。據(jù)不完全統(tǒng)計，近年年生產(chǎn)面積超過670萬hm2，產(chǎn)品市場需求旺盛。除鮮食外，還可作干制、腌制等加工，制作芽菜，作為食品（如豆奶、納豆等）、油料、藥物等加工原料。

由于種種原因，與主要農(nóng)作物相比，食用豆類研究相對滯后，不能適應社會經(jīng)濟發(fā)展和人民生活水平提高的需要，也未能充分理解和發(fā)掘豆類植物資源。目前，新選育品種性狀的多元化需求與遺傳背景狹窄之間的矛盾有待化解；豆類植物綠色生產(chǎn)中的食品安全隱患亟需消除；獨特的培肥地力生態(tài)功能期待發(fā)揮；拉長產(chǎn)業(yè)鏈的豆制品和深度加工產(chǎn)品的潛能需要釋放。2011年，研究人員依托江漢大學組建了湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，2015年又組建了湖北省食用豆類植物自然科技資源中心和豆類植物研究與利用創(chuàng)新團隊，開展了食用豆類植物種質(zhì)資源的收集、整理、鑒定、保存等基礎(chǔ)性工作和遺傳改良、優(yōu)質(zhì)高效栽培、培肥地力生態(tài)應用、產(chǎn)品保鮮加工與質(zhì)量安全檢測等研發(fā)工作。目前的主要任務是：建設省級食用豆類植物資源中心，構(gòu)建種質(zhì)資源庫和數(shù)據(jù)庫共享平臺；以現(xiàn)代生物技術(shù)為手段，著力研究解決豆類植物安全生產(chǎn)與資源有效利用中的重大關(guān)鍵性、基礎(chǔ)性和共性技術(shù)問題，如遺傳多樣性保護、優(yōu)異基因挖掘、抗蟲豇豆和脫毒菜豆等種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育；發(fā)展豆類植物規(guī)?；鷳B(tài)應用，研發(fā)高品質(zhì)豆類營養(yǎng)食品、生物制劑和植物源生物農(nóng)藥等。

為進一步推動豆類植物研究與利用工作，湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心、湖北省食用豆類植物自然科技資源中心與《江漢大學學報（自然科學版）》聯(lián)袂開設“豆類植物研究”專欄，以展示最新研究進展，促進學術(shù)交流，彰顯學科特色。該專欄將追蹤科技前沿、關(guān)注民生熱點、聚焦產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵、體現(xiàn)學科交叉、促進學術(shù)進步、激勵創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)。真誠期待國內(nèi)外名家與新秀關(guān)注該欄目，協(xié)力構(gòu)建學術(shù)探討和爭鳴之高地。

欄目主持人：陳禪友

豇豆（Vigna unguiculata）是豆科豇豆屬的耐熱性蔬菜，是7～9月國內(nèi)蔬菜淡季上市的主要蔬菜之一，受到人們的青睞。豇豆極易受到病蟲害的侵襲，生長過程中的病害多由種子自身攜帶的病菌引起。生產(chǎn)者為控制病蟲害會過多地使用農(nóng)藥，既造成污染環(huán)境又導致農(nóng)藥殘留超標等食品安全問題，嚴重制約了豇豆的產(chǎn)量與品質(zhì)。

利用組織培養(yǎng)來構(gòu)建豇豆高效再生體系，可以消除栽培季節(jié)、地域性等自然條件的影響，培育大量無病蟲害的優(yōu)良無菌苗，從初期減少病蟲害的侵染概率，為高品質(zhì)、高產(chǎn)量、低農(nóng)藥殘留的豇豆生產(chǎn)提供可能性。而種子是主要和常用的外植體之一，外植體的選擇要以污染少易啟動培養(yǎng)為原則［1］。如何有效對其進行消毒處理，使得種子帶菌量減少，獲得大量具有良好生長狀態(tài)的無菌苗是豇豆組織培養(yǎng)的首要環(huán)節(jié)。本研究旨在探討不同消毒劑對豇豆種子無菌培養(yǎng)時消毒效果及萌發(fā)的影響，以期找到高效且穩(wěn)定的消毒方法，為豇豆無菌苗的培育提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以“龍紋”豇豆的種子為材料，研究不同消毒劑及消毒時間對豇豆種子無菌培養(yǎng)時消毒的影響。本試驗中所用的“龍紋”豇豆種子，均采自湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心武漢市永安種植基地。

種子的具體收集方法如下:將同一批成熟豆莢收集后，在晾曬場中干燥，去除豆莢及雜質(zhì)，將種子繼續(xù)曬干后密封保存在4℃的冷庫內(nèi)待用。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

含有1/2大量元素強度的Murashige and Skoog培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基）被用作為本試驗的基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中添加了3%（w/v）蔗糖（國藥）和0.9%（w/v）瓊脂，在滅菌前將pH調(diào)至5.8，而后在121℃和1.1 kg/cm2的條件下滅菌20 min。滅菌完后，在培養(yǎng)基降溫至60℃未冷卻前，添加已過濾滅菌的抗生素頭孢噻肟鈉（cefotaxime sodium，Cef）0～500 mg/L，并分裝到直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中。

所有的培養(yǎng)物都置于可調(diào)控的人工環(huán)境中，其中溫度保持在（25±2）℃，光照強度為25 ul/（m2·s），光照周期為16 h L/8 h D。

1.3 試驗方法

1.3.1 消毒處理組合的試驗設計與方法 將無破損的種子放在玻璃培養(yǎng)瓶中，表面用單層紗布封口，在流水下沖洗0.5 h，然后將種子浸泡于溫水中數(shù)小時，待種子完全吸脹。而后將吸脹的種子與干種子，在超凈工作臺上進行消毒滅菌。具體操作流程如下:分別用0.1%升汞（HgCl2）或5%次氯酸鈉（NaClO）處理種子8 min或者15 min，處理時充分振蕩以增強殺菌效果。處理時間足夠之后再用無菌水沖洗3次，每次8 min，以徹底地去除殘留的消毒劑。接種前，將消毒完畢的種子置于無菌濾紙上吸干多余水分。按照每處理設3次重復，每重復5個培養(yǎng)瓶，每瓶接種5粒種子。

1.3.2 消毒后豇豆種子無菌培養(yǎng)的試驗設計與方法 用上步試驗中適宜的消毒方式處理后豇豆籽粒分別接種到含有頭孢噻肟鈉0、300、500 mg/L的1/2 MS培養(yǎng)基中，每處理設3次重復，每重復5個培養(yǎng)瓶，每瓶接種5粒種子。

1.4 統(tǒng)計學處理

接種5 d后分別對污染及萌發(fā)情況進行統(tǒng)計，并計算發(fā)芽勢及發(fā)芽率。10 d后對萌發(fā)生長的幼苗的生長情況進行統(tǒng)計和比較，以均值和標準差的形式表現(xiàn)。

污染率=（污染數(shù)/接種數(shù)）×100%；

萌發(fā)率（GE）=（5 d時的出苗數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%；

10 d后高于3 cm的苗數(shù)（GP）=（10 d時的出苗數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑、消毒方式和消毒時間對豇豆種子消毒效果的影響

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，“龍紋”豇豆種子浸種吸脹后，浸泡液較為渾濁。無論是干種子或吸脹的種子經(jīng)NaClO消毒處理后，種皮褪色較為嚴重，消毒廢液及清洗液均較HgCl2消毒處理的渾濁。且經(jīng)HgCl2處理的干種子在消毒處理后的浸泡吸脹的過程中，其浸泡液渾濁度也較輕。

從5 d后的消毒效果來看，相同消毒處理條件下，先消毒后浸泡的種子消毒效果較好，污染率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且先消毒后浸泡種子的萌發(fā)率較先浸泡后消毒的種子高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（見表1）。在相同的預處理及消毒時間條件下，HgCl2的消毒效果及萌發(fā)率均較NaClO的效果好，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。綜合分析比較顯示:“龍紋”豇豆種子經(jīng)HgCl2消毒8 min再浸泡的消毒及萌發(fā)效果最佳，污染率為11%，萌發(fā)率為77%。

表1 不同的消毒劑和消毒時間對豇豆種子無菌培養(yǎng)消毒效果的影響Tab.1 Effects of different sterilization time and methods on cowpeas′seeds germination and development（±s）

表1 不同的消毒劑和消毒時間對豇豆種子無菌培養(yǎng)消毒效果的影響Tab.1 Effects of different sterilization time and methods on cowpeas′seeds germination and development（±s）

注：大寫字母不同表示差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），小寫字母不同表示差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

處理先消毒后浸泡先浸泡后消毒消毒劑NaClO HgCl2NaClO HgCl2消毒時間/min 8 15 8 15 8 15 8 15 5 d污染率/% 67±0.53Bb50±1.15Cc11±0.58Ee5±0.58Ff78±2.08Aa65±1.53Bb17±1.73Dd10±0.58EFe5 d萌發(fā)率/% 22±1.73Ef35±1.15Dd77±1.00Aa43±1.00Cc18±0.00EFg16±1.15Fg56±1.53Bb30±1.53De

2.2 不同濃度頭孢對消毒后豇豆種子的污染率和生長發(fā)育的影響

培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，即使消毒效果在第5天最好的處理，在第10天后污染率也明顯增高約20%。為了避免污染率上升，將“龍紋”豇豆種子經(jīng)HgCl2消毒8 min再浸泡后，接種在附加有不同濃度Cef的培養(yǎng)基中。接種10 d后的結(jié)果表明:300 mg/L和500 mg/L Cef抑菌效果顯著，但兩者間差異無統(tǒng)計學意義（見表2）。Cef會使種子的萌發(fā)時期延遲1～2 d，與對照相比，幼苗下胚軸在500 mg/L的Cef條件下明顯縮短增粗，上胚軸短小，葉片較大。而300 mg/L的Cef對幼苗的形態(tài)影響不明顯。因此，培養(yǎng)基中添加300 mg/L Cef效果最佳。

表2 10 d后不同濃度頭孢噻肟鈉對接種的豇豆種子污染率和生長的影響Tab.2 Effects of different cefphalo concentration on cowpea seeds′contamination rate and growth （±s）

表2 10 d后不同濃度頭孢噻肟鈉對接種的豇豆種子污染率和生長的影響Tab.2 Effects of different cefphalo concentration on cowpea seeds′contamination rate and growth （±s）

注：大寫字母不同表示差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），小寫字母不同表示差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

頭孢噻肟鈉/（mg·L-1）0 300 500污染率/% 37±2.0Bb7±1.0Aa5±2.1Aa3 cm以上植株/% 58±2.0Cc85±3.6Aa74±2.0Bb

由此可見:豇豆種子采用0.1%HgCl2消毒8 min后，再接種到含有300 mg/LCef的1/2 MS培養(yǎng)基中，可以在保持較好長勢的同時獲得較低的污染率。

3 討論

浸種是加速種子吸脹，促進種子發(fā)芽的常用方法［2］。浸種不僅能改善種皮的透水、透氣性，還可以去除抑制物，增強種子內(nèi)酶的活性，使胚的呼吸作用增強，提高種子萌發(fā)率和一致性［3-4］。然而，種子吸脹的同時，也會導致內(nèi)含物外滲，隨著浸種時間的延長，豇豆種子中的電解質(zhì)、游離氨基酸、蛋白質(zhì)、可溶性糖外滲嚴重，導致幼苗弱小，營養(yǎng)不良［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，“龍紋”豇豆種子消毒前浸泡，浸泡液及消毒清洗液都較消毒后浸泡的渾濁，且萌發(fā)率較低。這可能是浸種過程中內(nèi)含物滲出較多，且前期的浸泡加強了種皮的透水性，種子活化，消毒劑更易深入種子內(nèi)部，對種子造成了一定的傷害或是消毒劑殘留較難去除，最終影響了種子的正常萌發(fā)。

次氯酸鈉和升汞是組織培養(yǎng)常用的兩種消毒劑［6］。杜雪玲等［1］發(fā)現(xiàn)0.1%升汞對土沉香種子的消毒效果較次氯酸鈉好，后期培養(yǎng)愈傷誘導率高、污染率低。劉明稀等［7］發(fā)現(xiàn)假儉草種子消毒處理時，次氯酸鈉消毒效果比升汞好，更利于種子的萌發(fā)和幼苗的生長。次氯酸鹽是通過次氯酸根離子的強氧化性進行消毒，且見光分解形成氯氣，滲透性較強［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，“龍紋”豇豆種子在次氯酸鈉的處理中，不僅種皮脫色嚴重，且種子滲出物較多，這主要與次氯酸鈉的強氧化性有關(guān)。升汞是利用重金屬離子與細菌表面蛋白接觸使其變性來進行消毒［9］。本試驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)升汞消毒的“龍紋”豇豆，種皮脫色程度較輕，種子內(nèi)含物滲出較少，且污染率低、萌發(fā)率高、消毒效果較好，這與杜雪玲等［1］的研究結(jié)果一致。

Cef是一種廣譜性的抗生素，經(jīng)常用于農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因操作中，抑制細菌的生長［10］。張松等［11］研究表明Cef的濃度超過100 mg/L就能夠?qū)Υ蟀撞烁脱康姆只斐捎绊?。王麗等?2］研究表明Cef的濃度在300 mg/L以下時能夠讓煙草葉片分化率小幅下降，大于400 mg/L時葉片分化率進一步下降。青霉素與Cef均屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，袁華玲［13］發(fā)現(xiàn)青霉素能夠促進豇豆下胚軸的生長，同時使得下胚軸增粗。本研究中500 mg/L的Cef對豇豆幼苗的生長發(fā)育有抑制作用，且下胚軸增粗，而300 mg/L的Cef對試驗中豇豆幼苗的生長無明顯抑制作用，但同樣使得下胚軸明顯增粗。由此可見，不同植物對于抗生素的敏感度存在差異［14］。

（References）

［1］ 杜雪玲，張振霞，余如剛，等.植物組織培養(yǎng)中的污染成因及其預防［J］.草業(yè)科學，2005，22（1）:24-27.

［2］ HELPLER P K，WAYNE R.Calcium and plant development［J］.Ann Rev Plant Physiol，1985，36（4）:397-439.

［3］ 戎聰敏.不同條件下藥劑浸種對油菜發(fā)芽率及幼苗長勢的影響［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學，2013.

［4］ 譚玲玲，胡正海.不同浸種處理對桔梗種子萌發(fā)和幼苗生長的影響［J］.中草藥，2013（4）:468-472.

［5］ 傅家瑞.種子生理［M］.北京:科學出版社，1985.

［6］ 胡凱，張立軍，白雪梅，等.植物組織培養(yǎng)污染原因分析及外植體的消毒［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35（3）:680-681.

［7］ 劉明稀，郭振飛.不同消毒方式對假儉草種子愈傷誘導的影響［J］.草地學報，2012，20（2）:383-388.

［8］ 唐琳，劉建國，馬欣榮，等.兩種滅菌方法對番茄種子滅菌效果的評價［J］.種子，2008，27（9）:17-18.

［9］ 汪騰越，周再知，裘珍飛，等.土沉香組織培養(yǎng)外植體消毒方法的研究［J］.中南林業(yè)科技大學學報，2012，32（3）:44-48.

［10］康杰芳，王喆之.頭孢霉素類抗生素在轉(zhuǎn)基因煙草中作用的初步研究［J］.西北植物學報，2003，23（1）:60-63.

［11］張松，溫孚江，朱常香，等.抗生素對大白菜組織培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生的影響［J］.山東農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版，2000，31（4）:385-388.

［12］王麗，張俊蓮，王蒂，等.抗生素對根癌農(nóng)桿菌的抑菌效果及對煙草葉片分化的影響［J］.中國煙草學報，2006，12（1）: 32-37.

［13］袁華玲.青霉素對豇豆種子萌發(fā)及下胚軸生長的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2003，30（4）:554-555.

［14］茆永萍，戴鈴鶯，陳青建，等.不同抗生素對矮牽牛葉片培養(yǎng)的敏感性試驗［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（33）:16096-16098.

（責任編輯:陳 曠）

Effects of Different Disinfectant on Cowpea Seeds′Sterilization Culture

WU Hua1，3，GAO Zhipeng1，2，CHEN Gao1，2，SONG Lun1，2，CHEN Chanyou*1，2
（1.School of Life Sciences，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China；2.Hubei Province Engineering Research Center for Legume Plants，Wuhan 430056，Hubei，China；3.Cosmetics Department，School of Science，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

The effects of different seed disinfection methods on Longwen cultivar cowpea seeds were investigated.Optimum results were achieved by surface sterilizing the seeds with 0.1%mercury bichloride solution for 8 minutes（contamination rate 11%，germination rate 77%）.The contamination rate can be efficiently decreased by adding 300 mg/L cefotaxime sodium to the medium after surface sterilization（7%）.This method does not affect the normal growth of plants，85%of plants reached the height of 3 cm after 10 days.

cowpea；disinfectant；mercury bichloride；sodium hypochlorite；cefotaxime sodium；aseptic culture

S643.4

A

1673-0143（2015）05-0389-04

10.16389/j.cnki.cn42-1737/n.2015.05.001

2015-06-01

江漢大學博士科研啟動基金資助項目（2012025）

吳 華（1978—），女，副研究員，博士，研究方向：園藝植物種質(zhì)資源創(chuàng)新及利用。

陳禪友（1963—），男，教授，博士，研究方向：植物遺傳學。E-mail：ccy@jhun.edu.cn