袁琴，伍春霞，劉飛飛，羅旗，劉何蕾，李成敏，鄭潔，羅舒文，張聰，曾愛(ài)中

我國(guó)是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的高流行區(qū)，普通人群感染率高達(dá)75.8%[1-3]。多數(shù)HBV感染并無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性是HBV感染的重要依據(jù)。一直以來(lái)，HBsAg轉(zhuǎn)陰及抗-HBs的出現(xiàn)被認(rèn)為是HBV清除和乙肝痊愈的臨床標(biāo)志。但隨著高靈敏PCR的應(yīng)用，大量研究表明，血清HBsAg陰性個(gè)體，血清和(或)肝組織HBV DNA可持續(xù)低水平存在[4-5]。這種狀態(tài)被定義為隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)[6]，其血清學(xué)模式可表現(xiàn)為抗-HBs﹑抗-HBc和(或)抗-HBe陽(yáng)性，也可表現(xiàn)為血清學(xué)標(biāo)志物均為陰性。

OBI可見于一般健康人群﹑獻(xiàn)血員﹑血液透析患者及處于免疫抑制狀態(tài)的人群，也可見于HBV感染恢復(fù)人群及各種慢性肝病患者。OBI不僅可以潛在性地增加輸血﹑移植﹑透析等感染HBV的風(fēng)險(xiǎn)[4,7]，導(dǎo)致免疫抑制群體HBV再激活[8]，還可能引起慢性肝損傷﹑肝硬化﹑原發(fā)性肝癌等，尤其是在合并丙型肝炎的情況下[9-10]。我國(guó)是HBV高流行區(qū)，為避免上述情況發(fā)生，不可能將所有HBsAg陰性個(gè)體進(jìn)行高靈敏PCR檢測(cè)。因此，了解OBI的流行狀況，探討HBV隱匿性感染的臨床特點(diǎn)，對(duì)臨床實(shí)踐有重要的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年3月－2014年1月于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診，并經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(檢測(cè)值下限為0.04U/ml)為HBsAg陰性，熒光定量PCR檢測(cè)HBV DNA定量＜103U/ml的住院及門診患者110例。納入的患者既往均無(wú)急或慢性乙肝病毒感染。

1.2 方法

1.2.1 HBV DNA提取 留取入選患者清晨空腹靜脈血4ml，置于臺(tái)式離心機(jī)中離心(3000r/min×15min)，將上清置于－70℃冰箱中保存。采用高純度病毒核酸檢測(cè)試劑盒(德國(guó)Roche Diagnostics GmbH公司)提取血清HBV DNA，操作按說(shuō)明書步驟進(jìn)行。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[11-12]，在HBV基因組C﹑S及X區(qū)保守區(qū)段各設(shè)計(jì)1套巢式引物(表1)，引物由華大基因合成。

1.2.3 巢式PCR擴(kuò)增 50μl PCR反應(yīng)體系：雙蒸水18μl，上下游引物各1μl，模板DNA 5μl，Prime STARTMHS(Premix，大連寶生物工程有限公司)25μl。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 45s﹑55℃ 1min﹑72℃ 90s，循環(huán)10次；94℃ 45s﹑53℃1min﹑72℃ 90s，循環(huán)15次；72℃ 7min。以第1輪PCR產(chǎn)物為第2輪PCR模板，反應(yīng)條件：94℃5min；94℃ 45s﹑57℃ 1min﹑72℃ 90s，循環(huán)10次；94℃ 45s﹑55℃ 1min﹑72℃ 90s，循環(huán)25次；72℃7min。以雙蒸水及血清HBV DNA定量＞103U/ml的慢性乙肝患者血清分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。第2次PCR反應(yīng)結(jié)束后，行2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析系統(tǒng)成像。以2個(gè)或以上區(qū)段同時(shí)陽(yáng)性判定為OBI。

表1 HBV基因組C﹑S﹑X區(qū)巢式PCR引物Tab.1 Nested PCR primers of HBV C, S, X

1.3 OBI發(fā)生率比較 將入選病例分成≤40﹑41～60﹑≥61歲3個(gè)年齡段，比較不同性別﹑年齡段﹑血清學(xué)模式[單獨(dú)抗-HBc(+)及抗-HBs(+)/抗-HBc(±)]患者，以及不同病因肝損害患者的OBI發(fā)生率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料兩個(gè)獨(dú)立樣本的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的構(gòu)成比比較采用c2檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果 部分患者C區(qū)﹑B區(qū)及X區(qū)擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，C﹑S﹑X區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶大小分別為693﹑439和108bp。

2.2 入選患者基本特征比較 入選患者110例，男女構(gòu)成比3:2，年齡50.2±13.8歲，其中男性48.9±13.2歲，女性52.2±14.5歲，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.217)。將入選病例分成≤40﹑41～60﹑≥61歲3個(gè)年齡段，各年齡段分別占總?cè)藬?shù)的21.8%﹑54.6%和23.6%，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.450)。

2.3 OBI發(fā)生率比較 110例入選者共檢測(cè)出26例OBI，發(fā)生率23.6%。不同性別﹑年齡段﹑血清學(xué)模式[單獨(dú)抗-HBc(+)及抗-HBs(+)/抗-HBc(±)]患者的OBI發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝功能異常患者OBI發(fā)生率明顯高于肝功能正常者，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003，表2)。

2.4 不同病因所致肝損害的OBI發(fā)生率比較 57例肝功能異常者中，29例為不明原因肝損害，其OBI發(fā)生率為31.0%(9/29)。其余28例肝損害患者包括丙肝病毒感染6例，戊肝病毒感染3例，飲酒者6例，使用藥物者7例，自身免疫疾病患者6例，OBI檢出例數(shù)分別為3﹑1﹑3﹑2﹑2例，OBI發(fā)生率為39.3%(11/28)。原因不明的肝損害與不同病因所致肝損害之間OBI發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.585)。

圖1 部分患者PCR電泳圖Fig.1 The electropherogram of PCR in part of cases

表2 不同組間OBI發(fā)生率比較Tab.2 Distribution of OBI in different groups

3 討 論

我國(guó)普通人群乙肝病毒感染率高達(dá)75.8%，是OBI流行的基礎(chǔ)。自1978年首次報(bào)道OBI[13]后，有關(guān)OBI的報(bào)道屢見不鮮。所報(bào)道的HBsAg陰性獻(xiàn)血員﹑隱源性慢性肝炎﹑原發(fā)性肝細(xì)胞癌﹑慢性丙型肝炎患者中，OBI的發(fā)生率分別為1%～10%﹑11%～19%﹑12%～61%﹑1%～95%[14-15]。本研究運(yùn)用針對(duì)HBV DNA C﹑S﹑X 3個(gè)區(qū)段的巢式PCR對(duì)110例血清標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增，最終檢出26例OBI，陽(yáng)性率23.6%。本研究的OBI陽(yáng)性率明顯高于獻(xiàn)血人群，其主要原因可能與本研究大多數(shù)研究對(duì)象有肝臟疾病有關(guān)，另外，HBV流行性的差異，人口學(xué)特征的不同，敏感性及特異性的檢測(cè)方法也會(huì)造成結(jié)果的不同。本研究經(jīng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不同性別及不同年齡段OBI檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即OBI檢出率與性別﹑年齡無(wú)關(guān)，性別及年齡不能作為預(yù)測(cè)隱匿性感染的因素。

文獻(xiàn)報(bào)道單獨(dú)抗-HBc(+)可能是隱匿性感染存在的標(biāo)志[16]，Raimondo等[6]也建議將抗-HBc作為鑒別血清學(xué)陽(yáng)性O(shè)BI的一個(gè)替代指標(biāo)。但我們的研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)抗-HBc陽(yáng)性組與其他組OBI的檢出率并無(wú)明顯差異。這一結(jié)論與國(guó)內(nèi)吳蓓穎等[16]及國(guó)外Fatemeh等[5]的研究一致。若將單獨(dú)抗-HBc陽(yáng)性作為隱匿性感染存在的一個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)，一方面會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性率增高，另一方面也會(huì)造成抗-HBs﹑抗-HBc陽(yáng)性這類血清學(xué)模式隱匿性感染的漏檢。因此，在不同人群中單獨(dú)抗-HBc能否作為血清學(xué)陽(yáng)性隱匿性乙肝感染的一個(gè)替代指標(biāo)有待商榷。

在本研究中，肝功能異常的OBI檢出率明顯高于肝功能正常者，其中合并明確致肝損害因素的OBI發(fā)生率高達(dá)39.3%，提示OBI更易發(fā)生在有基礎(chǔ)肝臟疾病的人群。這可能與合并肝臟損害的個(gè)體本身存在免疫功能紊亂而影響了病毒的復(fù)制和表達(dá)有關(guān)；另一方面，有文獻(xiàn)報(bào)道，存在嗜肝病毒重疊感染(如HCV)時(shí)也可能抑制HBV的復(fù)制，導(dǎo)致隱匿性感染更易感[9]。此外，OBI患者肝組織內(nèi)可長(zhǎng)期持續(xù)存在低水平HBV DNA復(fù)制，肝組織學(xué)可表現(xiàn)為持續(xù)的輕微炎癥壞死。若在此基礎(chǔ)上合并其他致肝病因子，則可能加重肝臟損害，出現(xiàn)肝炎活動(dòng)。OBI可能與多種不同的肝臟疾病相關(guān)，由于我們的研究樣本量有限，且目前相關(guān)臨床資料尚缺乏，有待更多資料予以證實(shí)。

值得注意的是，在本研究中不明原因肝損害患者中OBI的發(fā)生率為31.0%(9/29)，這與一些研究中不明原因肝損害的OBI檢出率相近，提示盡管HBsAg陰性，但仍存在HBV相關(guān)性肝損害的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也提示在中國(guó)這樣的HBV高流行地區(qū)，僅通過(guò)HBsAg篩查不能除外OBI。目前認(rèn)為血清或肝組織中HBV DNA是OBI唯一可靠的診斷標(biāo)志物，但由于肝組織標(biāo)本難以獲得，血清中提取出HBV DNA也可作為診斷OBI的標(biāo)準(zhǔn)。推薦的HBV DNA提取方法為巢式PCR或?qū)崟r(shí)PCR，但由于其操作過(guò)程復(fù)雜﹑費(fèi)用較高，目前尚不能在臨床實(shí)踐中普及。因此，一方面需要更多的研究積極尋找不同群體隱匿性感染的相關(guān)因素，另一方面有待發(fā)掘更簡(jiǎn)便有效的HBV檢測(cè)方法。

本研究還發(fā)現(xiàn)，HBsAg陰性患者OBI檢出率為23.64%，與性別﹑年齡段﹑血清學(xué)模式無(wú)明顯相關(guān)性，存在肝損害的個(gè)體更易合并OBI，同時(shí)OBI也是不明原因肝損害的病因之一。因此，在不明原因肝病，尤其是病情較重時(shí)，可采用高靈敏巢式PCR排除OBI。目前國(guó)內(nèi)外大樣本OBI流行病學(xué)報(bào)道主要針對(duì)獻(xiàn)血人群，但關(guān)于不明原因肝病(肝炎﹑肝硬化﹑肝癌)的研究?jī)H限于小樣本﹑回顧性研究，研究結(jié)果也大相徑庭，因此有待于更多大樣本﹑隊(duì)列研究來(lái)證實(shí)。OBI涉及臨床多個(gè)方面，改進(jìn)分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)及方法，提高OBI檢出率具有重要的臨床意義。

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