張翠翠 李月雅 王晶 李凱

腫瘤微環(huán)境包括腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞、炎性細(xì)胞等）、細(xì)胞外基質(zhì)及其分泌或釋放的各種細(xì)胞因子，是腫瘤形成、生存和增殖之場(chǎng)所。腫瘤生長(zhǎng)需要新生血管生成以持續(xù)供氧和營(yíng)養(yǎng)，其分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）等促血管生成因子可誘導(dǎo)微血管生成，而生成過(guò)程不僅與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)，還依賴血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移并形成管樣結(jié)構(gòu)[1]。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含有大量其產(chǎn)生的因子、與人體中的微環(huán)境有相似性，故可通過(guò)研究腫瘤細(xì)胞上清液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響推測(cè)體內(nèi)微環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為。本實(shí)驗(yàn)觀察了高轉(zhuǎn)移人肺腺癌細(xì)胞Anip973細(xì)胞上清液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）生物學(xué)行為及細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源 高轉(zhuǎn)移肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973購(gòu)自上海賽默科技發(fā)展有限公司；HUVEC購(gòu)自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.2 試劑及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、青霉素/鏈霉素雙抗（美國(guó)GIBCO公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；Transwell chamber（美國(guó)Corning Costar公司）；anti-CD105-FITC、熒光素FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V（Annexin V-FITC美國(guó)BioLegend公司）；Matrigel基質(zhì)膠、anti-CD31-PE（美國(guó)BD公司）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；倒置熒光相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Nanodrop3300紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）；流式細(xì)胞儀（EPICs-XL）（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Anip973、HUVEC常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Anip973細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL于37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集上清液，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配置成含Anip973上清濃度為62.5 μL/mL、125 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL的培養(yǎng)液備用。

1.3.2 CCK-8法檢測(cè)Anip973上清液對(duì)HUVEC增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞配制成細(xì)胞數(shù)量約為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液置于37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后吸出上清，實(shí)驗(yàn)組加入上述含不同濃度Anip973上清液的培養(yǎng)液，對(duì)照組則加入單純培養(yǎng)液，置入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h、48 h、72 h，孵育結(jié)束后取出加入CCK-8溶液、混合均勻，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。置入分光光度計(jì)中測(cè)定各孔450 nm處的光密度（optical density,OD）值，計(jì)算每組OD平均值。

1.3.3 管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn) 將Matrigel基質(zhì)膠、無(wú)菌96孔平板、槍頭等置于4 ℃冰箱內(nèi)預(yù)冷，取Matrigel膠50 μL/孔涂布于96孔平板，冰上放置20 min使基質(zhì)膠分布均勻，然后置于37 ℃孵箱中30 min使基質(zhì)膠凝固；將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)為5×105個(gè)/mL、100μL/孔接種于Matrigel表面，對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組則加入含不同濃度Anip973上清液的培養(yǎng)液，各孔終體積為200 μL。置于37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于4 h、8 h、12 h后倒置相差顯微鏡下觀察并攝片細(xì)胞間連接形成的中空管樣結(jié)構(gòu)，計(jì)數(shù)。

1.3.4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，下室中加入600 μL含20%FBS的RPMI-1640作為趨化劑，在上室內(nèi)加入100 μL HUVEC細(xì)胞懸液。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，取出小室，用預(yù)冷的無(wú)水甲醇固定15 min，10%Giemsa染色15 min，在顯微鏡下隨即選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移至濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù) 按常規(guī)方法消化、離心、收集細(xì)胞于流式管中，實(shí)驗(yàn)管分別加入FITC標(biāo)記的CD105、PE標(biāo)記的CD31，對(duì)照管加入FITC及PE同型對(duì)照；Annexin V為FITC標(biāo)記，用同樣方法標(biāo)記，室溫避光孵育30 min，清洗細(xì)胞1次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各指標(biāo)的表達(dá)率。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用單因素方差分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析：雙變量正態(tài)分布資料選用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，非雙變量正態(tài)分布資料，選用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Anip973細(xì)胞上清液對(duì)HUVEC增殖的影響 不同濃度的細(xì)胞上清液在作用24 h時(shí)對(duì)HUVEC增殖均有促進(jìn)作用、以250 μL/mL時(shí)最明顯（P=0.002）（圖1）。而在作用48 h及72 h時(shí)HUVEC增殖率并未再繼續(xù)增加，在500 μL/mL作用72 h甚至出現(xiàn)了抑制作用。因此，后續(xù)的Transwell遷移實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)選取Anip973培養(yǎng)上清液作用24 h的HUVEC進(jìn)行。

2.2 管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)觀察管狀結(jié)構(gòu)形成 各組細(xì)胞在4 h即可形成中空的管狀結(jié)構(gòu)，12 h后逐漸減少、消失，因此取4 h、8 h、12 h作為觀察點(diǎn)。上清液干預(yù)組中空樣管狀結(jié)構(gòu)較對(duì)照組明顯增多，在濃度125 μL/mL時(shí)最多（圖2，圖3）。

圖1 Anip973上清液對(duì)HUVEC增殖的影響（±s）。*：與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。Fig 1 The effect of supernatant from cultured Anip973 cells on cell proliferation of HUVEC (±s).*:Compared with the control,P＜0.05.

圖2 Anip973上清液對(duì)HUVEC成管數(shù)目的影響（±s）。*：與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。Fig 2 The effect of supernatant from cultured Anip973 cells on angiogenesis of HUVEC (±s).*:Compared with the control,P＜0.05.

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 與對(duì)照組相比，經(jīng)Anip973細(xì)胞上清液干預(yù)后，各實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)目均增多，在濃度為250 μL/mL、500 μL/mL時(shí)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4、圖5）。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記 HUVEC經(jīng)Anip973細(xì)胞上清液作用24 h后CD105陽(yáng)性表達(dá)率升高、在250μL/mL時(shí)最高；CD31表達(dá)陽(yáng)性率呈濃度依賴性升高；而Annexin V下降、在濃度為250 μL/mL時(shí)最低（圖6）。

表1 細(xì)胞表面標(biāo)記與生物學(xué)行為的相關(guān)性分析Tab 1 The correlation analysis between cell biological activities and surface maker

2.5 相關(guān)性分析 經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面標(biāo)記CD105表達(dá)陽(yáng)性率與HUVEC增殖能力及遷移能力呈正相關(guān)關(guān)系（P=0.017），而與成管能力無(wú)關(guān)；CD31表達(dá)與生物學(xué)行為無(wú)明顯相關(guān)（表1）。

3 討論

圖3 應(yīng)用HUVEC三維培養(yǎng)觀察各組細(xì)胞中空樣管狀結(jié)構(gòu)形成（×200）。A：對(duì)照；B：Ainp973上清62.5 μL/mL；C：Anip973上清125 μL/mL；D：Anip973上清250 μL/mL；E：Anip973上清500 μL/mL。Fig 3 HUVEC tube formation (×200).A:Control;B:Anip973 supernatant 62.5 μL/mL;C:Anip973 supernatant 125 μL/mL;D:Anip973 supernatant 250 μL/mL;E:Anip973 supernatant 500 μL/mL.

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC遷移能力結(jié)果。*：與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。Fig 4 Ability of migration was assayed using Transwell.*:compared with the control,P＜0.05.

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)觀察HUVEC遷移能力（×400）。A：對(duì)照；B Ainp973上清62.5 μL/mL；C：Anip973上清125 μL/mL；D：Anip973上清250 μL/mL；E：Anip973上清500 μL/mL。Fig 5 Ability of migration was assayed using Transwell (×400).A:Control;B:Anip973 supernatant 62.5 μL/mL;C:Anip973 supernatant 125 μL/mL;D:Anip973 supernatant 250 μL/mL;E:Anip973 supernatant 500 μL/mL.

圖6 Anip973上清液對(duì)HUVEC細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)率的影響（%， ±s）。*：與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。Fig 6 Effects of supernatant from cultured Anip973 cells on HUVEC surface markers(%,±s).*:compared with the control,P＜0.05.

腫瘤組織中新生血管提供持續(xù)的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)并排泄代謝產(chǎn)物，對(duì)實(shí)體瘤的生長(zhǎng)十分重要[2]。血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是新生血管形成的重要環(huán)節(jié)。McMullen等[3]指出，VEGF可通過(guò) p38-MAPK途徑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。另有研究證實(shí)[4,5]，在非小細(xì)胞肺癌腫瘤血管的生成過(guò)程中，VEGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、Ang-2影響支持細(xì)胞的募集，二者具有協(xié)同作用，共同參與調(diào)節(jié)新生血管的生成。李白翎等[6]發(fā)現(xiàn)，血管緊張素（Ang）家族與血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移有關(guān)，且當(dāng)有VEGF存在時(shí)，Ang-2可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及血管形成。上述研究提示多種促血管生成因子可協(xié)同促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移。本實(shí)驗(yàn)利用不同濃度高轉(zhuǎn)移肺腺癌細(xì)胞Anip973培養(yǎng)上清液培養(yǎng)HUVEC，觀察其對(duì)HUVEC行為及表面活性標(biāo)記的影響，旨在模擬體內(nèi)環(huán)境、闡明腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性及促進(jìn)血管生成的過(guò)程。

我們發(fā)現(xiàn)Anip973培養(yǎng)上清液對(duì)HUVEC具有促分裂增殖作用，與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致。鄭葦杭等[8]認(rèn)為腫瘤細(xì)胞上清液促進(jìn)HUVEC增殖的機(jī)制是其中的細(xì)胞因子激活周期蛋白D激酶、導(dǎo)致Cyclin D和CDK高表達(dá)，誘導(dǎo)更多細(xì)胞進(jìn)入S期、增加DNA合成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示上清液培養(yǎng)的HUVEC凋亡率較對(duì)照組降低，與李白翎等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。然而究竟是何種細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡，某一因子的最佳作用濃度為何，上清液中各因子濃度與患者血中的濃度是否一致等問(wèn)題仍待進(jìn)一步研究。

腫瘤血管生成的主要步驟還包括內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及管狀血管結(jié)構(gòu)的形成；沒(méi)有遷移及形成管狀結(jié)構(gòu)的能力，增殖活躍的血管內(nèi)皮細(xì)胞只能形成雜亂無(wú)章的細(xì)胞團(tuán)、而非能提供氧氣及營(yíng)養(yǎng)的血管。內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)偽足形成實(shí)現(xiàn)遷移[9]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)腫瘤細(xì)胞上清液作用后HUVEC遷移及形成管狀結(jié)構(gòu)能力增強(qiáng)，提示腫瘤細(xì)胞分泌的促血管生成因子可以通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移成管能力來(lái)促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，但其是否能直接形成血管內(nèi)皮細(xì)胞偽足仍待證實(shí)。

因?yàn)樵诨铙w中檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為相對(duì)困難，我們?cè)噲D尋找與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為相關(guān)的標(biāo)志，以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血管生成。本實(shí)驗(yàn)中選取介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分裂的指標(biāo)CD105[10]、與內(nèi)皮細(xì)胞之間粘著相關(guān)的CD31[10]以及凋亡標(biāo)記Annexin V[11]。結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞上清液促進(jìn)CD31、CD105表達(dá)、降低Annexin V表達(dá)，與權(quán)琳等[12]的非小細(xì)胞肺癌患者外周血中循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞（CD45-CD146+CD105+CD31+）含量高于正常對(duì)照組的臨床研究結(jié)論相似。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面標(biāo)記CD105表達(dá)率與HUVEC增殖、遷移能力呈正相關(guān)；Fonsatti等[13]報(bào)道CD105可調(diào)節(jié)信號(hào)受體I與信號(hào)受體II與腫瘤轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）相互反應(yīng)、使TGF-β能失活而對(duì)抗TGF-β對(duì)組織生長(zhǎng)及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用，從而促進(jìn)了組織的生長(zhǎng)與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；同時(shí)亦能直接參與細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并抑制凋亡[14]。而CD105與細(xì)胞遷移能力的關(guān)系卻未見報(bào)道、有待繼續(xù)探索。但CD31表達(dá)與HUVEC的增殖、遷移及成管能力等生物學(xué)行為并無(wú)相關(guān)性，與Matsumura等[15]的報(bào)道并不相符，可能系因HUVEC粘附、成管能力受多種細(xì)胞因子共同作用的影響，單獨(dú)檢測(cè)一種并不能代表整個(gè)生物學(xué)行為的改變；亦可能緣于導(dǎo)致其生物學(xué)行為的改變與CD31表達(dá)陽(yáng)性率改變的最適濃度不同所致。我們將增加Anip973細(xì)胞上清液濃度梯度，同時(shí)檢測(cè)鈣粘蛋白等粘附相關(guān)指標(biāo)，試圖尋找出與內(nèi)皮細(xì)胞粘附成管能力相關(guān)的、易于檢測(cè)的生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腫瘤細(xì)胞上清液可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、遷移成管，并引起細(xì)胞表面標(biāo)記出現(xiàn)相應(yīng)變化，提示有望通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)記推測(cè)細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。