陳振崗 劉金波 林凌 謝輝 張文成 張洪博 王廣舜

肺癌已成為癌癥死亡的主要原因[1]，且呈逐年上升趨勢(shì)，而其中非小細(xì)胞肺癌 （non-small cell lung cancer,NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%。雖然不斷改善NSCLC的各種診斷和治療方法，但60%NSCLC患者在接受治療時(shí)已處于晚期[2]，其5年生存率不超過(guò)15%，而I期NSCLC的5年生存率卻高達(dá)70%[3]，故在臨床診治中急需尋找一種NSCLC早期篩查和診斷的新方法?，F(xiàn)階段在NSCLC研究中，一個(gè)重要的方向是使用基因和蛋白質(zhì)組學(xué)方法來(lái)探討NSCLC腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。近些年來(lái)，通過(guò)NSCLC患者尿液中獲得差異表達(dá)蛋白，從而為NSCLC預(yù)防、診斷和治療提供潛在生物標(biāo)志物的研究越來(lái)越得到科研工作人員的普遍關(guān)注。我們通過(guò)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息技術(shù)對(duì)肺部良性疾病、健康志愿者和NSCLC患者尿液中差異表達(dá)蛋白質(zhì)分析，尋找出尿液蛋白LRG1、CA1、VPS4B和YWHAZ為NSCLC早期篩查、監(jiān)測(cè)預(yù)后和治療評(píng)估的生物標(biāo)記物。

1 材料和方法

1.1 一般資料 來(lái)自天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院腫瘤科2014年3月-2014年10月病理證實(shí)初診NSCLC患者尿液樣本40例。其中男性27例，女性13例；年齡44歲-84歲，平均年齡（64±10.2）歲；腺癌13例，鱗癌27例；I期3例，II期5例，III期20例，IV期12例。來(lái)自天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院保健科與腫瘤科對(duì)照組尿液樣本30例：健康志愿者22例；肺部良性疾病8例，包括肺部錯(cuò)構(gòu)瘤3例，肺部結(jié)核球2例，肺部炎性假瘤1例，肺部陰影2例。其中男性20例，女性10例；年齡24歲-86歲，平均年齡（59±15.5）歲。所有參與者均被告知尿液標(biāo)本用于研究目的，在醫(yī)院進(jìn)行晨起第一次中段尿液收集。受試人主體協(xié)議成立，進(jìn)行內(nèi)部審查委員會(huì)批準(zhǔn)。受試者知情同意。

1.2 主要試劑及儀器 二硫蘇糖醇（DTT）來(lái)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；尿素來(lái)自西隴化學(xué)工業(yè)有限公司；三氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、過(guò)硫酸鈉、乙醇均來(lái)自北京化學(xué)制劑公司；乙腈、碳酸氫銨來(lái)自J.D.Baker公司；考馬斯亮藍(lán)來(lái)自Merck KGaA公司。超高速低溫離心機(jī)為美國(guó)Berkman公司產(chǎn)品；550全自動(dòng)酶標(biāo)儀為美國(guó)BIO.RAD公司產(chǎn)品，分析軟件為Microsoft Excel軟件；ProteanTMPlusDodecaTMCell電泳槽、ProteanTMPlusDodecaTMCell染膠儀為美國(guó)BIO.RAD公司產(chǎn)品；MS-Thermo-Orbi-Trap-Velos質(zhì)譜儀為美國(guó)熱電公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)軟件包括：4000 explorer 3.0軟件、GPS explorer 3.5軟件和NCBI-Human數(shù)據(jù)庫(kù)分析軟件。

1.3 尿液樣本采集處理 分別收取近3年內(nèi)未發(fā)現(xiàn)其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病，近2年無(wú)嚴(yán)重疾病用藥史，特別是近1個(gè)月內(nèi)無(wú)泌尿系統(tǒng)疾病史，女性不在月經(jīng)周期內(nèi)肺部良性疾病、志愿者及病理證實(shí)初診NSCLC患者晨起第一次中段尿液樣本各40 mL。液氮快速冷凍后，置于-800C冰箱凍藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蛋白質(zhì)提取及定量測(cè)定 溶解冰凍樣本時(shí)進(jìn)行多次渦旋，以最大程度的提高蛋白質(zhì)回收率[4]。采用200,000 g超高速離心沉淀法分離定容為20 mL尿液樣本提取其尿液蛋白質(zhì)，并進(jìn)行還原、烷基化和裂解。通過(guò)Branford法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，取出定量為20 μg樣本溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。

1.5 一維電泳SDS-PAGE蛋白質(zhì)分離 取20 μg樣本溶液進(jìn)行電泳分離，了解其差異凝膠條帶情況。實(shí)驗(yàn)中切去高豐度蛋白質(zhì)集中的75 kDa凝膠條帶，將余下條帶等分為4-6等份，進(jìn)行凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化。最后，分別使用30%乙腈、0.3%三氟乙酸和100%乙腈進(jìn)行胰蛋白酶肽段的萃取。

1.6 差異表達(dá)蛋白質(zhì)識(shí)別 使用MS-Thermo-Orbi-Trap-Velos質(zhì)譜分析儀對(duì)蛋白質(zhì)及肽段逐一予以分離并進(jìn)行鑒定，所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)進(jìn)入HCBI-Human數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與蛋白質(zhì)識(shí)別，得出全部尿液蛋白質(zhì)。同時(shí)對(duì)所得蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索和分析，分別篩選出在NSCLC患者尿液中的上調(diào)和下調(diào)蛋白質(zhì)。最后，應(yīng)用SPSS 20.0軟件中受試者工作特征曲線(xiàn) （receiver operating characteristic curve,ROC）對(duì)篩選出蛋白質(zhì)的敏感性和特異性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定出與NSCLC相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，初步認(rèn)定為NSCLC早期篩查的候選生物學(xué)標(biāo)記物。

1.7 差異蛋白敏感性、特異性驗(yàn)證 雙盲法對(duì)20例驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行同上處理，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出差異表達(dá)蛋白對(duì)NSCLC早期診斷的敏感性和特異性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果

2.1 1DSDS-PAGE電泳凝膠圖結(jié)果 非腫瘤組和NSCLC組尿液蛋白的差異表達(dá)主要出現(xiàn)在90 kDa、60 kDa和20 kDa-30 kDa凝膠條帶，而高豐度蛋白質(zhì)集中于75 kDa條帶處（圖1）。

2.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集結(jié)果 通過(guò)MS-Thermo-Orbitrap-Velos質(zhì)譜儀進(jìn)行尿液蛋白質(zhì)提取分離，所得蛋白質(zhì)和肽段結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)中NSCLC組鑒別出肽段數(shù)6,789-9,645，中位數(shù)7,762（7,189-8,672）；蛋白質(zhì)數(shù)1,194-2,813，平均值2,001±363.1。非腫瘤組鑒別出肽段數(shù)6,277-8,700，中位數(shù)7,774（6,452-8,616）；蛋白質(zhì)數(shù)1,313-2,774，平均值1,967±505.0。雙盲實(shí)驗(yàn)中NSCLC組鑒別出肽段數(shù)5,919-9,045，平均值7,705±1,112.6；蛋白質(zhì)數(shù)1,194-2,408，平均數(shù)1,937±391.5。非腫瘤組鑒別出肽段數(shù)6,132-9,376，平均值7,870±1,050.2；蛋白質(zhì)數(shù)1,060-2,397，平均數(shù)1,876±409.9。實(shí)驗(yàn)與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)各組所提取分離出的總平均肽段數(shù)為7,495±1,091.4，蛋白質(zhì)總數(shù)1,874±416.8，均滿(mǎn)足本實(shí)驗(yàn)研究的要求，各組肽段與蛋白質(zhì)數(shù)量分布見(jiàn)圖2。

2.3 MS-Thermo-Orbitrap-Velos質(zhì)譜儀結(jié)果分析 得到的MS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行NCBI-Human數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，提取、確定出尿液樣本中包含的所有蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)align數(shù)據(jù)分析軟件設(shè)定蛋白質(zhì)肽段數(shù)≥2個(gè)肽段、蛋白質(zhì)上調(diào)比率＞4倍條件，于NSCLC患者尿液蛋白質(zhì)中篩查出LRG1（25/30）、CA1（18/30）、PTGDS（23/30）、CD14（20/30）、ERLIN2（21/30）、ACTG1（21/30）6種明顯上調(diào)蛋白質(zhì)。同樣，設(shè)定蛋白質(zhì)肽段數(shù)≥2個(gè)肽段、蛋白質(zhì)下調(diào)比率＞4倍條件，于所有NSCLC患者尿液蛋白質(zhì)中篩查出VPS4B（22/30）、IST1（23/30）、GNAI1（23/30）、UBB（20/30）、YWHAZ（18/30）5種明顯下調(diào)蛋白質(zhì)。最后，應(yīng)用SPSS 20.0軟件分別對(duì)上調(diào)蛋白質(zhì)、下調(diào)蛋白質(zhì)的敏感度和特異度進(jìn)行ROC曲線(xiàn)圖分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)蛋白LRG1、CA1（圖3，表1）、下調(diào)蛋白VPS4B、YWHAZ（圖4，表2）的敏感性和特異性較高，曲線(xiàn)下面積均大于0.75，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，考慮此4種尿液差異表達(dá)蛋白與NSCLC具有相關(guān)性，初步將其確定為NSCLC早期篩查的候選生物學(xué)標(biāo)記物。

2.4 差異表達(dá)蛋白的敏感性、特異性 LRG1和CA1蛋白在NSCLC患者尿液中呈現(xiàn)高表達(dá)，LRG1蛋白敏感性83.0%（25/30）、特異性90.0%（18/20）；CA1蛋白敏感性60.0%（18/30）、特異性90.0%（18/20）。VPS4B和YWHAZ蛋白在NSCLC患者尿液中呈現(xiàn)低表達(dá)，VPS4B蛋白敏感性73.3%（22/30）、特異性90.0%（18/20）；YWHAZ蛋白敏感性60.0%（18/30）、特異性95.0%（19/20）；LRG1、CA1、VPS4B和YWHAZ蛋白質(zhì)組合模式的敏感性和特異性分別為96.7%（29/30）和85%（17/20），見(jiàn)表3，表4。在本研究中蛋白質(zhì)組敏感性定義為各個(gè)生物標(biāo)記物所提示的NSCLC患者均納入總數(shù)，特異性定義為不出現(xiàn)任何一種生物標(biāo)記物的實(shí)驗(yàn)對(duì)象均納入總數(shù)。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 10例NSCLC樣本中正確篩查出了9例NSCLC患者；10例非腫瘤樣本中正確排除7例。采用差異表達(dá)蛋白質(zhì)組合模式雙盲下對(duì)NSCLC患者進(jìn)行篩查和診斷，其敏感性和特異性分別為90.0%（9/10）和70.0%（7/10），其預(yù)測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（positive predictive value,PPV）和陰性預(yù)測(cè)值（negative predictive value, NPV）分別高達(dá)75.0%和87.5%（表5）。

圖1 NSCLC組與非腫瘤組尿液蛋白質(zhì)的電泳圖像。A：6例NSCLC患者尿液蛋白電泳圖；B：6例非腫瘤組尿液蛋白電泳圖。Fig 1 The electrophoresis images of urine proteins from NSCLC patients and non-neoplastic groups.A: The electrophoresis images of urine proteins from 6 NSCLC patients; B: The electrophoresis images of urine proteins from 6 non-neoplastic patients.

圖2 實(shí)驗(yàn)中各組樣本提取分離出的尿液蛋白質(zhì)和肽段數(shù)Fig 2 The protein and peptideextracted from urine samples in different groups

圖3 上調(diào)蛋白質(zhì)ROC分析曲線(xiàn)圖Fig 3 ROC curve of up-regulating proteins

圖4 下調(diào)蛋白質(zhì)R0C分析曲線(xiàn)圖Fig 4 ROC curve of down-regulating proteins

3 討論

在男性和女性中肺癌已成為全世界癌癥死亡的主要原因，每年有超過(guò)100萬(wàn)人死于肺癌[5]。NSCLC約占肺癌患者中的80%，在過(guò)去十年中，肺癌診斷和治療策略雖然取得了一定進(jìn)步，但NSCLC患者的預(yù)后仍很差，5年總生存率僅為15%-20%[6]。這主要是由于缺乏早期診斷手段，有超過(guò)60%患者診斷時(shí)即為晚期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移性疾病[7]，因此沒(méi)有獲得外科切除治療的機(jī)會(huì)。其主要原因?yàn)镹SCLC早期階段的診斷非常困難，且在以往臨床診斷中我們很少應(yīng)用到生物標(biāo)記物。在NSCLC治療中早期診斷是其治療成功的一個(gè)關(guān)鍵因素，只有通過(guò)早期診斷后選擇優(yōu)化的治療方案，才能增加其治愈成功的概率。因此，在臨床上尋找NSCLC的早期篩查方法和手段尤為重要。近些年來(lái)，應(yīng)用臨床蛋白質(zhì)組學(xué)策略發(fā)現(xiàn)NSCLC生物學(xué)標(biāo)記物已成為臨床NSCLC診治的最新研究熱點(diǎn)。我們不但可以通過(guò)它來(lái)篩查NSCLC高危人群，去發(fā)現(xiàn)那些可測(cè)定但臨床上各項(xiàng)檢測(cè)尚不能確診的NSCLC，從而使NSCLC確診的比率得到提高。而且，早期NSCLC預(yù)測(cè)性生物學(xué)標(biāo)記物還可以幫助我們鑒別NSCLC的侵襲程度、提示我們哪些治療會(huì)縮短患者生存率及幫助我們選擇哪些患者會(huì)在輔助治療中獲益等作用。

尿液是可通過(guò)無(wú)創(chuàng)傷收集來(lái)應(yīng)用于人類(lèi)疾病診斷和預(yù)后研究的一種重要生物流體。因其具有實(shí)用性、易于收集和與疾病病理生理學(xué)相關(guān)等特性，已成為臨床蛋白質(zhì)組學(xué)一個(gè)最具有吸引力的材料來(lái)源。健康個(gè)體中，尿液蛋白質(zhì)組的70%來(lái)自腎臟和尿路，30%來(lái)自腎小球?yàn)V過(guò)[8]。因此，尿液蛋白質(zhì)組分析不僅能鑒定泌尿系統(tǒng)生物標(biāo)志物，也能鑒定全身性疾病的生物標(biāo)志物。最近許多研究工作表明，尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究還可為非泌尿生殖系統(tǒng)疾病，特別是惡性腫瘤提供大量生物學(xué)信息，并可使之應(yīng)用于這些疾病的預(yù)防、診斷和治療。通過(guò)對(duì)臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，尿液蛋白質(zhì)組學(xué)可能會(huì)具有迅速在臨床實(shí)用化的潛力。

本研究在NSCLC患者尿液蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了4種差異表達(dá)蛋白，分別為上調(diào)蛋白LRG1、CA1和下調(diào)蛋白VPS4B、YWHAZ。LRG1屬于LRR蛋白質(zhì)家族成員。在過(guò)去的研究表明，LRG1參與機(jī)體重要的生理和病理過(guò)程，如蛋白質(zhì)相互作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞粘附。LRG1也可在粒細(xì)胞分化過(guò)程中得到表達(dá)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)肝癌[9]、肺癌[10]和胰腺腺癌[11]患者血清中LRG呈高表達(dá)。此外，Heo應(yīng)用親和層析色譜及LC-MS/MS對(duì)腺癌患者血清進(jìn)行分離，鑒定出LRG1是一個(gè)潛在肺癌血清生物標(biāo)志物的結(jié)論[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LRG1在NSCLC患者尿液中呈高表達(dá)（敏感性83%，25/30；特異性90%，18/20），這說(shuō)明NSCLC患者尿液中的LRG1蛋白可能是來(lái)自肺部腫瘤組織。同時(shí)也說(shuō)明LRG1將有希望成為NSCLC相關(guān)的獨(dú)立尿液生物學(xué)標(biāo)志物。

表1 上調(diào)蛋白質(zhì)ROC曲線(xiàn)下面積Tab 1 Area under ROC curve of up-regulating proteins

表2 下調(diào)蛋白質(zhì)ROC曲線(xiàn)下面積Tab 2 Area under ROC curve of down-regulating proteins

表3 獨(dú)立差異蛋白質(zhì)敏感性和特異性Tab 3 Sensitivity and specificity of differentially expressed proteins

表4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)組敏感性和特異性Tab 4 Sensitivity and specificity of differentially expressed proteome

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的敏感性和特異性Tab 5 Sensitivity and specificity in double-blind experiment

碳酸酐酶（carbonic anhydrase, CA）同功酶在癌癥發(fā)展中起到重要作用。其中一些同功酶可通過(guò)控制瘤體內(nèi)pH值的平衡，呈現(xiàn)出調(diào)解惡性腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的功能[13]。本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者的尿液中CA1蛋白質(zhì)表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯上調(diào)（敏感性60%，18/30；特異性90%，18/20），而CA1過(guò)表達(dá)在結(jié)直腸癌[14]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[15]、子宮內(nèi)膜癌[16]等惡性腫瘤研究中均有發(fā)現(xiàn)。因此，實(shí)驗(yàn)中這種變化可能反映了一定的NSCLC發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，也為CA1蛋白可能成為NSCLC相關(guān)尿液生物學(xué)標(biāo)記物，提供了理論依據(jù)。

VPS4B蛋白是腺苷三磷酸酶蛋白質(zhì)家族的一員，主要存在于細(xì)胞漿中。VPS4B與多種細(xì)胞活性蛋白質(zhì)相關(guān)，VPS4B通過(guò)與胞內(nèi)體膜結(jié)合來(lái)調(diào)控激活膜蛋白內(nèi)部和溶酶體降解[17,18]。VPS4B是胞內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物所需（endosomal sortingcomplex required for transport, ESCRT）物質(zhì)[19,20]，其對(duì)多泡體（multivesicular body, MVBs）的形成和各種膜受體降解至關(guān)重要。膜受體包括表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）[17,21,22]和胰島素受體[23]。表皮生長(zhǎng)因子受體由多泡體轉(zhuǎn)運(yùn)，然后通過(guò)依賴(lài)VSP4B機(jī)制降解[18]。因此，VPS4B為ESCRT通路的重要調(diào)節(jié)器，并參與多泡體途徑的組成?；谥把芯?，VPS4B參與溶酶體降解途徑，EGFR損失不僅導(dǎo)致內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子受體退化延遲，同時(shí)也延長(zhǎng)其激活持續(xù)時(shí)間[24,25]，增加了腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、入侵和轉(zhuǎn)移。已有VPS4B通過(guò)抑制EGFR激活途徑抑制乳腺癌進(jìn)展的報(bào)道[26,27]。VSP4B不僅具有調(diào)節(jié)ESCRT通路中囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)功能，還同樣參與了病毒發(fā)生[28,29]和胞質(zhì)分裂的脫落[30]。有報(bào)道[30]稱(chēng)，VPS4B蛋白可以調(diào)節(jié)有絲分裂和細(xì)胞分裂的不同階段。直到目前為止關(guān)于尿液VPS4B蛋白與NSCLC相關(guān)性研究幾乎沒(méi)有任何報(bào)道。但考慮到不受控制的細(xì)胞分裂是腫瘤形成的一個(gè)特征，因此很容易推測(cè)到VPS4B在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中必將發(fā)揮一定的作用。本研究結(jié)果表明VPS4B在NSCLC患者尿液中呈現(xiàn)低表達(dá)（敏感73.3%，22/30；特異性90%，18/20），進(jìn)一步證實(shí)這一假設(shè)的存在，也增加了尿液VPS4B蛋白作為NSCLC生物標(biāo)記物的可能性。但關(guān)于其具體影響過(guò)程到目前為止尚不是完全清楚，有待于我們后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)進(jìn)一步解釋。

YWHAZ蛋白質(zhì)家族是通過(guò)綁定磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)載蛋白質(zhì)進(jìn)行基因調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。雖然，其在腫瘤發(fā)展中的潛在機(jī)制尚未完全清楚，但YWHAZ蛋白已在包括NSCLC在內(nèi)的一些癌癥中被確定為是一種假定的腫瘤蛋白。人體中確定出了YWHAZ蛋白家族中的7個(gè)亞型[31]，起初它們被認(rèn)為是影響相關(guān)酪氨酸羥化酶活性的酶輔助因子[32]。但最近幾項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)YWHAZ蛋白與原癌基因和癌基因相關(guān)，同時(shí)也參與了細(xì)胞轉(zhuǎn)化和促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的信號(hào)通路[33,34]，對(duì)人體腫瘤的發(fā)生與發(fā)展產(chǎn)生廣泛影響。YWHAZ蛋白一個(gè)明顯特征是能夠結(jié)合不同信號(hào)的多功能蛋白，包括激酶、磷酸酶和跨膜受體[35]。在這些蛋白相互作用的調(diào)控過(guò)程中YWHAZ發(fā)揮了重要作用，如引起細(xì)胞有絲分裂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控等[36]。到目前為止YWHAZ蛋白家族已經(jīng)確定出超過(guò)100多個(gè)相關(guān)綁定蛋白[37]，同時(shí)在細(xì)胞、動(dòng)物模型和患者樣本中得到了越來(lái)越多的HWAZ與多種惡性腫瘤相關(guān)的證據(jù)，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤及HeLa宮頸癌等。據(jù)趙[38]等報(bào)道，在NSCLC中YWHAZ與Hsp27結(jié)合成復(fù)合體，并對(duì)其功能產(chǎn)生重大影響。同時(shí)YWHAZ功能非常類(lèi)似于Hsp27的作用功能。因此我們可以假設(shè)YWHAZ和Hsp27具有相同的信號(hào)通路來(lái)影響NSCLC的產(chǎn)生、發(fā)展過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者尿液中YWHAZ呈低表達(dá)（敏感性60.0%，18/30；特異性95%，19/20），進(jìn)一步表明尿液YWHAZ蛋白的表達(dá)與NSCLC存在一定相關(guān)性。同時(shí)，我們更希望其成為一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)NSCLC的新分子目標(biāo)，從而服務(wù)于臨床NSCLC的診療。

組成生物標(biāo)記物的多肽或蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上存在明顯可變性，且大部分經(jīng)過(guò)機(jī)體排泄的多肽可能由于受到身體活動(dòng)、飲食或藥物治療作用影響，其白天變化明顯[39,40]。所以單一生物標(biāo)記物在臨床中實(shí)用價(jià)值是有限的，即使采用最優(yōu)的檢測(cè)和分析方法，獨(dú)立生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床診斷中的敏感性依然很低。相比之下，單一生物標(biāo)記變化不會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記物蛋白質(zhì)組合的明顯變化。因此，良好的多生物標(biāo)記蛋白質(zhì)組合具有更高的敏感性和特異性。這就進(jìn)一步表明生物標(biāo)志物蛋白質(zhì)組合模式比獨(dú)立生物標(biāo)志物模式在臨床診療評(píng)估中更有意義（如Theodorescu等[41]、Zimmerli等[42]），也將更具有良好的實(shí)用價(jià)值和前景。

實(shí)驗(yàn)研究中存在2處不足之處：①實(shí)驗(yàn)組NSCLC病例分期較晚；②對(duì)照組采用健康人群與肺部良性疾病。造成了獨(dú)立生物標(biāo)記物的特異性明顯增高，故影響了其在臨床意義上的作用。LRG1、CA1、VPS4B和YWHAZ作為NSCLC標(biāo)記物在其他惡性腫瘤中的具體表達(dá)情況，還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。