張蕾萍，黃 霜，舒翠霞，任昕昕，崔冠峰，欒玉靜，杜鴻雁

（1.公安部物證鑒定中心 北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術(shù)研究中心，北京 100038；2.泰州市公安局，江蘇 泰州225300；3.蘇州市公安局，江蘇 蘇州 215000）

UPLC/MS/MS檢驗尿液中的扎來普隆和5-氧-扎來普隆

張蕾萍1，黃 霜2，舒翠霞3，任昕昕1，崔冠峰1，欒玉靜1，杜鴻雁1

（1.公安部物證鑒定中心 北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術(shù)研究中心，北京 100038；2.泰州市公安局，江蘇 泰州225300；3.蘇州市公安局，江蘇 蘇州 215000）

目的 建立尿液中扎來普隆和5-氧-扎來普隆的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢驗法。方法 尿液用乙腈直接沉淀蛋白并通過96孔板去磷酯后，選用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，以0.1%甲酸水（A相）和乙腈（B相）作為流動相，進行梯度洗脫分離。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的電噴霧電離，正離子模式掃描、多反應監(jiān)測（MRM）模式檢測扎來普隆及5-氧-扎來普隆，并用外標法定量。結(jié)果 該方法可有效分離尿液中的扎來普隆及5-氧-扎來普隆，保留時間分別為2.48min和1.96min，樣品檢驗時間僅需4min。尿液中扎來普隆及5-氧-扎來普隆分別在0.1～50ng/mL和0.25～50ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好，回歸方程分別為y=70393x+33700 和y= 34491x+16854，檢出限分別為0.05ng/mL和0.1ng/mL。扎來普隆及5-氧-扎來普隆的回收率均在90%以上，日內(nèi)與日間精密度均小于10%。結(jié)論 本文所建方法簡便、快速、分離度好，適用于尿液中的扎來普隆和5-氧-扎來普隆檢測。

法醫(yī)毒物分析；扎來普??；5-氧-扎來普??；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

DOΙ: 10.16467/j.1008-3650.2015.02.009

扎來普隆（zaleplon），商品名曲寧，是非苯二氮卓類催眠藥的代表藥物之一，由于吸收完全且迅速，催眠效果好，使用人群不斷增加。近年來法庭科學檢驗鑒定中出現(xiàn)此類毒物的頻率越來越多，由于其具有濫用性，2007年國際法庭毒理協(xié)會會議將扎來普隆列為新型濫用藥物之一。扎來普隆口服治療量為10～20mg，作用持續(xù)6h。其進入體內(nèi)后，迅速分布在所有組織，經(jīng)CYP3A4 酶代謝，轉(zhuǎn)化為非活性5-氧-扎來普隆等代謝產(chǎn)物，有極少部分（＜0.1%）以原藥形式從尿液排出［1］。在一些麻醉搶劫案中，由于案發(fā)至報案的時間間隔較長，原體已從體內(nèi)排出而使檢驗結(jié)果呈陰性，如果檢驗代謝物則能提高檢出率，還原案件的客觀情況。國外可見扎來普隆及其代謝物的液相色譜及免疫法檢驗研究［2］，國內(nèi)可見生物樣品中扎來普隆原體的液相色譜［3］、液相色譜-質(zhì)譜檢驗法［4，5］，國內(nèi)外均未見到扎來普隆及其代謝物液相色譜-質(zhì)譜檢驗方法的報道。

在麻醉搶劫案件中，尿液是最常用的檢材樣品之一，由于毒物在尿液中具有更長的檢驗時間窗口，因此尿液比血液或血清等更具有特殊優(yōu)勢。本文針對辦案需求，研究建立了尿樣中扎來普隆及其代謝物5-氧-扎來普隆的液相色譜-質(zhì)譜定性定量檢驗方法，以提高案件中扎來普隆的檢出率。該方法靈敏度高，檢出限低，可滿足日常檢案的需要。扎來普隆分子式為C17H15N5O，分子量為305，分子結(jié)構(gòu)見圖1。5-氧-扎來普隆分子式為C17H15N5O2，分子量為321，分子結(jié)構(gòu)見圖2。

圖1 扎來普隆分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of zaleplon

圖2 5-氧-扎來普 隆分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular structure of 5-O-zaleplon

1 材料與方法

1.1 試劑、材料和儀器

標準溶液的配制：扎來普隆和5-氧-扎來普隆對照品，含量 98%，購于加拿大Toronto化學公司，配制成1mg/mL乙腈溶液作為儲備液。精確量取標準儲備液1.0mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成100.0μg/mL的標準工作液。實驗中所用其它濃度的標準溶液均從上述標準工作溶液中用乙腈稀釋制備。

主要材料：96孔去磷酯板ISOLUTE?PLD+ 50mg 96孔板（瑞典Biotage公司）。

主要儀器：串聯(lián)質(zhì)譜儀API 5500 QTRAP（美國Applied Biosystems公司），配以離子源ESI，三重四極桿質(zhì)量分析器；液相色譜儀Shimadzu 30A-LC（日本Shimadzu公司）；Shimadzu 30A自動進樣器（日本Shimadzu公司）。

空白樣品：尿液，采自未服用過藥物的健康志愿者。

1.2 樣品及處理

取尿液0.2mL，加入0.8mL乙腈，混勻振蕩10min，8000rpm離心10min，取上清液400μL經(jīng)0.22μm有機膜過濾，濾液供儀器分析，剩余上清液過PLD+板，負壓抽真空過膜，濾液供儀器分析。

1.3 UPLC/MS/MS檢測

液相色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1mm×100mm，1.8μm） 柱；進 樣 量：2μL；流速：0.4mL/min；流動相A： 含0.1%甲酸水；流動相B：乙腈。梯度洗脫，洗脫條件見表1。

表1 液相色譜的梯度洗脫條件Table1 Gradient elution conditions of liquid phase

質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；離子化模式：ESI+，MRM掃描模式；離子源電壓：5500V；源溫度：600℃；氣簾氣：30psi，霧化氣：55psi，輔助氣：50 psi。

2 實驗部分

2.1 液質(zhì)條件的優(yōu)化選擇

扎來普隆和5-氧-扎來普隆用乙腈分別配制成50ng/mL的標準溶液，用針泵ESI+直接進樣，確定母離子的質(zhì)量數(shù)。在此基礎上選擇強度最大的前3個子離子，對碰撞能量CE值進行比較優(yōu)化，通過逐漸改變碰撞能量，使母離子強度約占最大子離子強度的1/3～1/4。最終選定母離子與強度最高的2個子離子，組成2對母/子離子對作為定性分析的指標，以最強離子對作為定量分析指標。在此基礎上逐步優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)。檢測離子對，去簇電壓，碰撞能量、保留時間見表2。

表2 扎來普隆及5-氧-扎來普隆的質(zhì)譜參數(shù)Table2 Mass spectrum parameters of zaleplon and 5-O-zaleplon

在液相條件的優(yōu)化中，本文比較了Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×100mm，1.7μm）和ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1mm×100mm，1.8μm）色譜柱，前者的5-氧-扎來普隆的峰形較寬且有拖尾，后者峰形陡峭良好，靈敏度較高（見圖3和圖4）。

圖3 Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱色譜圖Fig.3 Chromatogram of Waters BEH C18 column

圖4 ZORBAX Eclipse Plus C18柱色譜圖Fig.4 Chromatogram of Eclipse Plus C18 column

在流動相方面，本文比較了水（A）和乙腈（B）、0.1% 甲酸水（A）和0.1% 甲酸乙腈（B）、0.1% 甲酸水（A）和乙腈（B）三種流動相對分離檢測的影響。結(jié)果表明，使用第一種流動相時，溶劑效應對5-氧-扎來普隆的影響較大導致色譜峰變形，且保留時間不穩(wěn)定易飄移；采用第二種流動相0.1% 甲酸水（A）和0.1% 甲酸乙腈（B）時，兩目標物保留時間較近，不易完全分離。而采用乙腈-0.1% 甲酸水作為流動相，不僅兩目標物分離良好，而且可消除溶劑效應帶來的色譜峰變形和保留時間飄移現(xiàn)象，使色譜峰峰形良好，保留時間一致（見圖4）。此外，本文還比較了不同流動相梯度條件（流動相B的比例：①初始體積10%保持1min后，增至90%保持1min，下降至10%并保持2min；②初始體積10%保持1min后，增至50%保持1min，下降至10%并保持2min；③初始體積20%保持0.5min后，緩慢增至50%保持0.5min，下降至10%并保持2min）。最終確定梯度③的條件，確保兩目標物分離良好，且保留時間穩(wěn)定。

在選定的儀器條件下，扎來普隆及5-氧-扎來普隆具有良好的色譜峰，保留時間分別為2.48min和1.96min（見圖7和圖8）。在該色譜條件下分析尿樣無干擾，表明該方法具有較好專屬性，色譜峰的峰形及分離良好。

圖5 采用第一種流動相的色譜圖Fig.5 Chromatogram of 1st mobile phase

圖7 扎來普隆的提取離子流圖（RT 2.48min）Fig.7 Extract ion chromatograph of zaleplon （RT2.48min）

圖8 5-氧-扎來普隆的提取離子流圖（RT 1.96min）Fig.8 Extract ion chromatograph of 5-O-zaleplon （RT1.96min）

2.2 方法學考察

2.2.1 前處理方法PLD+96孔板的作用是去磷酯作用，本文比較了乙腈沉淀蛋白后和過PLD+96孔板后的樣品回收率。結(jié)果顯示，過PLD+96孔板后的平均回收率略高于乙腈沉淀蛋白的平均回收率 （見表3），說明乙腈沉淀蛋白后再過PLD+96孔板有助于降低生物檢材中基質(zhì)對目標物的影響，可提高扎來普隆和5-氧-扎來普隆回收率。

表3 乙腈沉淀蛋白和過PLD+96孔板的平均回收率Table3 Average recovery rate of acetonitrile protein precipitation and PLD + 96-well plates

2.2.2 標準曲線與靈敏度 將標準儲備液用初始流動相稀釋成0.01、0.05、0.10、1.00、10.00、50.00ng/ mL的扎來普隆和5-氧-扎來普隆系列標準液，儀器進樣2μL分析。以標準溶液濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標做標準線性回歸，得到回歸方程。扎來普隆和5-氧-扎來普隆回歸方程分別為：y=85260x+16713，y=47139x-15106；相關系數(shù)分別為R2= 0.9996，R2= 0.9993。扎來普隆和5-氧-扎來普隆標準線性范圍為0.01～50ng/mL、0.05～50ng/mL，靈敏度分別為0.01ng/ mL和0.05ng/mL。

2.2.3 工作曲線與檢出限 取空白尿樣品各0.2mL 5份，分別加入扎來普隆和5-氧-扎來普隆系列標準液制備成添加尿液樣品，使?jié)舛确謩e為0.1、0.25、1、10、50ng/mL。按1.2處理并進行儀器分析。以濃度對相應的峰面積進行線性回歸，得到回歸方程分別為：y=70393x+33700，y=34491x+16854；扎來普隆在0.1～50ng/mL線性范圍內(nèi)，相關系數(shù)R2=0.9984， 5-氧-扎來普隆在0.25～50ng/mL。線性范圍內(nèi)相關系數(shù)R2=0.9987；按信/噪比（S/N）≥3，計算得尿液中扎來普隆和5-氧-扎來普隆定量檢測限為0.1ng/mL和0.25ng/mL，檢出限為0.05ng/mL和0.1ng/mL。

2.2.4 回收率與精密度 取空白尿樣品0.2mL，分別加入扎來普隆和5-氧-扎來普隆系列標準液制備成添加尿液樣品，使?jié)舛葹?.1、1、50ng/mL，每個濃度平行操作5份。按1.2處理并進行儀器分析。測得的峰面積和對應濃度的標準品峰面積的比率作為回收率，平均回收率分別為91.4%和101.3%。

按照以上方法配制高、中、低3種濃度的樣品進行萃取檢測，按1.2處理并檢測。每一濃度平行5份，在同一天內(nèi)三個不同時間進行檢測，計算目標物峰面積的相對標準偏差，得到日內(nèi)精密度，兩目標物結(jié)果均小于5%。按照同樣方法配制三種濃度的樣本進行萃取檢測，每天測一批，連續(xù)測5d，計算目標物峰面積相對標準偏差，得到日間精密度，兩目標物結(jié)果均小于10%（見表4）。

表4 扎來普隆和5-氧-扎來普隆的精密度表Table4 Precision of zaleplon and 5-O-zaleplon

3 結(jié)果與討論

通過以上實驗研究，本文建立的扎來普隆和5-氧-扎來普隆的直接沉淀蛋白-過磷脂板-液相色譜-質(zhì)譜檢驗方法，操作簡單，檢出限低，回收率高，選擇性強，可用于尿液中扎來普隆的染毒檢驗鑒定。該檢驗方法的廣泛應用一方面可提高中毒事件和刑事案件的檢驗中扎來普隆的檢出率，另一方面也可用于醫(yī)療檢驗部門對藥物使用監(jiān)管進行檢測。

［1］ 張蕾萍，于忠山，何毅，等.法庭科學中的新型催眠藥［J］.刑事技術(shù)，2008（5）: 37-40.

［2］ Kawashima K， Hosoi Ki， Maruke T， et al.Aldehyde oxidasedependent marked species difference in hepatic metabolism of the sedative-hypnoticzaleplon between monkeys and rats［J］.Drug Metabolism and Disposition， 1999， 27（3）: 422-428.

［ 3］ 張蕾萍，于忠山，何毅，等.固相萃取/氣相色譜法檢測全血中的扎來普?。跩］.中國法醫(yī)學雜志，2011， 2 6（1）: 30-32.

［4］ 張蕾萍，于忠山，何毅，等.采用氣質(zhì)聯(lián)用負化學源分析痕量催眠藥扎來普?。跩］.分析實驗室，2010， 29: 55-56.

［5］ 吳海，晏曉軍，高汨，等.HPLC-MS/MS同時檢測全血中佐匹克隆、唑吡坦和扎來普?。跩］.刑事技術(shù)，2013（2）: 22-24.

引用本文格式：張蕾萍，黃霜，舒翠霞，等.UPLC/MS/MS檢驗尿液中的扎來普隆和5-氧-扎來普?。跩］.刑事技術(shù)，2015，40（2）：122-126.

Determination of Zaleplon and 5-O-zaleplon in Urine by UPLC/MS/MS

ZHANG Lei-ping1， HUANG Shuang2， SHU Cui-xia3， REN Xin-xin1， CUΙ Guan-feng1， LUAN Yu-jing1， DU Hong-yan1
（1.Beijing Engineering Research Center of Crime Scene Evidence Examination， Ιnstitute of Forensic Science， Ministry of Public Security， Beijing 100038， China； 2.Taizhou Public Security Bureau， Jiangsu Taizhou 225300， China； 3.Suzhou Public Security Bureau， Jiangsu Suzhou 215000， China.）

Objective Zaleplon， a pyrazolopyrimidine drug， is one of non-benzodiazepine sedative hypnotic drugs.As a new kind of hypnotic， it is an improvement of traditional benzodiazepines in treatment of insomnia.Ιn 2007， the Ιnternational Association of Forensic Toxicologists （TΙAFT） listed zaleplon as one of the new type of abuse drugs since it was often used in drug-facilitated cases.Zaleplon acted rapidly， and victims were less able to recall the circumstances under which the offence occurred due to its amnesic properties.The hypnotic acts within 0.5h and has short half-life （0.9～1.1h）.Because its ultra-short half-life， low frequency of use， and short window of detection， zaleplon has been detected in few clinical and forensic cases.Urine samples are most likely to be useful in cases of drug-facilitated crimes as its detection window is longer than that of blood or plasma samples.5-O-zaleplon is a main metabolite of zaleplon in biological body.Ιn order to improve detectable rate of zaleplon poisoning cases， we established an ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC/MS/ MS） assay for simultaneous determination of zaleplon and its main metabolite 5-O-zaleplon in urine samples.Methods Aliquots of 0.2mL urine samples were used for the analysis.Zaleplon and its main metabolite 5-O-zaleplon were extracte d with twostep method using acetonitrile to precipitate protein and 96-well plates to deplete phospholipid.The separation was performed on a ZORBAX Eclipse Plus C18 （2.1mm×100mm， 1.8μm） analytical column by Shimadzu 30A-LC ultra-performance liquid chromatography.The MS/MS analysis was performed on APΙ 5500 QTRAP tandem mass spectrometry.The column temperature was maintained at 40， while the sample plate was maintained at 4.By comparing different chromatographic column， different mobile phase， different gradient， and optimization conditions of mass spectrometry， we established the liquid chromatographytandem mass spectrometry method.The mobile phases consisted of acetonitrile （mobile phase B） and water containing 0.1% formic acid （mobile phase A）， and the fl ow rate was 0.4mL/min.MS-MS in the multiple reaction monitoring （MRM） mode via positive electrospray ionization mode （ESΙ+） was used.The retention times and the two parent/daughter ion pairs were used for qualitative analysis， and the fi rst parent/daughter ion pair was used for quantitative analysis.Results Zaleplon and 5-O-zaleplon in urine samples were separated well.There were no interferences of endogenous impurity.The chromatographic separation time was 4 min.Calibration curve of zaleplon was linear within the range of 0.1～50ng/mL and calibration curve of 5-O-zaleplon was linear within the range of 0.25～50ng/mL.Regression equations were y=70393x+33700 and y=34491x+16854， respectively.The limits of detection for zaleplon and 5-O-zaleplon were 0.05ng/mL and 0.1ng/mL.The recoveries of zaleplon and 5-O-zaleplon were more than 90%.The inter-day and intra-day precisions were less than 10%.Conclusions This method is rapid， sensitive and effective.Ιt is suitable for determination of zaleplon and its main metabolite 5-O-zaleplon in urine sample.Ιt can be a solution to prolong the window of detection and applied to forensic toxicological analysis.

forensic toxicological analysis； zaleplon； 5-O-zaleplon； UPLC/MS/MS

DF795.1

A

1008-3650（2015）02-0122-05

公安部重點研究計劃項目（No.201302ZDYJ002）；公安技術(shù)交流培訓計劃項目（No.B2014004A）

張蕾萍（1974—），女，山西太原人，副研究員，碩士，研究方向為毒物分析。 E-mail：zlpbjft@sohu.com

2014-11-24