陳 默,范湛藍,高 群,高福梅,牟 迪,胡建英（北京大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院,地表過程分析與模擬教育部重點實驗室,北京 100871）

北京女性尿液中雙酚A及氯代雙酚A的濃度和風(fēng)險評價

陳 默,范湛藍,高 群,高福梅,牟 迪,胡建英*（北京大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院,地表過程分析與模擬教育部重點實驗室,北京 100871）

建立了有機相丹酰化衍生-UPLC-MS-MS人體尿液樣品中雙酚A（BPA）及4種氯代雙酚A（氯代BPA）的檢測方法,對北京地區(qū)40個女性尿液樣品進行了檢測.結(jié)果表明：BPA和一氯、二氯、三氯、四氯 BPA的檢出率分別為90%、96%、90%、52%和 45%；濃度分別為（1.30±1.24）,（0.40±0.37）,（0.41±0.51）,（0.18±1.49）,（0.46±0.35） ng/mL,4種氯代BPA的總濃度為1.45ng/mL,和BPA濃度相仿.4種氯代BPA的BPA等當(dāng)量濃度為4.84ng/mL,是BPA濃度的2.2倍. 40個尿液樣本BPA等當(dāng)量濃度符合對數(shù)正態(tài)分布,超過BPA的糖尿病發(fā)生閾值（0.05%發(fā)病風(fēng)險）5.7ng/mL的概率為19.2%.人體暴露氯代BPA的健康風(fēng)險應(yīng)該引起重視.

氯代雙酚A；丹?；苌?；攝入量；等當(dāng)量；LC-MS-MS

雙酚A是一種典型內(nèi)分泌干擾物,廣泛存在于各種環(huán)境介質(zhì)中,在飲用水和人體中也都有檢出［1］.已有文獻證明,飲用水主要單元的氯消毒過程中BPA會轉(zhuǎn)化成各種氯代消毒副產(chǎn)物,并且一氯和二氯BPA的雌激素結(jié)合活性遠高于BPA［2］,最近在全國33個省會城市飲用水中檢出了這些氯代消毒副產(chǎn)物［3］,因此為了綜合評價BPA的健康風(fēng)險,有必要展開該類物質(zhì)的人群暴露評價.

最近有多篇論文報道了人群中氯代BPA的暴露水平.在法國21個母乳樣品中發(fā)現(xiàn)二氯雙酚A的檢出率高達 100%,其濃度水平（3.43ng/mL）甚至高于 BPA（1.87ng/mL）［4］.在婦女胎盤中一氯、二氯和三氯BPA的檢出率分別為51%、51%和49%,濃度范圍分別為5.1～21.4,12.7～58.8,4.0～31.2ng/g,高于 BPA濃度水平（5.7～22.2ng/g）［5］.婦女脂肪組織樣品中主要檢出了二氯 BPA （9.21ng/g）,平均濃度也高于 BPA（5.83ng/g）［6］.尿液樣品具有便于獲得、容易收集、適于大規(guī)模人群暴露調(diào)查的特點. BPA和氯代BPA都是親水性含有酚羥基物質(zhì),容易被二相酶代謝排泄,在尿液中具有較高濃度,對于這類物質(zhì),尿液是研究人群暴露量的理想生物樣品.已有多篇論文嘗試檢測人體尿液中氯代 BPA,其檢出率普遍較低（小于 20%）［7-9］,其主要原因之一可能是缺乏高靈敏度的檢測方法.

本研究以 BPA、Cl-BPA、Cl2-BPA、Cl3-BPA、Cl4-BPA為對象物質(zhì),建立了尿液中對象物質(zhì)的有機相丹酰化衍生的高靈敏度檢測方法,并將其用于 40個北京婦女尿液中上述對象物質(zhì)的檢測.計算了尿液樣品中 BPA的等當(dāng)量濃度,并通過一個單室模型反演了總攝入量,評價了其健康風(fēng)險.

1　材料與方法

1.1樣品的采集

本研究中的40個尿液樣品于2014年1月～2015年 2月采集于北京大學(xué)人民醫(yī)院門診部,前來體檢的志愿者尿液樣品（已征得知情同意）.研究表明,雙酚A與糖尿病、甲狀腺疾病、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等疾病存在相關(guān)性［10-12］.本研究的所有志愿者都沒有與BPA有關(guān)的職業(yè)暴露、無吸煙史、無糖尿病、甲狀腺疾病等代謝相關(guān)疾病、無高血壓、心臟病等心血管相關(guān)疾病.

用50mL玻璃小燒杯收集,后轉(zhuǎn)移入8mL棕色玻璃樣品瓶,由干冰保存運輸至實驗室,放入-20℃保存直至檢測.

1.2標(biāo)準(zhǔn)品

4種氯代 BPA的標(biāo)準(zhǔn)品由本實驗室合成［3］,所有標(biāo)樣的純度都大于95%.物質(zhì)結(jié)構(gòu)式見圖1.

圖1　BPA及氯代BPA的結(jié)構(gòu)Fig.4　Structures of BPA and chlorinated BPAs

1.3樣品前處理

尿液樣品解凍后立即取0.5mL混合均勻后的全尿,置于 8mL玻璃培養(yǎng)管中,加入 0.5ng BPA-d14內(nèi)標(biāo),0.1mL 0.14mol/L的磷酸鹽緩沖液和 0.1mL的葡萄糖醛酸（β-glucuronidase）-硫酸（β-arylsuflatase）混合水解酶（Roche Diagnostics GmbH, Mannhein, Germany）后,置于37℃培養(yǎng)箱中水解反應(yīng)3h.水解后取出玻璃管,加入0.5mL超純水和3mL叔丁基甲醚（MTBE）,振蕩10min后在3000r/min下離心5min,取上層有機溶液；重復(fù)萃取一次,兩次液液萃取的提取液混合后在微弱氮氣下吹干,用 1mL乙腈定容.添加 0.2mL的30mg/mL的丹磺酰氯（DNS）和4-（二甲氨基）吡啶（DMAP）混合溶液,充分振蕩混合后放入 65℃烘箱放置1h.反應(yīng)結(jié)束后,加1mL超純水、3mL正己烷溶液,重復(fù)提取兩次.得到的有機層溶液通過6cm3,1g規(guī)格的Silica SPE小柱（Waters, USA）凈化,經(jīng)5mL正己烷：二氯甲烷1：1（體積比）溶液淋洗,用5mL二氯甲烷：丙酮9：1（體積比）溶液洗脫,在微弱氮氣下吹干,最后加入0.5mL乙腈定容用于UPLC-MS-MS分析.

1.4儀器分析

表1　雙酚A及氯代雙酚A的選擇離子和質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1　Multi-selected reaction monitoring （MRM）conditions for bisphenol A （BPA） and chlorinated BPA

用 ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（Waters, USA）對各目標(biāo)物進行分離.液相色譜柱采用 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1mm×50mm×粒徑 1.7 μm）（Waters, USA）,流動相為乙腈和含 0.1%甲酸的純水,色譜柱溫度為 40℃,流速 0.3mL/min,進樣體積5μL.液相梯度洗脫條件：乙腈初始比例為 60%,在 0～0.5min內(nèi)線性增加為 75%,從 0.5～6.5min線性增加為80%, 6.5～7min線性增加至95%,保持2min后, 在0.5min內(nèi)線性增加到100%,保持2min后,立即回到初始流動相條件平衡 1.0min.所用質(zhì)譜為 Quattro Premier XE 串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（Waters, USA）,采用正離子模式的 ESI離子源, 在MRM模式下對目標(biāo)物進行檢測.質(zhì)譜參數(shù)為：毛細管電壓3.5kV；源溫度120℃；脫溶劑氣溫度450℃；錐孔氣流量50L/h；脫溶劑氣流量800L/h. BPA及氯代 BPA的選擇離子和質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1.

1.5質(zhì)量保證與質(zhì)量控制（QA/QC）

本研究中對于樣品中目標(biāo)物質(zhì)的定性主要依據(jù)：（1）與標(biāo)樣相比保留時間相差在2%以內(nèi)；（2）與標(biāo)樣相比,2個選擇離子峰面積之比相差在20%以內(nèi).目標(biāo)物質(zhì)的定量選用豐度最高及背景干擾最小的MRM選擇離子,同時用內(nèi)標(biāo)校正前處理和基質(zhì)干擾引起的損失,并用以消除儀器波動的影響.由于雙酚A無處不在,為了消除過程空白,前處理過程中僅使用色譜純、農(nóng)殘級的有機溶劑和在馬弗爐中450℃烘烤4h以上的玻璃器皿.為了評估空白和基質(zhì)效應(yīng),每一組（10個）樣品跟隨1個過程空白、1個基質(zhì)加標(biāo)樣品作為質(zhì)量控制.本研究通過向尿液樣品中加入 0.05,0.5, 2ng/mL 3個不同濃度水平的標(biāo)樣,用以評估本實驗的回收率以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍.

2　結(jié)果與討論

2.1分析方法的優(yōu)化

水相DNS衍生LC-MS-MS方法不僅僅具有高靈敏度,而且能克服 LC-MS-MS分析中常見的基質(zhì)效應(yīng)高的問題,該方法已經(jīng)應(yīng)用于環(huán)境水樣中雌激素類物質(zhì)和飲用水中雙酚A及其氯代 BPA的方法的檢測［3,13］.本研究也嘗試該方法用于人體尿液樣品中BPA及氯代BPA的檢測,但是該方法分析人體尿液樣品時對于三氯、四氯雙酚A衍生效率較低,基質(zhì)效應(yīng)依然嚴(yán)重.因此本研究參考文獻［14］,采用有機相DNS+DMAP衍生LC-MS-MS檢測方法分析尿液中 BPA及氯代BPA.

尿液通過MTBE液液萃取,衍生后,Silica純化,用UPLC-MS-MS進行定量,對不同添加濃度下的回收率進行了評估（表3）.在低（0.05ng/mL）、中（0.5ng/mL）、高（2ng/mL）3種添加濃度下,BPA及其氯代BPA的回收率在62%～108%之間（n=3）,內(nèi)標(biāo)BPA-d14回收率分別為76%、80%和96%（表2）.表3同時比較了不衍生、水相DNS衍生、有機相DNS+DMAP衍生LC-MS-MS方法的檢出限（LOD）,發(fā)現(xiàn)BPA、一氯BPA和二氯BPA的有機相DNS+DMAP衍生靈敏度和水相DNS衍生相似；但是三氯、四氯 BPA的靈敏度相比水相DNA衍生提高了5倍.本研究的靈敏度高于文獻報道方法［8-9］,特別是一氯BPA和二氯BPA的檢測下線是文獻的1/100～1/9.5種目標(biāo)物質(zhì)的基質(zhì)抑制率在1%～6%之間.

表2　雙酚A及其氯代衍生物的回收率及標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)Table 1　Recovery and standard curve parameters of bisphenol A and chlorinated BPAs

表3　目標(biāo)物質(zhì)未衍生和兩種衍生方法的檢出限和選擇離子比較Table 1　LOD and transition monitored m/z of nonderivatization and two different derivatization methods

2.2人體尿液樣品中BPA及其氯代物質(zhì)濃度水平

本研究人體尿液中 BPA的檢出率為 90%,低于比利時（96.9%,n=66）、美國（94%,n=210）、日本（100%,n=48）和瑞典（100%,n=95）女性尿樣中BPA的檢出率［15-18］,但高于我國華東和華中地區(qū)女性（44%,n=503）［19］、和廣州、上海、哈爾濱的女性人群相同（90%,n=55）［20］.這可能與我國不同地區(qū)、同一地區(qū)不同人群的飲食習(xí)慣差異與飲水來源差異有關(guān).

本研究人體尿液中 BPA的平均濃度為（1.30±1.24） ng/mL（幾何均值：0.84ng/mL, ＜MDL～5.32ng/mL）,和美國（幾何均值：1.12ng/mL, ＜MDL～5.18ng/mL）相近,比日本（1.2ng/mL, 0.2～19.1ng/mL）、比利時（幾何均值：2.40ng/mL, ＜MDL～23.40ng/mL）,瑞典（幾何均值：1.31ng/ mL）［15-18］和廣州、上海、哈爾濱（幾何均值：1.00ng/mL,0.57～1.36ng/mL）［20］女性尿液中 BPA的水平低,但是高于我國華東和華中地區(qū)的女性（幾何均值：0.58ng/mL）［19］.

北京人體尿液中都檢出了 4種氯代 BPA,其典型的色譜圖如圖2.二氯BPA的檢出率最高, 為 96%,其次是一氯 BPA（90%）、四氯BPA（52%）、三氯BPA（45%）.目前僅有4篇文獻報道了尿液中氯代BPA的濃度水平.法國10個尿液樣品中一氯BPA、二氯BPA、三氯BPA和四氯BPA的檢出率分別為30%、20%、30%、30%［8］.美國人體尿液（n=31）中一氯 BPA、二氯BPA和三氯 BPA的檢出率分別為 16.1%、19.4%、19.4%（四氯BPA未研究）［7］.另一美國人群（n=224）尿液中一氯BPA的檢出率為90%（二氯BPA、三氯BPA、四氯BPA未研究）［21］.西班牙的20個成人尿液中沒有檢出氯代BPA［9］.本研究的一氯、二氯、三氯、四氯BPA的檢出率均高于上述文獻報道,這個可能和本研究開發(fā)方法的檢出限有關(guān).

圖2　尿液樣品中目標(biāo)物質(zhì)的典型色譜圖Fig.4　Chromatograms of target substances in urine samples

本研究尿液樣品中一氯BPA、二氯BPA、三氯 BPA和四氯 BPA的濃度水平分別為（0.40±0.37） ng/mL（＜MDL～1.70ng/mL,幾何均值0.01ng/mL）、（0.41±0.51） ng/mL（＜MDL～2.60ng/ mL,幾何均值=0.01ng/mL）、（0.18±1.49） ng/mL（＜MDL～1.95ng/mL,幾何均值 0.01ng/mL）、（0.46±0.35）ng/mL（＜MDL～1.72ng/mL,幾何均值0.04ng/mL）,4種氯代物質(zhì)的總濃度為1.45ng/mL,略高于BPA的濃度水平,低于美國人群（n=31）尿液中一氯BPA、二氯BPA、三氯BPA的濃度水平（幾何均值分別為 0.049,0.055, 0.047ng/mL,未研究四氯 BPA）［7］,但是略高于美國的另一個研究中報道的人群（n=224）尿液中一氯BPA的平均濃度（0.083ng/mL,未研究其他氯代 BPA）［21］和法國人群（n=10）尿液中四種氯代BPA的濃度水平（一氯BPA、二氯BPA、三氯BPA、四氯BPA的平均濃度分別為0.06,0.02, 0.21,0.09ng/mL）［8］.

研究發(fā)現(xiàn),氯代 BPA廣泛存在于我國主要省會城市的飲用水中［3］,一氯 BPA和二氯 BPA的檢出率接近100%,三氯、四氯BPA檢出率分別為60%和50%,這與尿液中三氯、四氯BPA檢出率低于一氯、二氯 BPA的趨勢相似.一氯和二氯 BPA在尿液和飲用水中均為氯代BPA最主要的組成形式（圖 3）,說明飲用水可能是氯代BPA的來源之一.但是尿液中氯代BPA的組成比例顯著大于飲用水,氯代 BPA可能有其他暴露途徑.四氯 BPA的檢出率和濃度水平高于三氯BPA.四種氯代BPA中,只有四氯BPA是工業(yè)產(chǎn)品,主要作為阻燃劑添加于環(huán)氧樹脂、酚醛樹脂中,有可能通過各種途徑進入環(huán)境,從而可能導(dǎo)致了人體尿液中四氯 BPA的暴露量高于飲用水中的貢獻.

研究發(fā)現(xiàn),一氯、二氯BPA的雌激素活性要高于BPA本身,4種氯代BPA的雌激素活性分別為BPA的7.40、4.19、0.58、0.11倍［3］由此計算出尿液樣品的BPA等當(dāng)量濃度為6.14ng/mL,約為尿液中 BPA和 4種氯代 BPA的濃度總和（2.75ng/mL）的2.2倍（圖4）.經(jīng)SPSS（v18.0）軟件中的 Shapiro-Wilk檢驗,得到本研究的40個尿液BPA等當(dāng)量濃度服從對數(shù)正態(tài)分布,幾何均值2.67ng/mL,幾何標(biāo)準(zhǔn)差為2.38ng/mL,分布函數(shù)如式（1）所示：

式中： x表示尿液BPA等當(dāng)量濃度.

圖3　40個人體尿液樣品中BPA及氯代BPA的濃度水平及比例Fig.4　Concentrations and proportion of Bisphenol A and chlorinated analogues in 40 human urine samples

氯代BPA在尿液中的高檢出率、高總濃度和高等當(dāng)量濃度表明氯代BPA比BPA可能具有更大的健康風(fēng)險,應(yīng)引起重視.

圖4　尿液濃度（A）和BPA等當(dāng)量濃度（B）比較Fig.4　Comparison of urine concentration （A） with toxic equivalent quantity （TEQBPA） in urine （B）

2.3BPA及氯代BPA的健康風(fēng)險評價

在人體中,經(jīng)口攝入的 BPA絕大部分會在24h內(nèi)由肝臟代謝成葡萄糖醛酸結(jié)合態(tài)和硫酸結(jié)合態(tài),并經(jīng)過尿液排出體外.經(jīng)口攝入是人體暴露BPA的最主要暴露途徑,占總暴露量的90%以上［22］.因此可以建立一個簡化的單室模型（式 1）,用式（2）從尿液BPA含量反演計算人體BPA日攝入劑量（EDI,μg/（kg?d））：

式中：Cu為尿液中 BPA類物質(zhì)的濃度（μg/L）,Vu為每日排尿量（L/d）,W為體重（kg）.參考國際放射性保護委員會（ICRP）的數(shù)據(jù),女性平均每天的排尿量為1.2L/d［23］.參考《中國人群暴露參數(shù)手冊》的數(shù)據(jù),中國成年女性平均體重為56.8kg［24］.假定氯代BPA在人體內(nèi)的代謝行為和BPA相同,根據(jù)尿液中氯代BPA總濃度和等當(dāng)量濃度的比例關(guān)系,計算出 BPA等當(dāng)量的 EDI為 0.125μg/ （kg?d）.

已有報道的BPA毒性終點包括體重減少、子宮和子代重量減少、影響子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等［25-27］.其中,美國EPA、FDA等多家機構(gòu)將體重減少作為毒性終點,其NOEAL值為5mg/（kg?d）,并根據(jù)公式（3）計算得到日允許攝入量（TDI, mg/（kg?d））為50μg/（kg?d）［28-29］：

式中：UF為不確定系數(shù),包含 10倍種間差和10倍的個體差異.北京婦女中的BPA等當(dāng)量攝入量遠低于TDI值,超過TDI值的概率＜0.01%,處于較低的風(fēng)險水平.

除了體重減少之外,美國國家毒理學(xué)項目組（NTP）專家組2012年提出了人體BPA暴露可能引起糖尿病發(fā)生［30］.許多動物實驗研究也表明,BPA通過干擾胰島素耐受性、損壞血糖穩(wěn)態(tài)和胰島細胞功能等而誘發(fā)糖尿病的發(fā)生［31-33］.另有研究發(fā)現(xiàn)BPA暴露能夠造成小鼠脂肪細胞糖轉(zhuǎn)運功能異常,從而間接增加患糖尿病風(fēng)險［34］.2008年Lang等［35］基于包括1455個樣本的橫斷面研究,發(fā)現(xiàn)了尿液BPA濃度與糖尿病的發(fā)生具有顯著相關(guān)關(guān)系.Silver等［36］利用同樣的樣本庫,將樣本量增加到4389例,建立了尿液中BPA濃度與糖尿病發(fā)生率之間的劑量效應(yīng)關(guān)系（表4）.

表4　文獻中BPA尿液濃度與糖尿病的關(guān)系［36］Table 1　Relationship between urine BPA level and diabetes

本研究采用了該文獻［36］中所建立的劑量效應(yīng)關(guān)系（表4）.借鑒二噁英等物質(zhì)對劑量區(qū)間的處理方法［37］,本研究取表4中尿液BPA區(qū)間濃度的平均值,和最高濃度的2倍,作為劑量（表4）.在此基礎(chǔ)上,利用 USEPA的 Benchmark軟件（BMDS V2.4）對糖尿病發(fā)生為終點的尿液 BPA BMDL5（發(fā)病風(fēng)險增加 0.05%對應(yīng)的濃度）進行了計算.并在計算過程中嘗試采用了 Logistic、Probit和Quantal-Linear 3種模型進行擬合,結(jié)果表明Quantal-linear模型擬合效果最好, BMDL5為5.7ng/mL.本研究40個尿液樣本BPA等當(dāng)量濃度符合對數(shù)正態(tài)分布,頻率分布如圖5所示：

圖5　北京40個女性尿液BPA等當(dāng)量濃度的頻率分布Fig.4　Distribution of toxic equivalent quantity （TEQBPA）in 40 urine samples

利用尿液BPA等當(dāng)量濃度的頻率分布,可得到本研究中北京人體樣品尿液BPA等當(dāng)量濃度超過5.7ng/mL的概率為19.2%,說明目前的暴露BPA存在一定的糖尿病風(fēng)險.

3　結(jié)論

3.1建立了人體尿液樣品中 BPA及四種氯代BPA的有機相丹?；苌?UPLC-MS-MS檢測方法,其方法回收率為 62%～108%,檢出限為0.001～0.03ng/mL.

3.240個北京地區(qū)女性尿液樣品中的一氯BPA、二氯BPA、三氯BPA和四氯BPA的總濃度水平和BPA的濃度水平相仿.4種氯代BPA的BPA等當(dāng)量濃度是BPA濃度的2.2倍.

3.3尿液樣品的BPA等當(dāng)量濃度為6.14ng/mL,本研究人體樣品中有超過了BPA的糖尿病發(fā)生的閾值（0.05%發(fā)病風(fēng)險）的概率為19.2%.

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Levels and risk assessment of bisphenol A and chlorinated BPAs in urine samples of Beijing women.

CHEN Mo, FAN Zhan-lan, GAO Qun, GAO Fu-mei, MU Di, HU Jian-ying*（College of Urban and Environmental Sciences, Peking University, Beijing 100871, China）.

China Environmental Science, 2015,35（9）：2853～2860

A derivatization UPLC-MS-MS method was used to analyze bisphenol A （BPA） and its chlorinated derivatives, including monochloro-BPA, dichloro-BPA, tricholro-BPA, and tetrachloro-BPA, in 40urine samples of Beijing women. The detection frequencies of BPA, monochloro-BPA, dichloro-BPA, tricholro-BPA, and tetrachloro-BPA were 90%, 96%, 90%, 52%, and 45% with average concentrations of （1.30±1.24）, （0.40±0.37）, （0.41±0.51）, （0.18±1.49）, （0.46±0.35）ng/mL, respectively. While the total concentration of four chlorinated BPA was 1.45ng/mL, which was similar with that of BPA in urine, their BPA toxic equivalent quantity （TEQBaP） in urine was calculated to be 4.84ng/mL, which was 2.2 fold higher than that of BPA. The TEQBPAconcentration was log-normally distributed, and the probability higher than Benchmark Dose （BMDL0.05）, corresponding to the increasing risk of diabetes by 0.05% due to exposure to BPA, was 19.2%. Our results indicated that chlorinated BPA might pose a relatively high risk.

chlorinated BPA；DNS derivatization；daily intake estimates （EDI）；toxic equivalent quantity （TEQ）；LC-MS-MS

X503.1

A

1000-6923（2015）09-2853-08

2015-02-08

水體污染控制與治理科技重大專項（2014ZX07405001）

*責(zé)任作者, 教授, hujy@urban.pku.edu.cn

陳 默（1990-）,男,安徽懷遠人,北京大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院碩士研究生,主要從事環(huán)境和人體中雙酚A類物質(zhì)的行為研究.