鄧錫佳，王鵬旭，佟　彤，林　靜，姜春玲

(大連醫(yī)科大學(xué) 1.七年制2010級；2.生理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

腦缺血后necroptosis的機(jī)制及神經(jīng)保護(hù)

鄧錫佳1，王鵬旭1，佟彤1，林靜1，姜春玲2

(大連醫(yī)科大學(xué) 1.七年制2010級；2.生理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

細(xì)胞程序性壞死(necroptosis)是一種新型的細(xì)胞死亡方式。目前研究的最多的機(jī)制為死亡受體(death receptors，DRs)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。受體交互作用蛋白(receptor interaction protein ，RIP)1和3是necroptosis信號通路中極為重要的調(diào)節(jié)蛋白。并且necroptosis能誘導(dǎo)相關(guān)的炎癥反應(yīng)，加重組織損傷。新近研究表明腦缺血后腦組織的損傷與necroptosis密切相關(guān)。本文就necroptosis的機(jī)制及有關(guān)神經(jīng)保護(hù)方面的分子靶向研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

腦缺血；necroptosis；受體交互作用蛋白；炎癥反應(yīng)

[引用本文]鄧錫佳，王鵬旭，佟彤，等. 腦缺血后necroptosis的機(jī)制及神經(jīng)保護(hù)[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015,37(2)：192-195.

腦缺血后公認(rèn)的細(xì)胞死亡類型包括缺血核心區(qū)即刻發(fā)生的細(xì)胞壞死，以及隨后再灌注過程中的細(xì)胞凋亡，一般認(rèn)為凋亡是主動的程序性死亡方式，而壞死是被動的無序性過程，不受調(diào)控。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)一種非凋亡性的程序性死亡方式，有壞死的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，能在干擾半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-8(caspase-8)介導(dǎo)的凋亡時觸發(fā)[1]，被命名為細(xì)胞程序性壞死(necroptosis)，在缺血性腦血管疾病中具有重要的地位。Necroptosis的發(fā)現(xiàn)提供了一個對壞死進(jìn)行調(diào)控的機(jī)會，因此在研究腦缺血的治療方案中不僅要抗凋亡，抑制necroptosis也是至關(guān)重要的。

1　腦缺血TNFR誘導(dǎo)的necroptosis機(jī)制

缺血損傷所致的神經(jīng)元necroptosis可由DRs發(fā)起，目前對necroptosis信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的認(rèn)識主要來自腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)的誘導(dǎo)。TNF-α與其受體TNFR結(jié)合后，激活的受體可誘導(dǎo)凋亡和necroptosis：當(dāng)?shù)蛲鐾坊罨瘯r只誘導(dǎo)凋亡；當(dāng)?shù)蛲鐾繁灰种茣r則啟動necroptosis通路。TNF與TNFR1結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)募集RIP1、TNF受體相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域(TNF receptor associated death domain，TRADD)、TNF受體相關(guān)因子2(TNF receptor associated factor 2，TRAF2)、細(xì)胞凋亡抑制蛋白(cellular inhibitor of apoptosis protein，cIAP1/2)、線性泛素鏈組裝復(fù)合體(liner ubiquitin chain assembly complex，LUBAC)[2-3]，形成TNF-R1信號復(fù)合體，又稱復(fù)合物Ⅰ。由于E3泛素連接酶活化cIAP1、2和LUBAC，RIP1多泛素化，并作為信號通路的主要樞紐最后激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路。NF-κB激活后導(dǎo)致一個強(qiáng)大的促生存信號。而RIP1的泛素化控制著促生存信號與凋亡或necroptosis的轉(zhuǎn)換。去泛素化酶CYLD活化，去除RIP1的泛素和復(fù)合物Ⅰ最有可能的其他泛素成分，消除了cIAPs和LUBAC的活性，使復(fù)合物Ⅰ失去穩(wěn)定性[4]。在去泛素化的狀態(tài)下，RIP1從復(fù)合物Ⅰ上釋放，與Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域(Fas-associated death domain，F(xiàn)ADD)、TRADD和caspase-8形成復(fù)合物Ⅱ[5]。復(fù)合物Ⅱ的形成導(dǎo)致caspase-8的活化，啟動經(jīng)典的外源性凋亡途徑。當(dāng)caspase-8功能受到抑制，穩(wěn)定的復(fù)合物Ⅱa不再形成[6]。RIP3與RIP1通過共有的同型互動域(RIP homotypic interaction motif，RHIM)結(jié)構(gòu)相互作用，磷酸化，形成有害的復(fù)合物Ⅱb(也稱necrosome)，驅(qū)動necroptosis。而活化的caspase-8通過裂解RIP3，有效地阻斷necroptosis[7](圖1)。上述資料證實(shí)，RIP1和RIP3形成復(fù)合物及磷酸化是necroptosis發(fā)生的關(guān)鍵，RIP3是壞死與凋亡途徑的分路器。

圖1　TNFR誘導(dǎo)的necroptosis機(jī)制[7]Fig 1 The mechanism of TNFR-induced necroptosis[7]

至于necrosome的下游靶點(diǎn)迄今為止尚不清楚。混合排列激酶域(mixed linage kinase domain like，MLKL)基因敲除小鼠模型的研究表明，在RIP3依賴的necroptosis中MLKL是必不可少的，且介導(dǎo)necrosome形成的下游信號通路[8]。Caspase的活性有賴于一定水平的ATP，而在急性危重病理過程中，細(xì)胞能量代謝嚴(yán)重障礙，生成的ATP不足以支持caspase的功能[9]，所以在急性腦缺血的情況下，necroptosis可能是神經(jīng)元死亡的主要方式。

2　腦缺血中AIF誘導(dǎo)的necroptosis

新形式的necroptosis正不斷被公布出來，新近有文獻(xiàn)報(bào)告烷基化DNA損傷介導(dǎo)了細(xì)胞程序性死亡[10]。高水平的DNA烷基化可激活聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP1)，使細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)從線粒體上釋放出來，此過程依賴于半胱氨酸蛋白酶和Bcl-2家族成員BAX。AIF進(jìn)入胞質(zhì)后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與組蛋白H2AX和親環(huán)素A合作，引起DNA降解和細(xì)胞程序性死亡。抑制PARP1不能使Jurkat細(xì)胞免于necroptosis[1]，但RIP1缺陷的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞能抵抗AIF介導(dǎo)的壞死[11]，以上研究表明AIF誘導(dǎo)的necroptosis可能處于RIP1的下游。半胱氨酸蛋白酶的兩個家族—calpains和cathepsins，能調(diào)節(jié)AIF從線粒體的釋放，它們的阻斷劑能有效地抑制AIF介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡。如calpains和cathepsin B的雙重抑制劑E64d，在實(shí)驗(yàn)性大鼠局灶性腦缺血中提供了神經(jīng)保護(hù)作用[12]。

3　Necroptosis相關(guān)的炎癥反應(yīng)

腦缺血損傷后有大量炎性細(xì)胞因子表達(dá)和炎性細(xì)胞浸潤，引起一系列炎癥反應(yīng)，其過度表達(dá)可加重腦組織損傷。壞死細(xì)胞失去胞膜完整性，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。這些免疫原性的內(nèi)源性分子屬于損傷關(guān)聯(lián)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)。體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，在胞膜完整性破壞的情況下，necroptotic成分能通過巨胞飲與細(xì)胞外液一起被抗原呈遞細(xì)胞所攝取，啟動免疫反應(yīng)，它有比凋亡細(xì)胞的吸收更慢的動力學(xué)特征。并且necroptotic細(xì)胞持續(xù)合成蛋白質(zhì)直到漿膜透化前的最后一刻[13]，而凋亡細(xì)胞潛在的DAMPs被限制在存留的質(zhì)膜和凋亡小體中。據(jù)此可推測，與凋亡相比，necroptotic環(huán)境更加富含DAMPs。RIP1除決定細(xì)胞的生存和死亡外，在necroptotic細(xì)胞中可能也調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和危險信號分子的釋放。RIP1的激酶活性可介導(dǎo)TNF的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)[14]。盡管RIP1和RIP3在necroptosis中都很重要，但缺乏RIP1時necroptosis也能發(fā)生[15]。因此RIP3可能驅(qū)動necroptosis的發(fā)生；而RIP1可能參與特殊的細(xì)胞環(huán)境。新近研究闡明，RIP3本身可誘導(dǎo)活性氧的形成，而不是necroptosis，傳導(dǎo)免疫反應(yīng)，激活炎性體[16]。此外，RIP3的表達(dá)也取決于細(xì)胞類型。RIP3 mRNA在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中的表達(dá)比在其他細(xì)胞類型中更強(qiáng)。因此在正常條件下，可能僅有某些類型的細(xì)胞經(jīng)歷necroptosis；但在病理狀態(tài)下，RIP3表達(dá)增強(qiáng)可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡向necroptosis轉(zhuǎn)化，并加劇炎癥反應(yīng)。

4　針對腦缺血necroptosis的神經(jīng)保護(hù)

Necroptosis可被小分子化合物necrostatin-1(Nec-1)特異性抑制，它的作用靶點(diǎn)為RIP1的激酶部分，阻斷RIP1和RIP3的磷酸化[17]。在小鼠局灶性腦缺血模型中使用Nec-1，除能有效地抑制necroptosis之外，還顯著地減少了大腦中動脈閉塞后的梗死面積，提高神經(jīng)功能評分。與凋亡阻斷劑zVAD.fmk相比，Nec-1具有一個更長的給藥時間窗。更引人注目的是，Nec-1與zVAD.fmk聯(lián)合使用具有顯著的累加效應(yīng)[1]。在新生兒缺氧缺血模型中，Nec-1不僅保護(hù)大腦免受氧化性損傷，而且可顯著地阻止其后惡化的免疫細(xì)胞浸潤[18]。有文獻(xiàn)報(bào)告7-Cl-O-Nec-1(一種Nec-1的衍生物)在缺血性腦損傷模型中也具有保護(hù)作用[19]；能抑制白血病細(xì)胞necroptosis，并且比Nec-1的活性更高，而且在高濃度時也沒有非特異性的細(xì)胞毒性，小鼠靜脈注射后顯示出良好的藥代動力學(xué)特征。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)7-Cl-O-Nec-1的代謝穩(wěn)定性比 Nec-1更高[20]。所以，在細(xì)胞內(nèi)和體內(nèi)的試驗(yàn)中推薦使用7-Cl-O-Nec-1。另有報(bào)告單獨(dú)使用Nec-1或Gly14-humanin(HNG)(一種凋亡抑制劑)能減少氧和葡萄糖缺乏條件下培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元的死亡，且兩者效果相似；Nec-1和HNG聯(lián)合使用時減少神經(jīng)元死亡的效果更顯著。在小鼠大腦中動脈閉塞的模型中，單獨(dú)使用Nec-1或HNG均能減少細(xì)胞梗死的面積，聯(lián)合使用時腦梗死面積進(jìn)一步減少，并提高神經(jīng)功能評分。上述資料證實(shí)，Nec-1和HNG在缺氧和缺血再灌注損傷中具有協(xié)同性神經(jīng)保護(hù)作用[21]。凋亡和necroptosis是相互抑制的：如果凋亡被阻斷，necroptosis會增強(qiáng)；抑制necroptosis，細(xì)胞可能轉(zhuǎn)而發(fā)生凋亡。以上研究表明抗凋亡藥物和抗necroptosis藥物聯(lián)合使用將會應(yīng)用在腦缺血的新型治療中。

敲除小鼠RIP3基因能抑制蛙皮素誘導(dǎo)的胰腺炎和TNF-α介導(dǎo)的休克，而RIP1的抑制劑Nec-1不能產(chǎn)生相同的效應(yīng)[22]。FADD或caspase-8缺陷的小鼠在胚胎時期就會死亡，但可被RIP3敲除所救治。因此直接以RIP3為靶點(diǎn)的化合物被寄予厚望。目前，有關(guān)RIP3的特異性抑制劑仍在研究中，未見報(bào)告。最近發(fā)現(xiàn)necrosulfonamide(NSA)能在人類細(xì)胞中有效地阻斷TNF誘導(dǎo)的necroptosis，它的作用靶點(diǎn)為MLKL[23]。敲除RIP3基因或MLKL基因能阻斷TNF誘導(dǎo)的necroptosis，然而抑制其中一種蛋白不能阻斷細(xì)胞死亡，但能使TNF誘導(dǎo)的necroptosis向RIP1依賴的凋亡轉(zhuǎn)化[24]。盡管TNFR誘導(dǎo)的信號通路是目前研究得最多的模型，但necroptosis也能被多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路所觸發(fā)，包括其他死亡受體(如Toll樣受體)和細(xì)胞內(nèi)分子(如RHIM域包含蛋白DAI和TRIF)，提示它們可能成為未來的靶向治療位點(diǎn)。

5　結(jié)　語

綜上所述，近年來的研究表明，與凋亡一樣，某些壞死是一個可被高度調(diào)控的過程，這在腦缺血的病理生理和治療方面有重要的意義。盡管已發(fā)現(xiàn)necroptosis的某些控制和執(zhí)行的分子機(jī)制，但關(guān)于necroptosis的研究還處于初始階段。未來研究的焦點(diǎn)在于深入闡明不同的機(jī)制，探討它們在體內(nèi)的聯(lián)系，并致力于新型的神經(jīng)保護(hù)藥物的研發(fā)。

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本刊被國際重要數(shù)據(jù)庫收錄情況

截止2011年，本刊已被8種國際重要數(shù)據(jù)庫收錄。包括：(1)美國《化學(xué)文摘》(CA, Chemical Abstracts)；(2)荷蘭《醫(yī)學(xué)文摘》(EM，Excepta Media)，(3)波蘭《哥白尼索引》(IC, Index of Copurnicus)；(4)美國《劍橋科學(xué)文摘(自然科學(xué)版)》(CSA Natural Science)；(5)美國《烏利希期刊指南》(Ulrich PD，Ulrich's Periodicals Directory)；(6)荷蘭《文摘與引文數(shù)據(jù)庫》(Scopus)；(7)英國《農(nóng)業(yè)與生物科學(xué)研究文摘》(CAB Abstracts，Centre for Agriculture and Bioscience Abstracts)；(8)英國《公共健康》(Global Health，Centre for Agriculture and Bioscience Abstracts)。

Mechanisms and neuroprotection of necroptosis after cerebral ischemia

DENG Xi-jia1,WANG Peng-xu1,TONG Tong1,LIN Jing1,JIANG Chun-ling2

(1.Seven-yearGraduateProgram2010; 2.DepartmentofPhysiology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

Necroptosis is a new type of cell death. Up to now the best investigated mechanism is death receptors-induced signaling pathway. Receptor interaction protein 1 (RIP1) and 3 (RIP3) play crucial roles in the signaling pathway of necroptosis. In addition,necroptosis can induce inflammation and increase tissue damage. Recent studies have shown that brain tissue damage is closely related to necroptosis after cerebral ischemia. In this article,we have reviewed the mechanisms of necroptosis and the molecular targets of neural protection.

cerebral ischemia； necroptosis； RIP； inflammation

綜述10.11724/jdmu.2015.02.22

遼寧省優(yōu)秀中青年骨干教師基金項(xiàng)目(2007)

鄧錫佳(1992-)，女，江蘇無錫人，七年制學(xué)生。E-mail：xijia_deng@163.com

姜春玲，教授。E-mail：chunling_jiang2006@163.com

R743.31

A

1671-7295(2015)02-0192-04

2014-05-09；

2015-03-03)