萬 君，李余星，鄭衛(wèi)紅（三峽大學醫(yī)學院國家中藥藥理科研三級實驗室，湖北 宜昌 443002）

γ-分泌酶的空間結構及調節(jié)劑的研究進展

萬 君，李余星，鄭衛(wèi)紅
（三峽大學醫(yī)學院國家中藥藥理科研三級實驗室，湖北 宜昌 443002）

γ-分泌酶是與阿爾茨海默病相關的Ⅰ型跨膜蛋白酶。它包括早老素、早老素增強子2、前咽缺陷蛋白1和呆蛋白（nicastrin）4個亞基。最近研究利用超低溫電子顯微鏡在高分辨率的條件下首次揭示了人源γ-分泌酶“馬蹄形”的三維空間結構以及各亞基的排列順序，有助于更深入地認識該酶的調控通路及作用機制。此外，包括非甾體類抗炎藥等在內的γ-分泌酶調節(jié)劑在體外實驗中被證實能抑制γ-分泌酶的活性并選擇性地降低β淀粉樣蛋白片段42的水平，為阿爾茨海默病的防治提供了有效途徑，具有廣闊的開發(fā)前景，成為近年來的研究熱點。本文就γ-分泌酶各亞基調控通路、人源γ-分泌酶的精細三維空間結構以及γ-分泌酶的調節(jié)劑進行綜述。

γ-分泌酶；阿爾茨海默??；蛋白質結構，三級；信號傳導；γ-分泌酶調節(jié)劑

阿爾茨海默?。ˋlzheime disease，AD）又稱老年性癡呆癥，是一種常見的與年齡密切相關的神經退行性疾?。?］。越來越多的研究證明，長時程AD病理進程還會引發(fā)患者整體慢性系統(tǒng)性病變，如造成腦組織功能代謝障礙、引起外周血液一些生理生化指標異常、緩慢干擾機體各組織器官自穩(wěn)態(tài)［2］。盡管少數的AD患者呈現出以β淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）和早老素（presenilin，PS）（包括PS1和PS2）突變?yōu)樘攸c的家族遺傳性［3］，但大多數AD患者的發(fā)病機制尚不十分清楚。在關于AD發(fā)病機制的眾多假說中，β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）級聯學說（Aβ假說）是研究較為深入和成熟，并被廣泛認可的一種假說。與之相關的2種分泌酶分別為β-分泌酶和γ-分泌酶。它們分別參與了APP的代謝，使其水解產生大量的Aβ多肽并在大腦中沉積，產生神經毒性，從而導致以記憶力及認知功能降低為臨床表現的AD的產生。其中，γ-分泌酶作為調控AD的關鍵酶，其主要的三維結構、調控通路以及調節(jié)劑的研究進展尤其成為AD發(fā)病機制研究中的重點。

1 阿爾茨海默病與γ -分泌酶的關系

1.1 Aβ 假說

目前，與AD發(fā)病機制有關的假說有很多種，包括Aβ假說、Tau蛋白病因假說、氧自由基損傷假說、膽堿能假說、鈣離子假說以及興奮性氨基酸毒性假說等［4］。盡管AD的發(fā)病機制尚未完全闡明，但長期以來，經典的Aβ假說一直引起人們的極大關注并處于主導地位。該假說認為，由中樞神經系統(tǒng)和外周神經系統(tǒng)的多種細胞產生的Aβ，其清除速率小于生成速率，使其在大腦特定區(qū)域內大量沉積，并產生有毒斑塊，從而引起神經元死亡，進而導致AD的發(fā)生。Aβ主要還包括Aβ40和Aβ422種亞型。其中Aβ40約占Aβ總量的90%，而Aβ42僅占10%。但后者有著更強的神經毒性和疏水性，且更易在大腦中積聚。在正常生理條件下，Aβ40和Aβ42保持著動態(tài)平衡，低濃度的Aβ單體可增強記憶力和突觸的可塑性［5］，發(fā)揮著正常的生理功能。然而，在病理條件下，動態(tài)平衡被打破，Aβ42生成量增多并大量積聚，形成“老年斑”，產生神經毒性作用。值得注意的是，即使體內Aβ總量降低，Aβ42的量也降低，但Aβ42/Aβ40的比值升高時，仍然可導致Aβ的沉積，對腦神經元產生毒害作用并使其損傷，這是目前公認的導致AD發(fā)生、發(fā)展的始因和共同途徑。由此可見，Aβ42可能更具致病力，在AD的致病過程中發(fā)揮著更為關鍵的作用。

1.2 γ -分泌酶在Aβ42產生中發(fā)揮剪切作用

Aβ42是由Ⅰ型跨膜蛋白APP［6］經過β-分泌酶和γ-分泌酶水解產生的。起初，APP經過β-分泌酶剪切，產生一個較大的可溶性的APPβ片段，并在細胞膜上留下由99個氨基酸殘基組成的片段稱為C99。C99作為γ-分泌酶的底物被其識別后再由其催化亞基剪切，最終產生Aβ42（圖1）。因此，γ-分泌酶的剪切作用是Aβ42生成的最終環(huán)節(jié)，該酶復合物的蛋白水解活性高低與AD的發(fā)生密切相關，是研究AD發(fā)病機制與藥物治療的一個重要靶點［7］。

圖1 β 淀粉樣蛋白片段42（A Aβ42）與A Aβ40的代謝途徑.

2 γ -分泌酶的組成成分及空間結構

2.1 γ -分泌酶的重要組分及功能

γ-分泌酶復合物是一種“嵌入式”Ⅰ型跨膜蛋白酶［8］，相對分子質量約為170 ku，主要通過對底物的剪切作用發(fā)揮重要功能。其主要組成部分為PS，早老素增強子 2（presenilin enhancer-2，Pen2），前咽缺陷蛋白1（anterior pharynx-defective1，Aph-1）和呆蛋白nicastrin，NCT）4個亞基，它們排列緊密有序，其中每個亞基至少包含一個跨膜區(qū)（transmembrane segment，TM）。完整的γ-分泌酶分子量還包含了NCT亞基胞外域（extracellular domain，ECD）30～70 ku的糖基化部分［9］。PS包含9個跨膜區(qū)，是γ-分泌酶的活性中心和催化組分。Pen2含有2個跨膜區(qū)，它與PS緊密相連，便于PS第6、7跨膜區(qū)（TM6，TM7）之間的自動催化切割，產生氨基端（N-terminal fragment，NTF）和羧基端（C-terminal fragment，CTF）2個片段［10］。Aph-1是一個7次跨膜蛋白，和NCT一起，起著支撐作用，便于γ-分泌酶的裝配和轉運。NCT還包含了一個大的胞外區(qū)域，被認為起酶底物的補充作用［11］。Aph-1和NCT組成穩(wěn)定的亞復合物，然后與PS的CTF相互作用［12］。總之，γ-分泌酶的4個組分相互作用，相互影響，共同發(fā)揮著水解活性及剪切功能（見圖2）。

圖2 γ -分泌酶的組分及3種分泌酶對β 淀粉樣前體蛋白

2.2 γ -分泌酶復合物的空間結構

盡管人們對γ-分泌酶復合物功能方面的認識有一定的進步，但對其結構特征方面的認識進展卻很緩慢。進行三維空間結構的鑒定，需要獲得純度高、化學性質穩(wěn)定、并具有生物學活性的γ-分泌酶復合物。施一公等［13］分別從古細菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞中挑選出了高表達的γ-分泌酶復合物及其4個組分，并轉染到HEK293F細胞中，最終分離并得到γ-分泌酶純化酶。通過低溫電子顯微鏡單粒子分析，揭示了分辨率為4.5?的完整人源γ-分泌酶復合物三維結構（在最近的研究中，他們［14］用同樣的方法，將分辨率提高到4.32?，涵蓋了所有TM分布并揭示了這些亞基組裝的原則）。結果顯示，19個TM形成“馬蹄形”的空間結構。與整個TM密度相比，相鄰TM之間的密度卻顯得很小，說明封閉的親水基團具有不規(guī)則性。然而，至少有7個TM是按一定順序緊密相連的。為了便于討論，作者給這19個TM編了號。這些TM呈現出不同的長度，其中，2個相連的TM（TM17，TM18）有一半從細胞質中延伸到細胞膜外；2個彎曲的TM（TM6，TM7）位于“馬蹄形”的凹面，朝向中空區(qū)域。這種比較大而空的結構，看起來似乎是靜止的，可能是它綁定了一些結構元件作為酶作用物。

19個TM的分布并不均勻，因為相當多的TM （PS1及Pen2）集中在馬蹄形結構的一端（胖端），比Aph-1及NCT一端（瘦端）要多［15］。在瘦端，垂直并鑲嵌在細胞膜的TM不超過2層，而胖端至少包含3層。古細菌的兩種同源蛋白PS1和PS及信號肽酶同源蛋白（presenilin and signal peptide peptidase homologue，PSH）也呈現出3層無活性構象，并具有相對復雜膜拓撲結構的TM［16］。在跨膜區(qū)外，還有一個定義明確的較大區(qū)域，其密度遠大于細胞內γ-分泌酶的序列密度。在γ-分泌酶的4個組分中，NCT是含有大量的細胞外區(qū)域的單次跨膜蛋白，也是唯一具有一定大小ECD的結構，大部分細胞外的密度都可歸因于NCT［17］。有趣的是，NCT中的ECD直接位于TM馬蹄形的中空結構之上，并和一些TM馬蹄形兩端的胞外親水基緊密相連，對γ-分泌酶底物起識別作用［18］。

目前所觀測到的部分大約占γ-分泌酶總分子量的一半，TM容納約500個殘基，NCT中ECD含有約650個殘基。其他序列還未觀測出來，其中包括NCT中ECD糖基化殘基上30-70 ku的低聚糖，這反映了它們的游離性。在胞漿內PS1的181個殘基中，預計只有43個殘基是疏水的，占總序列的24%，不足以形成穩(wěn)定結構的核心。此外，細胞外序列Pen2（殘基1-19和78-101）也被預測為親水和游離的。這些殘基當前都缺少相應圖譜。

3 γ -分泌酶的主要調控通路及調節(jié)劑的作用

3.1 γ -分泌酶各組分的相關調控通路

3.1.1 PS相關調控通路

PS是γ-分泌酶復合物中起催化作用的組分，也是許多γ-分泌酶抑制劑或調節(jié)劑的主要作用部位。在3種輔酶因子（NCT，Aph1和Pen2）的組裝下，PS蛋白可溶解為2個部分，其中每一部分都可作為天冬氨酸鹽的活性部位［19］。PS家族的同系物，包括單獨的多肽，不需要其他蛋白質元件便能發(fā)揮蛋白水解功能，這種更為簡單的位于跨膜區(qū)的天冬氨酰蛋白酶使我們對γ-分泌酶復合物中PS功能有了更深刻的理解。在生物體內，經細胞限制因子調控，PS可裂解成NTF和CTF兩個部分。它們通過大分子相互作用而緊密相連，形成穩(wěn)定的異二聚體，并保持著生物學活性。此外，NTF和CTF各自都具有天冬酰胺鹽的保守區(qū)域，其催化γ-分泌酶的活性中心可能在這2個片段之間。

3.1.2 Pen2相關調控通路

已有的生物學研究顯示，Pen2是γ-分泌酶復合物發(fā)揮作用的最終部分，其疏水區(qū)靠近PS的C端（PS CTF），與PS共同發(fā)揮著蛋白水解活性。Pen2基因敲除小鼠的胚胎致死表現型與PS1/PS2雙基因敲除和Notch1基因敲除極為相似［20］。此外，Pen2還具有高度保守性，其總長度為101個氨基酸，其中70%的氨基酸保守，87%的氨基酸序列與所有的脊椎動物相似，甚至在人類和擬南芥植物中也有56%的相似度［21］。利用糖基化特性可以得出Pen2拓撲結構，它包含了胞外的N端和胞質的C端，涵蓋了2個TM及細胞質內的彎曲部分。在Pen2基因啟動子上含有環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）的結合位點，使Pen2能與CREB產生特異性結合，是Pen2的轉錄調控因子，對γ-分泌酶的活力以及不同比例Aβ的生成產生重要的調控作用，也是γ-分泌酶成熟并具備剪切活性的必要條件。

3.1.3 Aph-1相關調控通路

Aph-1是一種含有7個跨膜區(qū)的相對分子質量為30的蛋白，最初在內質網中生成，然后向高爾基體轉運。Aph-1包含由308個氨基酸組成的Aph-1a 和257個氨基酸組成的Aph-1b2種同源蛋白，僅Aph-1a參與了活性γ-分泌酶的形成。2種Aph-1都是γ-分泌酶復合物組裝和形成的重要支架，并能夠穩(wěn)定有活性的PS蛋白及Pen2蛋白，對γ-分泌酶的成熟和活性調節(jié)發(fā)揮著重要作用。Aph-1跨膜區(qū)2個保守的組氨酸（H171和H197）對γ-分泌酶的剪切活性以及酶與底物的有效結合發(fā)揮著重要作用［22］。Aph-1雖未直接參與γ-分泌酶的活性調控，但通過參與PS的調控，間接影響γ-分泌酶的活力，從而起到調節(jié)Aβ產生的作用。

3.1.4 NCT相關調控通路

NCT是由709個氨基酸組成的高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，主要由成纖維細胞和神經元合成，在機體內廣泛分布。NCT與PS的N端和C端緊密結合，起到了穩(wěn)定PS的作用。此外，NCT還發(fā)揮著“底物受體”的重要作用，即γ-分泌酶的底物被PS剪切之前，要先被NCT識別并特異性結合。當NCT過表達時，γ-分泌酶的活性也隨之增加，Aβ的生成也增多，反之，當NCT低表達時，γ-分泌酶的活性降低，Aβ的生成減少。說明NCT不僅與γ-分泌酶的組裝和穩(wěn)定有關，其表達水平對γ-分泌酶的活力和Aβ的產生也起到了一定的調節(jié)作用。然而，也有研究發(fā)現，僅含PS1，Aph1和Pen2亞基組成的γ-分泌酶也依然能剪切APP和Notch，說明NCT僅發(fā)揮了穩(wěn)定γ-分泌酶的作用，對底物識別并不是必須的［23］。

3.2 γ -分泌酶調節(jié)劑選擇性地降低Aβ42水平

由于Aβ的產生與AD有著重要的聯系，因而，許多研究團隊對通過抑制γ-分泌酶的活性進而使Aβ產量減少的小分子調節(jié)劑饒有興趣。它們大都作用在γ-分泌酶的催化活性中心PS上。這些調節(jié)劑無論是對AD的治療還是預防都產生著重要的作用［24］。

γ-分泌酶調節(jié)劑（γ-secretase modulator，GSM）是一類通過調節(jié)γ-分泌酶的活性改變或阻止Aβ42的產生，但不影響γ-分泌酶對其他底物特別是Notch通路作用的化合物［25］。Notch信號通路是一個大的Ⅰ型跨膜蛋白，其跨膜結構域由γ-分泌酶水解，水解后釋放到胞內的Notch片段可調節(jié)基因轉錄。Notch缺陷會導致嚴重的胚胎發(fā)育缺陷、影響成年人的中樞神經系統(tǒng)軸突重塑性和免疫系統(tǒng)細胞增殖等［26］。

與γ-分泌酶抑制劑（γ-secretase inhibitor，GSI）抑制Aβ多肽總量不同，GSM最顯著的特點是在調節(jié)γ-分泌酶的同時，并不減少Aβ多肽總量［27］。D′Avanzo等［28］也證實，γ-分泌酶能降低神經前體細胞中Aβ42的水平而不影響該細胞的分化。

此外，GSM并不會導致APP CTF的積累［29］，而是通過改變γ-分泌酶的剪切位點使Aβ42/Aβ40的比例下降，使無毒的Aβ38或Aβ37肽段含量增加。更為重要的是，與GSI相比，GSM并不影響γ-分泌酶對正常細胞的信號通路（如Notch）的剪切作用［30］，而使得GSM作為治療AD的靶向分子藥物成為可能。

目前，關于GSM如何調控γ-分泌酶對Aβ的剪切機制并不十分清楚。最近，Pozdnyakov等［31］通過實驗在分子水平表明GSM通過與γ-分泌酶上的催化亞基PS結合進而抑制其活性。

GSM通常分為3類：非甾體類抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAID）及其衍生物，不含NSAID雜環(huán)的調節(jié)劑，以及三萜烯類天然產物［32］。它們的結構相對復雜，除包含NSAID所具有的羧基外，有的還含有哌嗪、含氮雜環(huán)化合物等。

第一代GSM包括NSAID如硫化舒林酸、吲哚美辛、布洛芬以及氟比洛芬（氟聯苯丙酸）等［33］。為了更有效降低Aβ42比例，Imbimbo等［34］在第一代GSM基礎上研制出了一種名為CHF5074的小分子調節(jié)劑，并在臨床試驗中予以研究。由于這種藥物的作用是降低可溶性CD40配體（小膠質細胞活化作用的標志物）的含量，而非腦脊髓液中的Aβ42的含量，所以被認為是小膠質細胞的調節(jié)劑而非GSM的。

由于第一代GSM效能相對較弱，且滲透能力差，因此很難將這類化合物用于臨床試驗。第二代NSAID衍生物及非NSAID衍生物類GSM在體外效能以及大腦滲透能力上做了改進。使得IC50在120～348 nmol·L-1之間［35-36］。相比之下，第二代GSM顯示出較強的效能及滲透能力，近年來作為工具藥被廣泛用于臨床前實驗［37］。

不含NSAID雜環(huán)的調節(jié)劑也能降低Aβ42和Aβ40的生成，增加Aβ38和Aβ37的含量［38］。從黑升麻植物中提取物的三萜烯類天然產物，能明顯減少Aβ42和Aβ38的含量，增加Aβ39和Aβ37的含量［39］。

2011年8月，美國輝瑞公司公開揭示了一系列由哌啶乙酸改變而來的GSM，包括去除哌啶上的氮原子變成氨基環(huán)己烷結構。

2012年4月，Astellas揭示了1，3，4位被取代的氨基環(huán)己烷類似物，并進行了改造。GSM18便是其中典型的一例，它能降低Aβ42的表達水平，IC50為66 nmol·L-1。使Aβ42在小鼠體內海馬的含量達到3 mg·kg-1的占32%。

Pettersson等［40］對氟比洛芬做了改造，在其芳香環(huán)上增加更多的取代基，使得其活性更強。Rogers等［41］則報道了一種名為EVP-0015962的γ-分泌酶小分子調控劑，對Aβ42的IC50為67 nmol·L-1，并通過實驗表明其不改變APP及γ-分泌酶其他底物的量。

最近，Takeo等［42］報道了一種苯基咪唑類GSM （ST1120），該調節(jié)劑通過誘導γ-分泌酶的催化位點構象的變化而增強其蛋白水解活性。在細胞水平上能有效降低Aβ42（IC500.32 μmol·L-1）及Aβ40的含量，而增加Aβ37和Aβ39的產生。

作為APP代謝的關鍵性酶，γ-分泌酶已成為治療AD的潛在靶點之一。具有較強生物學活性的GSM已經發(fā)展成熟，并在體外AD分子模型中得到了驗證［43］。最近，Dang等［44］報道了γ-分泌酶的一種類似物PSH，與該酶一樣，PSH能識別并剪切APP C99，產生不同比例的Aβ。該研究還進一步證實PSH抑制劑通過作用于其催化位點的2個天冬氨酸殘基（Asp162和Asp220）而抑制PSH的活力，為GSM的高通量藥物篩選起到了推動作用。

GSM為AD預防和治療提供了有效的途徑，盡管其作用機制不十分清楚，但它可特異性地降低Aβ42的含量且較安全，在不久的將來可能開發(fā)為AD的治療藥物。不容忽視的是，由于GSM有著吡啶、哌啶及哌嗪等相對復雜的分子結構，且穿透血腦屏障能力差，效能低，與傳統(tǒng)的NSAID一樣，易誘發(fā)胃腸道等不良反應，使其作為臨床靶向藥物的開發(fā)面臨著巨大的挑戰(zhàn)。因此，設計合成選擇性高、藥效強、且不良反應少的γ-分泌酶小分子調節(jié)劑具有更為廣闊的開發(fā)前景。

4 結語

綜上所述，γ-分泌酶在AD治療中發(fā)揮著關鍵作用。隨著其三維空間的發(fā)現，從結構方面可進一步加強我們對其功能的理解。從構效關系探討其作用靶點，有助于為研發(fā)治療神經退行性疾病的藥物提供理論和結構基礎，為AD的預防治療以及臨床診斷提供更多的理論支撐。γ-分泌酶調控通路的研究為其調節(jié)劑的開發(fā)利用提供了重要的理論依據。新型GSM作用廣泛、種類眾多、且結構復雜，在調控AD的同時，對其他信號通路以及正常細胞并不產生影響，是一類具有良好開發(fā)和運用前景的藥物，為未來設計新的靶向分子藥物提供了新的思路也開辟了新的途徑。

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（本文編輯：喬虹）

Research progress in spatial structure and modulators of γ -secretase

WAN Jun，LI Yu-xing，ZHENG Wei-hong
（The Third-level Pharmacological Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine，Medical Science College，China Three Gorges Uniersity，Yichang 443002，China）

γ-Secretase is aⅠtransmembrane protease associated with Alzheimer disease（AD），and including four subunits：presenilin，presenilin enhancer-2，anterior-pharynx-defective1 and nicastrin. In recent studies，the ultra-high-resolution cryo-electron microscope has been used for the first time，revealing the human γ-secretase″horseshoe″，the three-dimensional structure and the arrangement of the subunits.This technique has shed light on the regulation of the enzyme pathway and mechanism.In addition，the γ-secretase modulators，including non-steroidal anti-inflammatory drugs，have been shown in vitro to inhibit γ-secretase activity and selectively reduce the level of Aβ42against AD.They have provided an effective approach，with broad prospects for development.Studies in this area have become a hot topic in recent years.Here we summarized the γ-secretase subunits regulatory pathways，human γ-secretase fine three-dimensional structure and γ-secretase modulators.

γ-secretase；Alzheimerdisease；proteinstructure，tertiary；signal transduction；γ-secretase modulator

The project supported by Natural Science Foundation of Hubei Province（2013CFC066）；Science Research and Development Project of Yichang（A13301-57）；and Graduate Research Innovation Fund Project of Three Gorges University

ZHENG Wei-hong，Tel：（0717）6397501，E-mail：zwh20110606@163.com

R962

A

1000-3002-（2015）06-0979-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.016

湖北省自然科學基金項目（2013CFC066）；宜昌市科學研究與開發(fā)項目（A13301-57）；三峽大學研究生科研創(chuàng)新基金項目

萬君，男，碩士研究生，主要從事分子藥理學研究，E-mail：wanjun2168@126.com；鄭衛(wèi)紅，女，教授，主要從事神經藥理學研究。

鄭衛(wèi)紅，女，Tel：（0717）6397501；E-mail：zwh20110606@163.com

（2015-03-19接受日期：2015-06-29）