郭向陽(yáng)，王友明，高　陽(yáng)，聞?wù)?，關(guān)麗萍，曲有樂(lè)

（1.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山　316022；2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州　310058；3.浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山　316022）

硒化低聚氨基多糖制備工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

郭向陽(yáng)1，王友明2，高陽(yáng)3，聞?wù)?，關(guān)麗萍1，曲有樂(lè)1

（1.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022；2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058；3.浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山316022）

硒化低聚氨基多糖（LSA）是由免疫活性的硒和低聚氨基多糖（LA）化合而成的硒多糖。通過(guò)正交試驗(yàn)，探討了氨基多糖硒化修飾的最佳工藝條件，當(dāng)硒化劑添加量為1.2 g，反應(yīng)溫度70℃，pH=3，反應(yīng)時(shí)間8 h；硒化低聚氨基多糖中硒含量為27.3 mg/g。當(dāng)硒化低聚氨基多糖濃度為4 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH、羥基自由基、超氧陰離子清除率分別為84.8%、71.6%、51.8%，還原力為0.33，硒化低聚氨基多糖的抗氧化能力要強(qiáng)于低聚氨基多糖。

低聚氨基多糖；硒化；抗氧化

低聚氨基多糖是將蝦、蟹殼中的甲殼素通過(guò)脫乙?；@得的一種動(dòng)物多糖，具有良好的生物活性和醫(yī)學(xué)性能。甲殼素是天然有機(jī)化合物中數(shù)量?jī)H次于纖維素的一大類含氮有機(jī)化合物［1］，因此低聚氨基多糖具有很好的開(kāi)發(fā)前景。硒是人體必需的微量元素，有預(yù)防心血管疾病、克山病、抑制癌癥、抗衰老、抑炎等作用［2］，補(bǔ)硒有助于提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)體質(zhì)的功效。硒的存在形式分為無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒兩種，無(wú)機(jī)補(bǔ)硒劑像亞硒酸鈉其活性和毒性范圍窄，且不易被人體吸收，其應(yīng)用受到限制，相對(duì)而言有機(jī)硒毒性低、副作用小，更易被人體吸收，能夠更好地發(fā)揮硒的生理活性［3］。

因此該研究將硒與低聚氨基多糖有機(jī)結(jié)合使之轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒化合物硒化低聚氨基多糖，既保持了多糖的基本構(gòu)型和生理功能，且硒的毒性和副作用大大降低，更易被人體吸收。本文對(duì)硒化低聚氨基多糖制備工藝進(jìn)行優(yōu)化并研究其抗氧化活性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

低聚氨基多糖，購(gòu)于浙江金殼生物化學(xué)有限公司。冰醋酸、亞硒酸鈉硝酸、高氯酸、鹽酸、EDTA-2Na、鹽酸羥胺、鄰苯二胺、甲苯；抗壞血酸、無(wú)水乙醇、DPPH（阿拉?。eSO4·7H2O、H2O2、水楊酸、Tris-HCl、鄰苯三酚、PBS、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3以上均為國(guó)藥試劑分析純。

1.2儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)，UV-1100，上海美譜達(dá)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，N-1100，EYELA；精密pH計(jì)，PHS-3C，上海虹益儀器儀表有限公司；冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)D-1000，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；恒溫磁力攪拌器，常州國(guó)華電器有限公司；分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1硒化低聚氨基多糖的制備

稱取1.0 g低聚氨基多糖溶于50 mL 2%醋酸水溶液中，攪拌溶解，至溶液澄清，取適量亞硒酸鈉溶于少量水中緩慢加入到低聚氨基多糖溶液中，一定溫度條件下磁力攪拌一定時(shí)間后，反應(yīng)液透析2 d，以抗壞血酸檢測(cè)透析液，不顯紅色即可，減壓濃縮至適當(dāng)體積，冷凍干燥，即得硒化低聚氨基多糖［4-5］。

1.3.2單因素試驗(yàn)

測(cè)定不同反應(yīng)液pH，反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、硒化劑添加量對(duì)硒化低聚氨基多糖中硒含量的影響［6］。

1.3.2.1反應(yīng)溶液pH對(duì)硒含量的影響

以硒化劑添加量0.8 g，反應(yīng)時(shí)間8 h，溫度60℃，反應(yīng)體系pH依次設(shè)為3、3.5、4、4.5、5，按本文1.3.1試驗(yàn)方法操作以硒化低聚氨基多糖中硒含量為指標(biāo)，研究反應(yīng)溶液pH對(duì)硒化低聚氨基多糖中硒含量的影響。

1.3.2.2反應(yīng)時(shí)間對(duì)硒含量的影響

以硒化劑添加量0.8 g，pH調(diào)為3.5，溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間依次設(shè)為2、4、6、8、10、12 h，按本文1.3.1試驗(yàn)方法操作以硒化低聚氨基多糖中硒含量為指標(biāo)，研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)硒含量的影響。

1.3.2.3反應(yīng)溫度對(duì)硒含量的影響

以硒化劑添加量0.8 g，反應(yīng)時(shí)間8 h，pH調(diào)為3.5，反應(yīng)溫度分別為20、30、40、50、60、70、80℃，按

1.3.1試驗(yàn)方法操作，以硒化低聚氨基多糖中硒含量為指標(biāo)，研究反應(yīng)溫度對(duì)硒含量的影響。

1.3.2.4硒化劑添加量對(duì)硒含量的影響

將反應(yīng)液pH調(diào)為3.5，溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間8 h，硒化劑添加量依次為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g，按本文

1.3.1試驗(yàn)方法操作以硒化低聚氨基多糖中硒含量為指標(biāo)，研究加硒量對(duì)硒含量的影響。

1.3.3正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)立四因素三水平正交試驗(yàn)［7］，加硒量選取0.4 g、0.8 g、1.2 g，反應(yīng)溫度選取50℃、60℃、70℃，反應(yīng)時(shí)間選取6 h、8 h、10 h，pH依次設(shè)為3、3.5、4，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.1　The levels and factors of the orthogonal test

1.3.4硒化低聚氨基多糖中硒含量的測(cè)定

1.3.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取硒粉0.1 g，置于小燒杯中，加硝酸10 mL。在水浴中溶解，放冷，定量轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，加純水稀釋至刻度，搖勻，備用。取備用液1 mL，置250 mL量瓶中，加純水定容，搖勻，即得硒標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置棕色瓶中，放冰箱保存?zhèn)溆茫舛龋? μg/mL）。準(zhǔn)確吸取硒標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2、4、6、8、10、12 mL，分別置于100 mL三角燒瓶中，加水至25 mL，用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH=2，加1%鄰苯二胺溶液2 mL，搖勻，避光放置2 h，加甲苯10 mL，用力振搖2 min，萃取，靜置10 min，用移液器吸取甲苯層，以不含樣品的甲苯液為空白對(duì)照，以335 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定吸光度值。以濃度對(duì)吸收度進(jìn)行回歸。

1.3.4.2樣品中硒含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.05 g樣品置于50 mL錐形瓶，加入混酸HClO4+HNO3（1：4）10 mL，加蓋隔夜消化，次日電熱板加熱消化，保持低溫微沸狀態(tài)至溶液清澈透明（加熱至瓶?jī)?nèi)產(chǎn)生濃白煙），稍冷后加10 mL 6 mol/L HCl，繼續(xù)加熱至瓶?jī)?nèi)產(chǎn)生濃白煙，取下放冷、轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容備用。吸取消解液5 mL，放于100 mL三角燒瓶中，加水補(bǔ)至25 mL，以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，根據(jù)樣品吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算Se含量。

1.3.5硒化低聚氨基多糖體外抗氧化試驗(yàn)

1.3.5.1硒化低聚氨基多糖，低聚氨基多糖對(duì)DPPH自由基的清除

用0.1 mol/L稀醋酸配制硒化低聚氨基多糖，低聚氨基多糖，濃度依次為（0.5、1、2、3、4 mg/mL），取4 mg DPPH用無(wú)水乙醇定容100 mL，分別吸取2 mL樣品溶液置于試管內(nèi)，然后加入2 mL DPPH，搖勻，黑暗中靜置30 min，517 nm測(cè)定吸光度，并以下式計(jì)算其清除率：

清除率（%）=［A0-（Ai-Aj）］/A0×100%，A0是對(duì)照組，Ai是樣品組，Aj是空白組。

1.3.5.2硒化低聚氨基多糖，低聚氨基多糖對(duì)羥基自由基的清除

分別取1 mL不同濃度的硒化低聚氨基多糖，低聚氨基多糖溶液，分別加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL，再加入6 mmol/L水楊酸溶液1 mL，混勻，然后加入6 mmol/L H2O21 mL啟動(dòng)反應(yīng)，避光靜置30 min后于510 nm處測(cè)定吸光度Ai，以不加水楊酸的為Aj，樣品溶液以蒸餾水代替測(cè)定A0，羥基自由基清除率計(jì)算公式同1.3.5.1［11］。

1.3.5.3硒化低聚氨基多糖，低聚氨基多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除

取0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH=8.2）4.5 mL，置于25℃水浴鍋中預(yù)熱25 min，分別加入1 mL樣品溶液和0.12 mL 10 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻，在25℃水浴中反應(yīng)5 min，加入1 ml 8 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，于299 nm處測(cè)吸光度?？瞻捉M以0.1 mol/L HAc代替多糖溶液。

1.3.5.4硒化低聚氨基多糖，低聚氨基多糖還原能力的測(cè)定

取1 mL樣品溶液，加入pH=6.6的磷酸緩沖溶液2.5 mL、1%鐵氰化鉀2.5 mL，混勻，于50℃水浴中保溫20 min，再加入10%的三氯乙酸2.5 mL，混勻以3 000 r/min離心10 min，移取上清液2.5 mL于試管中，加蒸餾水2.5 mL和0.1%FeCl3 0.5mL，常溫反應(yīng)5 min后于700 nm處測(cè)定吸光度Ai，對(duì)照組溶液A0，空白組Aj［12-13］。

2　結(jié)果與討論

2.1硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

以硒含量對(duì)吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.212 x+0.006，R2=0.9995。

2.2單因素試驗(yàn)分析

2.2.1反應(yīng)液pH對(duì)硒含量的影響

隨著醋酸添加量的增加，反應(yīng)液pH降低，硒化反應(yīng)更易進(jìn)行，硒含量不斷增加，當(dāng)pH達(dá)到3時(shí)，硒含量達(dá)到15.1 mg/g，由于考慮到實(shí)際應(yīng)用中醋酸的消耗，設(shè)定最小pH為3。

2.2.2反應(yīng)時(shí)間對(duì)硒含量的影響

從0～8 h，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，硒化反應(yīng)進(jìn)行的更充分，但在8 h之后，硒含量逐步降低，可能由于反應(yīng)液在較高溫度，較酸環(huán)境下，低聚氨基多糖不斷降解，低分子量的硒化低聚氨基多糖在透析時(shí)流失，導(dǎo)致最終硒含量逐漸降低。

2.2.3反應(yīng)溫度對(duì)硒含量的影響

從圖3可以得出隨著反應(yīng)溫度的上升，硒化低聚氨基多糖中的硒含量不斷上升，在50～70℃上升比較明顯，超過(guò)70℃硒含量則上升的比較緩慢，考慮到實(shí)際功耗，選擇50、60、70℃作為優(yōu)化反應(yīng)的三個(gè)溫度。

2.2.4硒化劑添加量對(duì)硒含量的影響

從圖4中可以得出，隨著硒化劑添加量的增加，最終硒化低聚氨基多糖中的硒含量不斷上升，但在加硒量超過(guò)1.2 g時(shí)，增加比緩慢，硒利用率逐步降低。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)極差R分析，硒含量影響因素主次順序?yàn)闇囟?pH>加硒量>反應(yīng)時(shí)間，最優(yōu)組合A3B3C1D2，即當(dāng)反應(yīng)條件為1.2 g，70℃，pH=3，8 h，硒含量27.3 mg/g，硒化率0.05（表2）。

硒化率影響因素主次順序，溫度>加硒量>pH>反應(yīng)時(shí)間，最優(yōu)組合A1B3C1D2即0.4 g，70℃，pH=3，8 h，硒含量18.19 mg/g，硒化率達(dá)到0.099。

圖1　pH對(duì)硒含量的影響Fig.1　Effect of pH on selenium content

圖2　反應(yīng)時(shí)間對(duì)硒含量的影響Fig.2　Effect of time on selenium content

圖3　反應(yīng)溫度對(duì)硒含量的影響Fig.3　Effect of temperature on selenium content

圖4　硒化劑添加量對(duì)硒含量的影響Fig.4　Effect of selenium addition on selenium content

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2　The design and result of the orthogonal test

2.4體外抗氧化試驗(yàn)

2.4.1清除DPPH自由基能力測(cè)定

從圖5可以看出，硒化低聚氨基多糖和低聚氨基多糖和對(duì)DPPH自由基均有不同程度的抑制作用，且均隨著多糖濃度（0.5～4 mg/mL）增加而增強(qiáng)，在4 mg/ mL時(shí)硒化低聚氨基多糖和低聚氨基多糖對(duì)DPPH自由基清除率分別達(dá)到84.8%和75.2%。

圖5　LSA、LA對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.5　Scavenging effects of LSA and LA on DPPH free radical

2.4.2清除羥基自由基能力測(cè)定

從圖6可以看出，硒化低聚氨基多糖和低聚氨基多糖對(duì)羥基自由基均有不同程度的清除作用，且均隨著多糖濃度（0.5～4 mg/mL）內(nèi)增加而增強(qiáng)，硒化低聚氨基多糖和低聚氨基多糖在4 mg/mL對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到71.6%和63.3%。

2.4.3清除超氧陰離子自由基能力測(cè)定

從圖7可以看出，硒化低聚氨基多糖和低聚氨基多糖對(duì)超氧陰離子自由基均有不同程度的清除作用，且均隨著多糖濃度（0.5～4 mg/mL）內(nèi)增加而增強(qiáng)，硒化低聚氨基多糖和低聚氨基多糖在4 mg/mL對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到51.8%和44.8%。

圖6　LSA、LA對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.6　Scavenging effects of LSA and LA on hydroxyl radicals

2.4.4還原力能力的測(cè)定

從圖8可以看出，硒化低聚氨基多糖和低聚氨基多糖都有一定的還原能力，且均隨著多糖濃度（0.5～4 mg/mL）內(nèi)增加而增強(qiáng)，硒化低聚氨基多糖和低聚氨基多糖在4 mg/ml時(shí)還原力達(dá)到0.33和0.26。

圖7　LSA、LA對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.7　Scavenging effects of LSA and LA on superoxide anion free radical

圖8　LSA、LA還原力能力的測(cè)定Fig.8　Reducing power of LSA and LA

3　結(jié)論

在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，影響硒含量的因素順序?yàn)闇囟龋緋H＞加硒量＞反應(yīng)時(shí)間，影響硒轉(zhuǎn)化率的順序?yàn)闇囟龋炯游浚緋H＞反應(yīng)時(shí)間，最高硒含量27.3 mg/g，另外對(duì)硒化低聚氨基多糖的進(jìn)行抗氧化活性的研究表明，硒化低聚氨基多糖對(duì)DPPH，羥基自由基具有良好的清除作用，硒化低聚氨基多糖的抗氧化能力要強(qiáng)于低聚氨基多糖，且具有一定的還原力。

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Preparation of Seleno-aminopolysaccharide and Study on its Antioxidant Activity

GUO Xiang-yang1，WANG You-ming2，GAO Yang3，et al
（1.Food and Pharmacy School of Zhejiang Ocean University，Zhoushan316022；2.College of Animal Science，Zhejiang University，Hangzhou310058；3.Fishery School of Zhejiang Ocean University，Zhoushan316022，China）

Low molecular seleno-aminopolysaccharide（LSA）is organic selenium compounds consisted of inorganic selenium and low molecular aminopolysaccharide（LA）.The optimal selenium modification conditions of low molecular aminopolysaccharide was studied by orthogonal experiment.When the dosage of selenium agent was 1.2 g，the temperature was 70℃，pH=3，and reaction time was 8 h，the selenium content was 27.3 mg/g.The scavenging rate ofDPPH free radical，hydroxyl radicals and superoxide anion free radical was 84.8%，71.6%and 51.8%and the reduction ability was 0.33 when the LSA concentration was 4 mg/mL.The antioxidant capability of LSA was stronger than that of LA.

aminopolysaccharide；selenium modification；antioxidant activity

Q539

A

1008-830X（2015）03-0216-06

2014-09-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301982）；浙江海洋學(xué)院2012年科研計(jì)劃項(xiàng)目（面上項(xiàng)目）（X12M05）；浙江海洋學(xué)院科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目；浙江海洋學(xué)院校級(jí)重大項(xiàng)目（X12ZD08）；浙江省教育廳2013年度科研計(jì)劃項(xiàng)目（Y201328199）

郭向陽(yáng)（1987-），男，河南洛陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向：海洋天然產(chǎn)物與健康.

聞?wù)?，男，副教授，博士，研究方向：海洋天然產(chǎn)物與健康.E-mail：ashun789@163.com.