余水靜，彭　濤，周　丹，潘　濤，董　偉，陳江安，邱廷省*（1.江西理工大學資源與環(huán)境工程學院，江西 贛州 341000；2.江西理工大學，江西省礦冶環(huán)境污染控制重點實驗室，江西 贛州 341000；3.江西理工大學，江西省礦業(yè)工程重點實驗室，江西 贛州 341000）

嗜酸硫桿菌雙組分信號轉導系統(tǒng)多樣性分析

余水靜1，2，彭濤1，2，周丹1，2，潘濤1，2，董偉1，2，陳江安1，3，邱廷省1，3*（1.江西理工大學資源與環(huán)境工程學院，江西 贛州 341000；2.江西理工大學，江西省礦冶環(huán)境污染控制重點實驗室，江西 贛州 341000；3.江西理工大學，江西省礦業(yè)工程重點實驗室，江西 贛州 341000）

為探索嗜酸硫桿菌（Acidithiobacillus）對極端礦山環(huán)境條件感知和反應分子機制的差異，利用生物信息學方法鑒定和分析了兩株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌、一株喜溫嗜酸硫桿菌和一株耐冷嗜酸硫桿菌的雙組分信號轉導系統(tǒng)（TCS）結構多樣性特征.結果表明，4株嗜酸硫桿菌擁有27～38個TCS蛋白，聚類分析顯示有16組配對的TCS族、4組孤兒組氨酸蛋白激酶（HK）和9組孤兒反應調節(jié)蛋白（RR），與其進化分支有較好的相關性；其中9個配對和5個不配對的TCS 蛋白族為嗜酸硫桿菌菌株所共有，其余特有TCS均在一個或幾個菌株中缺失.嗜酸硫桿菌菌株共有的TCS功能涉及氮素固定及代謝調節(jié)、檸檬酸/蘋果酸代謝調節(jié)等，特有TCS功能涉及如趨化性調控、重金屬響應、銅抗性調控等，這可能有助于菌株在極端礦山環(huán)境中生存.

嗜酸硫桿菌；雙組分信號轉導系統(tǒng)；多樣性分析

嗜酸硫桿菌（Acidithiobacillus）可通過氧化硫和還原態(tài)無機硫化物獲得能量，能在極酸（pH 值1～3）、高濃度重金屬環(huán)境中生長繁殖［1］，已廣泛應用于生物冶金、生物脫硫和含硫廢水的處理等領域.

嗜酸硫桿菌屬主要代表菌有中溫嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（A. ferrooxidans）、喜溫嗜酸硫桿菌（A. caldus）和耐冷嗜酸硫桿菌（A. ferrivorans）. A. ferrooxidans為專性好氧菌，最佳生長 pH值為2～2.5，最佳生長溫度 28～35℃，能耐受多種重金屬［2］； A. caldus能在含砷、含重金屬離子、45℃和pH 1.6的極端環(huán)境中旺盛生長［3］；A. ferrivorans為兼性厭氧菌，能在7℃條件下浸出多金屬硫化礦［4］.由此可見，嗜酸硫桿菌各菌株生存的極端環(huán)境條件具有明顯差異.

細菌在生長繁殖過程中，需對變化的環(huán)境條件進行感知和反應，通常這個功能是由雙組分信號轉導系統(tǒng)（Two-component signal transduction system，TCS）來完成的.雙組分信號轉導系統(tǒng)由組氨酸蛋白激酶（Histidine protein kinase，HK）和反應調節(jié)蛋白（Response regulator protein，RR）組成［5］，具有參與調控細胞生長、分化、代謝、滲透調節(jié)、致病性、趨化性及耐藥性等多種重要生物學功能.

許多科學工作者試圖從基因組學角度探究微生物遺傳型和表型之間的相關性，從生物信息學角度揭示嗜酸硫桿菌 TCS的多樣性特征，理解這些菌株對多變極端環(huán)境條件響應的分子機制.然而，目前嗜酸硫桿菌TCS多樣性方面的研究國內外還鮮見.

嗜酸硫桿菌基因組測序已完成的有 A. ferrooxidans、A. caldus和A. ferrivorans菌株［6-8］，因此，本研究擬對已測序的 4株嗜酸硫桿菌菌株（A. ferrooxidans ATCC 23270、A. ferrooxidans ATCC 53993、A. caldus SM-1、A. ferrivorans SS3）的TCS進行發(fā)掘鑒定，并從 TCS的聚類和進化關系、功能域、共有和特有TCS功能分析等方面闡釋嗜酸硫桿菌TCS多樣性特征.

1　材料與方法

1.1基因組數據收集

表1　四株已測序的嗜酸硫桿菌基因組信息Table 1　The information of four sequenced Acidithiobacillus genomes used in this study

從美國國立生物技術信息中心網站（National Center for Biotechnology Information，NCBI）收集4株嗜酸硫桿菌A. ferrooxidans ATCC 23270、A. ferrooxidans ATCC 53993、A. caldus SM-1、A. ferrivorans SS3的基因組信息（包括后綴名為.ffn、.faa、.ptt三種類型文件），見表1.

1.2HK和RR鑒定

根據Song等［9］報道的方法鑒定4株嗜酸硫桿菌包括 A. ferrooxidans ATCC 23270、A. ferrooxidans ATCC 53993、A. caldus SM-1、A. ferrivorans SS3菌株的HK和RR.方法如下：將嗜酸硫桿菌的.faa文件提交至Pfam蛋白序列數據庫［10］進行批量搜索（Cut-off選擇 Gathering threshold），其中HK預測不設e值，RR預測設e值為1e-6.在返回的結果中用PF00512、PF07568、PF07730、PF07536、PF06580、PF01627、PF02895（HK的保守結構域）搜索可能的 HK，用PF00072（RR的保守結構域）搜索RR［9］.

然后將獲得的HK和RR序列提交NCBI網站的BLASTp程序在線比對，根據以下原則確認HK和RR：（1） 催化結構域HATPase_c必須位于HK的C-末端（末端2/3）；（2） HATPase_c的上游具有H-box；（3） RR的N-末端通常具有磷酸受體結構域REC；（4） Response_reg結構域位于RR的C-末端.基因間距小于 300bp且轉錄同向的HK-RR鑒定為 HK-RR基因對（HK-RR gene pairs），同時擁有 HK 的磷酸轉移酶結構域（phosphotransferase domainn）和 RR磷酰基接受域（phosphoryl-accepting domain）的HK-RR為雜合蛋白（HK-RR Fusion），單個的HK或RR基因鑒定為“Orphan”［11］.

1.3TCS聚類分析與進化

利用OrthoMCL在線工具［12］對4株嗜酸硫桿菌聚類分析，將鑒定的 HK蛋白序列提交至OrthoMCL-DB數據庫比對，獲得HK蛋白的聚類分組，屬于同一聚類分組的HK蛋白鑒定為嗜酸硫桿菌共有TCS，在一株或幾株菌缺失的HK蛋白組鑒定為特有TCS.利用phylogeny.fr［13］工具對TCS的 HK序列進行多重序列比對并建立系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4HK功能域分析

HK 功能域采用 SMART分析［14］或BLASTp程序相似性比對分析［15］，應用TMHMM Server［16］分析HK蛋白跨膜結構區(qū)域. 從NCBI網站的Genebannk數據庫中獲取TCS功能信息.

2　結果與討論

2.1嗜酸硫桿菌TCS多樣性分布

利用保守結構域對 4株嗜酸硫桿菌菌株的TCS進行全基因組搜尋，結果表明，在4株嗜酸硫桿菌中，TCS蛋白總數為 27～38個，其中成對的TCS （HK-RR）為11～14對，孤兒HK和RR分別為2～5和3～9個，發(fā)現3個HK蛋白（Atc_1719、Acife_1338和Acife_1591）同時擁有RR磷?；邮苡?，為雜合蛋白（見表2）.

從表2可以看出，嗜酸硫桿菌A. ferrooxidans、A. caldus、A. ferrivorans菌種之間TCS數量差異較明顯；即使同一菌種不同菌株之間，如 A. ferrooxidans ATCC 23270和ATCC 53993在Orphan RR的數量上也有細微的差異，這可能與其生存環(huán)境條件及進化的不同有關.

表2　四株嗜酸硫桿菌雙組份信號轉導系統(tǒng)Table 2　Identification of the TCSs in four Acidithiobacillus strains

2.2嗜酸硫桿菌TCS聚類與進化分析

本研究對4株嗜酸硫桿菌的TCS蛋白聚類分析結果顯示，有 16組不同的 TCS族、4組 orphan HK和9組orphan RR （表3）.

在16個配對的TCS族中，9個TCS族為4株嗜酸硫桿菌菌株所共有，包括TCS-1、TCS-2、TCS-3、TCS-4、TCS-6、TCS-7、TCS-11、TCS-13、TCS-14；其余 7個 TCS 族（TCS-5、TCS-8、TCS-9、TCS-10、TCS-12、TCS-15、TCS-16）在一個或幾個菌株中缺失.如 TCS-9、TCS-12只存在于 A. ferrivorans SS3菌株中；TCS-15、TCS-16只存在于A. caldus SM-1菌株中.而TCS-5、TCS-10僅在A. caldus SM-1菌株中缺失；TCS-8在A. ferrooxidans菌株中缺失.對于不配對的 TCS蛋白，聚類分析顯示：Orphan HK2、Orphan HK3、Orphan RR4、Orphan RR5族為4株嗜酸硫桿菌菌株所共有，其余均在一個或幾個菌株中缺失（表3）.

利用phylogeny.fr工具對嗜酸硫桿菌TCS的HK構建了進化樹（圖1），從圖1中可以看出HK基因進化關系的遠近.通過對比嗜酸硫桿菌 TCS 中HK的進化關系和聚類分析，發(fā)現進化分支和聚類分組之間具有較好的相關性.

2.3嗜酸硫桿菌HK結構域組成及功能分析

根據Mascher等［17］的分類方法，HK蛋白可分為3個不同的組別：胞外敏感型HK、胞內敏感型HK和細胞膜敏感型HK.本研究中對嗜酸硫桿菌HK結構域組成分析發(fā)現：僅有TCS-1的HK蛋白屬于胞外敏感型HK；TCS-6、TCS-9、TCS-10、TCS-14的HK蛋白屬于細胞膜敏感型敏感型HK；其余TCS的HK蛋白屬于胞內敏感型HK（圖2）.

TCS-1、TCS-4、TCS-7、TCS-8、TCS-14、TCS-15的HK蛋白中含有PAS （Per-Arnt-Sim）結構域. PAS結構域作為傳感分子在感應外界環(huán)境中氧濃度、細胞氧化還原態(tài)或光強度中扮演著重要的角色［18］.大多數含有 PAS結構域的HK蛋白位于細胞內，通過感應細胞內外的氧化還原電位變化引起電子傳遞系統(tǒng)的改變來監(jiān)控細胞內外環(huán)境［19］.此外，TCS-8的 HK蛋白中還含有PAC （proxy auto-config）結構域，PAC結構域常與PAS結構域結合形成保守的三維PAS折疊［20］.

表3　嗜酸硫桿菌TCS聚類分析Table 3　Ortholog analysis of the TCS proteins in the four Acidithiobacillus strains

圖1　利用phylogeny.fr構建的嗜酸硫桿菌HK進化樹.Fig.1　Phylogenetic tree of the identified putative HKs inthe Acidithiobacillus strains using the web tool. phylogeny. fr

TCS-1、TCS-2、TCS-3、TCS-12、TCS-13、TCS-16的 HK蛋白及 Orphan HK2、Orphan HK3、Orphan HK4中均含有HAMP （Histidine kinases，Adenylyl cyclases，Methyl-accepting chemotaxis proteins and Phosphatases）結構域. HAMP扮演著跨膜螺旋和信號傳送區(qū)域連接器的角色［21］.

圖2　嗜酸硫桿菌雙組分信號轉導系統(tǒng)中HKs結構域Fig.2　Domain architectures of histidine kinases representativeof TCS clusters in the Acidithiobacillus

2.4嗜酸硫桿菌共有TCS蛋白及功能分析

親緣關系密切的微生物菌株TCS蛋白序列是保守的［22-24］.在不同的細菌中，保守的 TCS一方面可能維持基本生物學功能，另一方面對于存在于特殊生境中的一些細菌也可能進化成新的功能.

本研究中聚類分析發(fā)現有 4株嗜酸硫桿菌菌株所共有TCS的 HK蛋白族包括 TCS-1、TCS-2、TCS-3、TCS-4、TCS-6、TCS-7、TCS-11、TCS-13、TCS-14、Orphan HK2、Orphan HK3.

對嗜酸硫桿菌共有的 TCS功能注釋（來自NCBI數據庫，見表 4）進行分析，發(fā)現 TCS-1、TCS-4、TCS-13涉及氮素固定及代謝調節(jié)；TCS-1、TCS-7響應環(huán)境中光和氧的變化；TCS-2、TCS-3響應環(huán)境滲透壓脅迫；TCS-4、TCS-6、TCS-7、Orphan HK3可對滲透壓敏感型K離子通道調節(jié)；TCS-7、TCS-14可響應磷酸鹽饑餓及磷酸鹽代謝；TCS-13涉及檸檬酸/蘋果酸代謝調節(jié)；TCS-14參與鞭毛生物合成調控；Orphan HK2、Orphan HK3參與氨基糖代謝調控（表4）.分析發(fā)現這些共有功能與嗜酸硫桿菌基本生物學功能和主要表型特征相關.

表4　嗜酸硫桿菌TCS功能小結Table 4　A brief summary of known/putative functions of the TCSs in Acidithiobacillus strains

2.5嗜酸硫桿菌特有TCS 蛋白及功能分析

特有TCS只存在于在一個或幾個菌株中，體現了細菌對復雜環(huán)境因素響應的多樣性，一般與某些特別的生物代謝途徑和環(huán)境適應相關，如產抗生素、耐受性、毒力等方面.

本研究中聚類分析發(fā)現 TCS-5、TCS-8、TCS-9、TCS-10、TCS-12、TCS-15、TCS-16、 Orphan HK1、Orphan HK4、Orphan RR1、Orphan RR2、Orphan RR3、Orphan RR6、Orphan RR7、Orphan RR8、Orphan RR9族均在嗜酸硫桿菌一個或幾個菌株中缺失，為特有TCS蛋白（表3）.

TCS-9、TCS-12只存在于A. ferrivorans SS3菌株中，涉及細胞間信號傳遞、重金屬響應，銅抗性調控等功能；TCS-15、TCS-16只存在于 A. caldus SM-1菌株中，涉及極性鞭毛生物合成調控等功能；TCS-5、TCS-10存在于A. ferrivorans SS3、A. ferrooxidans ATCC 23270和ATCC 53993菌株中，僅在A. caldus SM-1菌株中缺失，涉及滲透壓脅迫響應、氧化還原電位響應等功能；而TCS-8存在于A. ferrivorans SS3、A. caldus SM-1菌株中，在A. ferrooxidans ATCC 23270和ATCC 53993菌株中缺失，涉及對環(huán)境中光和氧的響應，滲透壓敏感型 K離子通道調節(jié)等功能； Orphan HK1、Orphan HK4僅存在于A. caldus SM-1菌株中，涉及趨化性調控，細胞運動與分泌調控、滲透壓脅迫響應等功能（表4）.

特有TCS功能分析顯示出嗜酸硫桿菌菌種間TCS的多樣性特征，反映出嗜酸硫桿菌屬不同菌種對其特定生存環(huán)境條件響應機制的差異.

3　結論

3.1鑒定和比較了4株嗜酸硫桿菌TCS，發(fā)現嗜酸硫桿菌菌種之間TCS數量差異較明顯，即使同一菌種不同菌株之間在數量上也有細微的差異.這些TCS基因分散在基因組中，并不局限于某一區(qū)域，暗示著嗜酸硫桿菌存在著一個復雜的調控網絡.

3.2嗜酸硫桿菌包含已知功能結構域有HAMP、HATPase_c、HisKA、HPT、PAC、PAS、CheW、REC、Trans_regC等，這些結構域可感應環(huán)境中氧濃度、氧化還原電位、光強度等的變化，從而調控其多種生理生化過程來適應外界環(huán)境的變化.

3.3聚類分析鑒定了4株嗜酸硫桿菌共有TCS和特有TCS，其中特有TCS功能體現了嗜酸硫桿菌 TCS的多樣性特征，如極性鞭毛生物合成調控、趨化性調控、重金屬響應、銅抗性調控等，反映出嗜酸硫桿菌屬不同菌種對其特定生存環(huán)境條件響應機制的差異.

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Diversity analysis of two-component signal transduction systems in the genus Acidithiobacillus.

YU Shui-jing1，2，PENG Tao1，2，ZHOU Dan1，2，PAN Tao1，2，DONG Wei1，2，CHEN Jiang-an1，3，QIU Ting-sheng1，3*（1.School of Resources and Environment，Jiangxi University of Science and Technology，Ganzhou 341000，China；2.Jiangxi Key Laboratory of Mining and Metallurgy Environmental Pollution Control，Jiangxi University of Science and Technology，Ganzhou 341000 China；3.Jiangxi Key Laboratory of Mining Engineering，Jiangxi University of Science and Technology，Ganzhou 341000，China）.

China Environmental Science，2015，35（7）：2146～2152

To investigate the difference in the molecular mechanism of the genus Acidithiobacillus responding to extreme mine environment，two A. ferrooxidans strains，one A. caldus strain and one A. ferrivorans strain were analyzed in the diversity of two-component signal transduction systems （TCS） by using the bioinformatics method. The results showed that 27～38 TCS proteins were respectively identified from the four Acidithiobacillus strains. These TCS proteins were clustered into 16 paired groups，four groups of orphan histidine protein kinases，and nine groups of orphan response regulator proteins，demonstrating significant correlationship with their evolutionary branches. Among TCS proteins，nine groups of paired TCSs and five groups of non-paired TCSs were shared by the four strains of Acidithiobacillus，while the other TCSs were absent at least in one strain. Common TCS proteins of the four strains played basic biological roles including nitrogen fixation and citrate/malate metabolism regulation. Specific TCS proteins got involved in chemotaxis regulation，heavy metal response，and copper resistance regulation，which might contribute to survival of bacterial strains under the extreme mine environment.

Acidithiobacillus；two-component signal transduction system；diversity analysis

X172

A

1000-6923（2015）07-2146-07

2014-12-20

國家自然科學基金資助項目（51474114）；江西省科技廳科技支撐計劃項目（20121BBG70004）；江西省教育廳科技項目（GJJ13397）

* 責任作者，教授，qiutingsheng@163.com

余水靜（1976-），男，江西樟樹人，副教授，博士，主要從事環(huán)境微生物學及基因組學等領域研究.