李遇伯，局 亮，鄧皓月，張振珠，王 磊，侯治國(guó)，尹 佳，張艷軍（.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 30093；.天津市省部共建現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 30093）

基于毒性整體早期評(píng)價(jià)的“十八反”中藥配伍禁忌毒性表征的研究思路及方法

李遇伯1，局 亮1，鄧皓月1，張振珠1，王 磊1，侯治國(guó)1，尹 佳1，張艷軍2
（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193；2.天津市省部共建現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

鑒于目前中藥毒性研究主要存在的體外評(píng)價(jià)不能全面真實(shí)地反映機(jī)體狀態(tài)、傳統(tǒng)的檢查方法對(duì)毒性早期評(píng)價(jià)不敏感和毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)不能綜合判斷中藥配伍是否致毒、增毒的問(wèn)題，本文通過(guò)構(gòu)建“毒性整體早期評(píng)價(jià)篩選-驗(yàn)證及優(yōu)化-應(yīng)用”的中藥靶器官毒性早期評(píng)價(jià)的研究方法，主要包括基于代謝動(dòng)態(tài)指紋譜對(duì)靶器官毒性整體早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物的篩選、優(yōu)化和驗(yàn)證、生物學(xué)意義的闡釋以及在中藥配伍禁忌中的應(yīng)用等研究?jī)?nèi)容，試圖尋找敏感的、先于常規(guī)生化指標(biāo)變化的靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物。通過(guò)分析“十八反”配伍組合作用于整體動(dòng)物后生物標(biāo)志物的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)黑順片具有心臟毒性，半夏、瓜蔞、貝母、白蘞以及白芨均無(wú)心臟毒性，反藥配伍組合后均產(chǎn)生心臟毒性且相較黑順片單味藥毒性均有所增加，明確回答“半蔞貝蘞及攻烏”中藥配伍前后是否致毒、增毒的科學(xué)問(wèn)題。

十八反；中草藥；藥物配伍禁忌；早期毒性；代謝組學(xué)；生物標(biāo)志物

隨著社會(huì)的進(jìn)步、科學(xué)的發(fā)展，人類(lèi)對(duì)醫(yī)療健康的需求及現(xiàn)代認(rèn)知水平在不斷地提高，從而促使中藥安全性和中藥配伍禁忌日益受到廣泛關(guān)注。藥物配伍禁忌是藥物與機(jī)體相互作用本質(zhì)的具體體現(xiàn)，歷代醫(yī)者經(jīng)過(guò)不斷的研究和長(zhǎng)期的臨床用藥實(shí)踐，總結(jié)出了以“十八反”為代表的中藥配伍禁忌理論?！笆朔础庇捎谏婕暗脚R床用藥安全問(wèn)題，目前成為社會(huì)民眾與醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域高度關(guān)注的焦點(diǎn)和重大科學(xué)問(wèn)題。

中藥配伍禁忌研究進(jìn)展緩慢，主要由于以下3方面的原因：一是可供參考的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)整體資料少。這是由于中藥配伍禁忌引起的靶器官毒性損害多具有隱匿、癥狀不明顯的特點(diǎn)。此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不具有正常完整的生理功能，不能真實(shí)反映機(jī)體的正常狀態(tài)，亦不能全程評(píng)價(jià)慢性反應(yīng)。二是目前靶器官毒性的研究及檢測(cè)指標(biāo)尚待完善。如在輕度腎損害的早期或腎代償能力足夠強(qiáng)時(shí)，常規(guī)生化指標(biāo)（如血清肌酐、尿素氮）水平的變化是有限的，無(wú)法有效地反映腎損害的程度［1］；血谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶是常用來(lái)反映肝功能狀態(tài)的指標(biāo)，但由于缺乏特異性和敏感性，從而不能及時(shí)地發(fā)現(xiàn)肝損傷狀況［2］。三是現(xiàn)有的毒性評(píng)價(jià)方法難以系統(tǒng)、綜合地對(duì)中藥配伍后是否致毒、增毒進(jìn)行有效的預(yù)測(cè)。對(duì)于“十八反”中藥而言，部分中藥本身具有毒性。禁忌配伍時(shí)，存在有毒藥與有毒藥、有毒藥與無(wú)毒藥以及無(wú)毒藥與無(wú)毒藥的3種配伍形式，這可能會(huì)導(dǎo)致原有毒性的增加或新毒性的產(chǎn)生。然而，目前的藥物毒性評(píng)價(jià)方法存在一定的局限性，不能客觀、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)中藥配伍前后致毒與增毒。因此，制定一套快速、準(zhǔn)確、客觀、敏感的評(píng)價(jià)體系是當(dāng)前中藥配伍禁忌毒性表征研究亟待解決的首要問(wèn)題。

1 中藥配伍禁忌的研究現(xiàn)狀

中藥配伍禁忌是指臨床選藥組方配伍時(shí)，有些藥物不宜配合應(yīng)用，如果配伍不當(dāng)，在一定條件下會(huì)產(chǎn)生不利于治療的配伍變化（如副作用增強(qiáng)或具有潛在毒性作用），對(duì)人體造成損害［3-4］。然而，有些相反配伍從古至今在臨床上一直有所使用，如中藥“十八反”中“半蔞貝蘞及攻烏”中的“烏頭-半夏”與“烏頭-貝母”的配伍應(yīng)用。中醫(yī)古籍和現(xiàn)代臨床上確有使用“烏頭-半夏”、“烏頭-貝母”的配伍應(yīng)用，有人認(rèn)為配伍影響不大，亦有人認(rèn)為配伍會(huì)加重烏頭誘發(fā)的心臟毒性。由此可見(jiàn)，中藥毒性問(wèn)題成為制約中藥穩(wěn)定發(fā)展及臨床應(yīng)用的瓶頸，迫切需要新的方法或體系對(duì)中藥配伍禁忌的“致毒或增毒”進(jìn)行深入闡釋。

目前，中藥配伍毒性研究多采用毒理學(xué)研究方法，需要對(duì)單味藥及一系列反藥組合在不同配比條件下的毒性作用的變化規(guī)律進(jìn)行全方位考察，并且結(jié)合中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究，深入分析配伍前后藥物毒性成分與毒效作用的關(guān)系。近年來(lái)，中藥配伍禁忌研究已揭示了配伍組合后物質(zhì)變化情況反映配伍前后致毒與增毒的本質(zhì)問(wèn)題，其中主要通過(guò)對(duì)藥物相互作用促進(jìn)毒性物質(zhì)溶出釋放，產(chǎn)生新的藥物毒性成分或毒性代謝產(chǎn)物，影響或改變藥物體內(nèi)代謝過(guò)程或代謝酶的活性與調(diào)控從而致毒與增毒［5］。為此，建立基于整體動(dòng)物的早期毒性評(píng)價(jià)體系以明確回答基于臨床實(shí)踐提出的中藥配伍禁忌的科學(xué)性與合理性。

2 代謝組學(xué)在毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

代謝組學(xué)技術(shù)是隨著系統(tǒng)生物學(xué)的產(chǎn)生和發(fā)展應(yīng)運(yùn)而生的，它能在較低毒性劑量下檢測(cè)生物體內(nèi)代謝物的變化，現(xiàn)已應(yīng)用于疾病診斷與預(yù)后、毒性篩選、機(jī)制區(qū)分以及毒性作用相關(guān)生物標(biāo)志物的研究。此外，美國(guó)食品藥物管理局（FDA）已經(jīng)接受代謝組學(xué)研究的結(jié)果作為新藥申報(bào)和注冊(cè)的重要參考指標(biāo)［6］。因此，以代謝組學(xué)作為體內(nèi)藥物安全性評(píng)價(jià)的方法，能更快、更準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)毒性物質(zhì)與毒性規(guī)律。

目前，代謝組學(xué)毒性研究通常在單一時(shí)間點(diǎn)下對(duì)對(duì)照組與某個(gè)毒性藥物組進(jìn)行比較。雖然能相對(duì)容易發(fā)現(xiàn)典型的毒性相關(guān)生物標(biāo)志物，但此代謝物不一定在毒性潛伏期顯現(xiàn)或早期和后期均發(fā)生顯著變化，亦未能反映整個(gè)毒性過(guò)程中生理或病理動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)又缺少相應(yīng)的回顧性資料進(jìn)行驗(yàn)證，從而導(dǎo)致無(wú)法通過(guò)毒性發(fā)生發(fā)展過(guò)程的全貌闡明致毒動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。因此，發(fā)現(xiàn)與組織病理學(xué)檢查結(jié)果具有較好的相關(guān)性，且具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、易于檢測(cè)的毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物成為代謝組學(xué)開(kāi)展毒性研究的關(guān)鍵。合理、有效地利用代謝組學(xué)新技術(shù)、新方法聯(lián)合監(jiān)測(cè)新的毒性生物標(biāo)志物和傳統(tǒng)的毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)，必將促進(jìn)中藥毒性的早期發(fā)現(xiàn)、降低臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)，亦會(huì)全方位地支撐中醫(yī)藥各個(gè)領(lǐng)域的深入研究。

3 基于整體動(dòng)物早期評(píng)價(jià)的“十八反”中藥配伍禁忌毒性表征的研究

針對(duì)當(dāng)前靶器官毒性研究主要存在的關(guān)鍵問(wèn)題：即體外評(píng)價(jià)不能全面真實(shí)地反映機(jī)體狀態(tài)、傳統(tǒng)的檢查方法對(duì)毒性早期評(píng)價(jià)不敏感、毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)不能綜合地判斷中藥配伍是否致毒增毒，本文構(gòu)建了一套“毒性整體早期評(píng)價(jià)篩選-驗(yàn)證及優(yōu)化-應(yīng)用”的中藥靶器官毒性早期評(píng)價(jià)的關(guān)鍵技術(shù)。主要包括4方面內(nèi)容：①基于代謝動(dòng)態(tài)指紋譜初步篩選靶器官毒性整體早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物；②靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物的優(yōu)化和驗(yàn)證；③靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物生物學(xué)意義的闡釋?zhuān)虎馨衅鞴俣拘栽缙谠u(píng)價(jià)生物標(biāo)志物在中藥配伍禁忌的應(yīng)用。技術(shù)路線見(jiàn)圖1，借助代謝組學(xué)和模式識(shí)別技術(shù)，尋找具有最佳預(yù)測(cè)能力的內(nèi)源性代謝物，從而發(fā)現(xiàn)敏感的、先于常規(guī)生化指標(biāo)變化的靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物，并建立毒性判別方程式或者預(yù)測(cè)模型［7-8］。最后將其應(yīng)用到中藥“十八反”配伍禁忌的靶器官早期毒性評(píng)價(jià)中，提供闡述中藥“十八反”的科學(xué)依據(jù)。

根據(jù)該研究思路，可對(duì)中藥早期心臟毒性、腎毒性、肝毒性和神經(jīng)毒性等分別進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，最終確定一系列的中藥毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物，建立一套快速、敏感、高效的評(píng)價(jià)方法，進(jìn)而應(yīng)用于系統(tǒng)的中藥及成方制劑毒性評(píng)價(jià)及中藥配伍禁忌研究中，從而為解決中醫(yī)藥關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題開(kāi)辟一條全新的研究思路。

3.1 基于代謝動(dòng)態(tài)指紋譜初步篩選靶器官毒性整體早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物

3.1.1 靶器官毒性病理生化指標(biāo)的檢測(cè)

以常用的動(dòng)物大鼠為模型動(dòng)物，分為不同組別，即空白對(duì)照組、靶器官毒性藥物組（包含不同機(jī)制的靶器官毒性藥物，目的是篩選其共同的生物標(biāo)志物），參照文獻(xiàn)并摸索藥物的給藥劑量以及給藥方式，于給藥后不同的時(shí)間點(diǎn)，分離血清和血漿以及組織［9-11］。采用光學(xué)顯微鏡組織病理學(xué)觀察，檢測(cè)血清中靶器官常規(guī)生化指標(biāo)，如心臟毒性檢測(cè)肌酸激酶、肌酸激酶同工酶，腎毒性檢測(cè)肌酐、尿素氮，肝毒性檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量。以每種藥物的給藥時(shí)間為橫坐標(biāo)，以血清生化指標(biāo)為縱坐標(biāo)繪制曲線，并輔以靶器官病理切片說(shuō)明每種藥物的毒性作用特征。

圖1 1基于毒性整體早期評(píng)價(jià)的中藥“十八反”配伍禁忌毒性表征的研究思路及方法

3.1.2 靶器官毒性藥物作用于大鼠代謝組學(xué)的研究

以收集的血漿樣品為研究對(duì)象，優(yōu)化樣品分離條件和色譜-質(zhì)譜分析條件，利用色譜-質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行無(wú)靶向代謝指紋分析，隨行穿插質(zhì)量控制樣本以保證測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定可靠。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P統(tǒng)計(jì)軟件，將不同給藥組分別與正常組進(jìn)行對(duì)比，采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)動(dòng)態(tài)代謝指紋圖譜進(jìn)行深入挖掘，通過(guò)主成分分析法、偏最小二乘判別分析法等模型的載荷圖、得分圖、變量重要程度值來(lái)篩選潛在的生物標(biāo)志物，并應(yīng)用t檢驗(yàn)來(lái)考察代謝物在組間的差異。隨后，通過(guò)與NIST，HMDB 和Massbank等數(shù)據(jù)庫(kù)、對(duì)照品比對(duì)的方法以及本實(shí)驗(yàn)室自建的金字塔型篩選方法鑒定生物標(biāo)志物［12-13］。

3.1.3 靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物的初步篩選

對(duì)上述研究結(jié)果開(kāi)展相關(guān)性分析，首先縱向?qū)Ρ?，針?duì)每種藥物給藥后不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于正常組的生物標(biāo)志物，篩選在未出現(xiàn)明顯病理變化和生化檢測(cè)異常時(shí)，每種藥物作用于大鼠的靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物。其次橫向?qū)Ρ?，將不同藥物作用于大鼠的靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物對(duì)比分析，辨識(shí)其差異和關(guān)聯(lián)性，篩選有共同變化趨勢(shì)的標(biāo)志物即為可能的靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物。

3.2 靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物的優(yōu)化和驗(yàn)證

3.2.1 靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物快速檢測(cè)方法的研究

采用隨機(jī)、雙盲實(shí)驗(yàn)，在充分文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上，選取多種中藥或中藥成分，在參照文獻(xiàn)給藥方式及給藥劑量的基礎(chǔ)上，收集給藥后不同時(shí)間的血漿樣品，采用LC-MSn技術(shù)檢測(cè)生物標(biāo)志物，判斷其毒性大小、生物標(biāo)志物的變化趨勢(shì)。

3.2.2 靶器官毒性早期預(yù)測(cè)方法的建立

將所得生物標(biāo)志物含量的數(shù)據(jù)分成訓(xùn)練集和測(cè)試集，采用ROC曲線、支持定量機(jī)等多元統(tǒng)計(jì)方法對(duì)生物標(biāo)志物進(jìn)行模式識(shí)別，建立預(yù)測(cè)的數(shù)學(xué)模型，判斷以生物標(biāo)志物進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性、靈敏度和敏感度，尋找到最佳預(yù)測(cè)能力的內(nèi)源性代謝物。以篩選的最佳生物標(biāo)志物的含量（或相對(duì)含量）為指標(biāo)，由主成分分析模型構(gòu)建毒性判別方程式。繼而對(duì)測(cè)試集中毒性樣本進(jìn)行評(píng)分，建立簡(jiǎn)便的早期毒性預(yù)測(cè)模式，也為靶器官毒性早期預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物在中藥安全性及配伍禁忌中的應(yīng)用提供依據(jù)。本課題組采用上述策略進(jìn)行心臟毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物的篩選、發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，最終發(fā)現(xiàn)10種物質(zhì)與心臟毒性模型相比具有較好的專(zhuān)屬性。隨后采用支持向量機(jī)預(yù)測(cè)模型對(duì)這些生物標(biāo)志物進(jìn)行優(yōu)化，所建立的支持定量機(jī)預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)率為90.0%，并發(fā)現(xiàn)在這些專(zhuān)屬性標(biāo)志物中左旋肉堿、1-肉豆蔻-sn-甘油-3-磷酸膽堿〔LysoPC（14∶0）〕等4個(gè)生物標(biāo)志物對(duì)心臟毒性模型的預(yù)測(cè)具有更好的貢獻(xiàn)［14］。其他如肝、腎毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及驗(yàn)證將陸續(xù)報(bào)道。

3.3 靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物生物學(xué)意義的闡釋

3.3.1 靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物關(guān)鍵靶點(diǎn)的尋找

生物標(biāo)志物得以應(yīng)用必須要有明確的生物學(xué)意義闡釋。以尋找的靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物為指標(biāo)，通過(guò)其含量差異變化結(jié)合KEGG，IPA 和MetPA等在線數(shù)據(jù)庫(kù)檢索生物標(biāo)志物所涉及的代謝途徑及關(guān)聯(lián)代謝途徑，篩選出關(guān)鍵代謝物靶點(diǎn)。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)檢索初步確定與代謝物靶點(diǎn)可能相關(guān)的酶和基因。

3.3.2 靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物生物學(xué)意義的闡釋

以收集的正常組和不同靶器官毒性組的生物樣本為研究對(duì)象，采用RT-PCR方法對(duì)靶器官毒性藥物的干預(yù)的關(guān)鍵靶點(diǎn)可能相關(guān)的基因進(jìn)行考察。通過(guò)組織勻漿處理、RNA提取、mRNA的逆轉(zhuǎn)錄、引物的合成、cDNA的擴(kuò)增隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，對(duì)基因在RT-PCR中的變化趨勢(shì)與文獻(xiàn)對(duì)比，驗(yàn)證基因表達(dá)的異同。采用Western蛋白印跡法對(duì)相應(yīng)關(guān)鍵蛋白進(jìn)行分析，由相關(guān)基因或酶與生物標(biāo)志物含量變化的相關(guān)性驗(yàn)證相關(guān)代謝通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物的進(jìn)一步應(yīng)用提供科學(xué)的生物學(xué)功能解釋?zhuān)?4-15］。

3.4 靶器官毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物在“十八反”中藥配伍禁忌的應(yīng)用

3.4.1 中藥“十八反”體外化學(xué)成分分析

以中藥“十八反”中“半蔞貝蘞及攻烏”為例，以廣泛關(guān)注的心臟毒性為依據(jù)，進(jìn)行心臟毒性早期生物標(biāo)志物在中藥配伍禁忌的應(yīng)用。首先進(jìn)行“半蔞貝蘞及攻烏”配伍組合的化學(xué)成分分析及表征研究。烏頭類(lèi)藥物（黑順片和附子）分別與生半夏、法半夏、瓜蔞、貝母、白蘞、白及等中藥配伍。采用超高效液相色譜/四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography quadrupole-timeof-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）對(duì)配伍組合和單味藥進(jìn)行化學(xué)成分指紋圖譜研究，經(jīng)過(guò)精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等方法學(xué)考察合格后，分析配伍組合提取液的指紋圖譜。結(jié)合文獻(xiàn)資料，對(duì)色譜峰進(jìn)行歸屬以及對(duì)配伍后未知的主要色譜峰進(jìn)行分離、結(jié)構(gòu)推測(cè)和確證，以明確配伍前后體外化學(xué)成分的變化規(guī)律［16-21］，從而獲得穩(wěn)定可重復(fù)的多成分分析數(shù)據(jù)?；诨瘜W(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)穩(wěn)定、質(zhì)量可控的基礎(chǔ)上開(kāi)展后續(xù)毒性評(píng)價(jià)研究。

3.4.2 中藥“十八反”配伍的毒性預(yù)測(cè)

在中藥體外化學(xué)成分穩(wěn)定、質(zhì)量可控的基礎(chǔ)上，開(kāi)展關(guān)于中藥“十八反”中“半蔞貝蘞及攻烏”配伍組合的毒性預(yù)測(cè)研究。針對(duì)目前由于缺乏特異性和敏感性的靶器官毒性的評(píng)價(jià)指標(biāo)而不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)器官損傷的情況，本課題組以所優(yōu)化的心臟毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物為指標(biāo)，以建立的支持向量機(jī)預(yù)測(cè)模型為依據(jù)，初步進(jìn)行中藥配伍前后的心臟毒性預(yù)測(cè)。將中藥配伍前后的提取液分別給予大鼠，綜合分析作用于大鼠后不同時(shí)間的組織病理學(xué)、生化指標(biāo)檢測(cè)的變化情況。隨后采用UPLC-QTOF-MS檢測(cè)心臟毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物，明確不同配伍組合配伍前后毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物的量變特征。同時(shí)基于心臟毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物建立支持向量機(jī)預(yù)測(cè)模型，對(duì)黑順片、生半夏、法半夏、瓜蔞、貝母、白蘞、白及以及黑順片配伍各單味藥后的組合進(jìn)行心臟毒性的預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，除黑順片外的各單味藥不具有心臟毒性，而黑順片配伍各單味藥后顯示均具有心臟毒性。由此可知，對(duì)于“半蔞貝蘞及”5種不具有心臟毒性的中藥而言，和黑順片配伍后均致心臟毒性。明確地回答了“半蔞貝蘞及攻烏”中藥配伍前后是否致毒的科學(xué)問(wèn)題。

3.4.3 中藥“十八反”配伍增毒的預(yù)測(cè)

在明確靶器官毒性的基礎(chǔ)上，開(kāi)展關(guān)于中藥“十八反”中“半蔞貝蘞及攻烏”配伍前后是否增毒的預(yù)測(cè)研究。以早期心臟毒性支持向量機(jī)模型預(yù)測(cè)配伍組合的毒性評(píng)價(jià)模式為依據(jù)，以黑順片組作為對(duì)照組，配伍組為給藥組，即以改變參照物的方法，通過(guò)支持向量機(jī)預(yù)測(cè)模型評(píng)價(jià)其是否增毒。結(jié)果顯示，除黑順片配伍白及組外，其余配伍組顯示均具有心臟毒性。由此可知，對(duì)于具有心臟毒性的黑順片而言，“半蔞貝蘞及”配伍黑順片后顯示心臟毒性均有所增加。明確地回答了“半蔞貝蘞及攻烏”中藥配伍前后是否增毒的科學(xué)問(wèn)題。以毒性代謝組學(xué)生物標(biāo)志物為基礎(chǔ)建立支持向量機(jī)毒性預(yù)測(cè)模型的方法為評(píng)價(jià)中藥配伍前后是否致毒、增毒提供了一個(gè)新的研究方向，也為代謝生物標(biāo)志物的應(yīng)用提供一條系統(tǒng)的思路。毒性早期評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物在中藥“十八反”配伍組合的毒性預(yù)測(cè)也將陸續(xù)發(fā)表。

4 展望

隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代研究能力的快速提升和人類(lèi)安全用藥意識(shí)的不斷增強(qiáng)，中藥配伍禁忌是中藥安全性及臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題之一。然而目前主要集中在古代文獻(xiàn)記載和簡(jiǎn)單經(jīng)驗(yàn)積累上，對(duì)于中藥配伍禁忌的總體規(guī)律和本質(zhì)研究還不夠。隨著組學(xué)技術(shù)以及生物信息學(xué)的發(fā)展，本文構(gòu)建了一套“毒性整體早期評(píng)價(jià)篩選-驗(yàn)證及優(yōu)化-應(yīng)用”的中藥靶器官毒性早期評(píng)價(jià)的研究思路，并應(yīng)用到中藥“十八反”配伍禁忌中，明確地回答了配伍組合“反”還是“不反”的科學(xué)問(wèn)題。基于毒性整體早期評(píng)價(jià)的“十八反”的中藥配伍禁忌毒性表征的研究思路及方法，促使我們對(duì)中藥配伍禁忌的內(nèi)涵認(rèn)識(shí)達(dá)到了一個(gè)新水平。但是需要注意的是，靶器官毒性生物標(biāo)志物的靈敏度和重現(xiàn)性研究、基于生物標(biāo)志物的毒性大小和強(qiáng)弱的預(yù)測(cè)模式分析是該研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。后期工作將以此為重點(diǎn)展開(kāi)深入研究，為該研究思路與方法提供保障。

［1］ Zhang QQ，Wang AP，Jin HT.The advances of the nephrotoxicity in traditional Chinese medicine ［J］.Pharm J Chin PLA（解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)），2013，29（6）：558-561.

［2］ OzerJ，RatnerM，ShawM，BaileyW，SchomakerS. Thecurrentstateofserumbiomarkersof hepatotoxicity［J］.Toxicology，2008，245（3）：194-205.

［3］ Fan XS.″Hidden harm″theory in incompatibility of Chinese medicinals［J］.J Trdit Chin Med（中醫(yī)雜志），2015，56（5）：361-365.

［4］ Fan XS，Duan JA，Hua HM，Qian DW，Shang EX，Guo JM.Study on incompatibility of traditional Chinese medicines［J］.China J Chin Mater Med（中國(guó)中藥雜志），2015，40（8）：1630-1634.

［5］ Duan JA，Su SL，F(xiàn)an XS，Qian DW，Tang YP，Shang EX，et al.Explore the action patterns and mechanismsoftraditionalChinesemedicine incompatibility ofQi-Qing antagonism and mutal inhibition/restraint based on drug interaction［J］. World Sci Technol/Mod Tradit Chin Med Mater Med（世界科學(xué)技術(shù)/中醫(yī)藥現(xiàn)代化），2012，14 （3）：1547-1552.

［6］ RaamsdonkLM，TeusinkB，BroadhurstD，Zhang N，Hayes A，Walsh MC，et al.A functional genomics strategy that uses metabolome data to reveal the phenotype of silent mutations［J］.Nat Biotechnol，2001，19（1）：45-50.

［7］ Chen WL，Wang JH，Zhao AH，Xu X，Wang YH，Chen TL，et al.A distinct glucose metabolism signature of acute myeloid leukemia with prognostic value［J］.Blood，2014，124（10）：1645-1654.

［8］ Li Y，Ju L，Hou Z，Deng H，Zhang Z，Wang L，et al.Screening，verification，and optimization of biomarkers for early prediction of cardiotoxicity based on metabolomics［J］.J Proteome Res，2015，14（6）：2437-2445.

［9］ Li YB，Zhang XX，Zhou HF，F(xiàn)an SM，Wang YM，Wang L，et al.Toxicity analysis of doxorubicin using plasma metabolomics technology based on rapid resolution liquid chromatography coupled with quadruple-time-of-flight mass spectrometry ［J］.Anal Methods，2014，6：5909-5917.

［10］ Li YB，Zhang XX，Zhou HF，F(xiàn)an SM，Wang YM，Zhang L，et al.Metabonomics study on nephrotoxicity induced by intraperitoneal and intravenous cisplatin administration using rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupole-time-offlight mass spectrometry（RRLC-Q-TOF-MS）［J］. RSC Adv，2014，4（16）：8260-8270.

［11］ Zhang X，Li Y，Zhou H，F(xiàn)an S，Zhang Z，Wang L，et al.Plasma metabolic profiling analysis of nephrotoxicity induced by acyclovir using metabonomics coupled with multivariate data analysis［J］.J Pharm Biomed Anal，2014，97：151-156.

［12］ Li YB，Zhang ZZ，Hou ZG，Wang L，Wu X，Ju L，et al.A rapid and integrated pyramid screening method to classify and identify complex endogenous substances with UPLC/Q-TOF MS-based metabolomics［J］.RSC Adv，2014，5：202-209.

［13］ Li Y，Zhang Z，Liu X，Li A，Hou Z，Wang Y，et al.A novel approach to the simultaneous extraction and non-targeted analysis of the small molecules metabolome and lipidome using 96-well solid phase extraction plates with columnswitching technology［J］.J Chromatogr A，2015，1409：277-281.

［14］ Liao W，Tan G，Zhu Z，Chen Q，Lou Z，Dong X，et al.Combined metabonomic and quantitative real-time PCR analyses reveal systems metabolic changes in Jurkat T-cells treated with HIV-1 Tat protein［J］.J Proteome Res，2012，11（11）：5109-5123.

［15］ Chen M，Zhou K，Chen X，Qiao S，Hu Y，Xu B，et al.Metabolomic analysis reveals metabolic changes caused by bisphenol A in rats［J］.Toxicol Sci，2014，138（2）：256-267.

［16］ Wang Y，Li Y，Zhang X，Xu Y，Wang H，Zhang Y. Exploring processing adjuvants'influence on traditional Chinese medicine compatibility of Aconiti Radix Cocta and Pinelliae rhizoma using rapid resolution liquid chromatography-quadrupole timeof-flight mass spectrometry［J］.Pharmacogn Mag，2014，10（40）：483-490.

［17］ Li YB，Zhang L，Wu HY，Wu X，Ju L，Zhang YJ. Metabolomic study to discriminate the different Bulbus fritillariae species using rapid resolution liquidchromatography-quadrupoletime-of-flight massspectrometrycoupledwithmultivariate statistical analysis［J］.Anal Methods，2014，6 （7）：2247-2259.

［18］ Li Y，Wang Y，Su L，Li L，Zhang Y.Exploring potentialchemicalmarkersbymetabolomics method for studying the processing mechanism of traditional Chinese medicine using RPLC-Q-TOF/ MS：a case study of Radix Aconiti［J］.Chem Cent J，2013，7（1）：36-44.

［19］Xu YY，Cheng LL，Li YB，Wang H，Chen N，ZhangYJ.Chemicalconstituentchangesof Aconiti Cocta Radix before and after combination with Trichosanthis Fructus in different ratios by RRLC-QTOF/MS［J］.Chin Trdit Herb Drugs（中草藥），2013，44（17）：2372-2379.

［20］ Wang H，Chen N，Xu YY，Cheng LL，Zhuang PW，Li YB，et al.Effect of Ampelopsis Radix on dissolution of main chemical constituents in Aconiti Radix Cocta based on RRLC-Q-TOF-MS technology ［J］.Chin Trdit Herb Drugs（中草藥），2013，44 （15）：2059-2066.

［21］ Zhang L，Li YB，Li LX，Wang YM，Xu YY，Jin J，et al.Effect of Aconiti Cocta Radix combined with Pinelliae Praeparatum Rhizoma in different ratios on Aconitum alkaloids［J］.Chin Trdit Herb Drugs（中草藥），2013，44（6）：681-685.

（本文編輯：?jiǎn)毯纾?/p>

Research methods of″18 incompatible medicaments″incompatibility toxicity characterization of traditional Chinese medicine based on early evaluation of overall toxicity

LI Yu-bo1，JU Liang1，DENG Hao-yue1，ZHANG Zhen-zhu1，WANG Lei1，HOU Zhi-guo1，YIN Jia1，ZHANG Yan-jun2
（1.School of Chinese Materia Medica，Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China；2.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

Currently，the toxicity study of traditional Chinese medicine is faced with the following problems.Firstly，the evaluation in vitro cannot fully reflect the true state of the body.Secondly，the traditional method is not sensitive enough to the early toxicity.Lastly，the toxicity evaluation indexes cannot determine whether the compatibility of traditional Chinese medicine produces toxicity or increases toxicity systematically.The paper proposed a synthesized early evaluation research method for target organ toxicity induced by traditional Chinese medicine：screening，validation，optimization and application.This method mainly inoolves early target organ toxicity biomarkers in screening，optimization，validation，biological significance explanation，and application to the traditional Chinese medicine incompatibility based on the metabolic dynamic fingerprint spectrum in order to obtain biomarkers of target organ toxicity that are sensitive and precede conventional biochemical indices for early evaluation. We attempted to analyze the pattern of chang of the biomarkers for animals acted by″18 incompatible medicaments″compatibility combination.We found that Radix Aconiti Lateralis Preparata with cardiotoxicity were compatible with Rhizoma Pinelliae，and that Trichosanthes kirilowii Maxim，F(xiàn)ritillaria，Ampelopsis Radix and Bletilla striata without non-cardiotoxicity produced and increased cardiotoxicity systematically.

18 incompatible medicaments；drugs，Chinese herbal；drug incompatibility；early toxicity；metabolomics；biomarkers

The project supported by the National Basic Research Program of China（2011CB505300）；National Basic Research Program of China 2011CB505302）；National Natural Science Foundation of China （81273998）；National Natural Science Foundation of China（81573825）；and China Postdoctoral Science Foundation Funded Project（133806）

ZHANG Yan-jun，E-mail：zyjsunye@163.com

R285.1

A

1000-3002-（2015）06-0960-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.013

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2011CB505300）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2011CB505302）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81273998）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81573825）；中國(guó)博士后特別資助項(xiàng)目（133806）

李遇伯，女，副教授，主要從事代謝組學(xué)和毒性評(píng)價(jià)研究，E-mail：yuboli1@163.com

張艷軍，E-mail：zyjsunye@163.com

（2015-09-01接受日期：2015-11-09）