王東俠，劉金秋，夏云龍,譚茗月

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 大連 116011； 2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 心內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠左室肥厚的抑制作用

王東俠1，劉金秋1，夏云龍1,譚茗月2

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 大連 116011； 2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 心內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

目的探討重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心室肥厚的干預(yù)作用及機(jī)制。方法通過(guò)腹主動(dòng)脈縮窄法建立大鼠壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心室肥厚模型后，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)，模型組(AAC組)，rhEPO干預(yù)組(rhEPO組)，4周后處死大鼠，計(jì)算左室質(zhì)量指數(shù)，心肌常規(guī)HE染色觀察心室肌病理變化，分別用黃嘌啉氧化酶法、比色法檢測(cè)心肌中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。用雙夾心ELISA法測(cè)定心室組織的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，比較各組差異。結(jié)果4周后AAC組大鼠心肌顯示明顯的心肌肥厚，心室質(zhì)量指數(shù)、MDA以及TNF-α的含量與Sham組大鼠比較均明顯增高，而SOD的含量顯著降低(P<0.01)。rhEPO干預(yù)后大鼠未顯示明顯的心肌肥厚，與AAC組大鼠相比，心室質(zhì)量指數(shù)、MDA以及TNF-a的含量明顯降低，SOD的含量則增高(P<0.01)。結(jié)論rhEPO可以抑制壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心室肥厚的形成，其部分機(jī)制可能與其抑制心肌中的過(guò)氧化反應(yīng)及抗炎效應(yīng)有關(guān)。

心室肥厚； 壓力超負(fù)荷； 氧化應(yīng)激； 炎癥； 促紅細(xì)胞生成素

[引用本文]王東俠，劉金秋，夏云龍,等. 重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠左室肥厚的抑制作用[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015,37(3)：227-231.

心室肥厚是高血壓的主要并發(fā)癥之一，無(wú)論對(duì)于總死亡率還是對(duì)于心血管事件的發(fā)病率和死亡率，心室肥厚都是一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，但其發(fā)病機(jī)制還未完全闡明。大量體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)炎性細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激在壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是由腎臟分泌的細(xì)胞因子，近年的研究發(fā)現(xiàn)，EPO受體廣泛表達(dá)于人體內(nèi)的非造血組織包括肝臟、大腦、子宮、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。它們與EPO結(jié)合激活某些信號(hào)途徑，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成等多種與促造血作用無(wú)關(guān)的組織和細(xì)胞保護(hù)作用[1]。重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)對(duì)心血管疾病的治療作用已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，但其對(duì)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心室肥厚作用的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)旨在探索rhEPO對(duì)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心室肥厚的抑制作用及其可能機(jī)制。

1　材料和方法

1.1動(dòng)物與材料

清潔級(jí)Wister大鼠28只(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)，雌雄不拘，體重160～200 g。重組人促紅細(xì)胞生成素rhEPO(益比奧,沈陽(yáng)三藥業(yè)公司)、SOD、MDA檢測(cè)盒、考馬斯亮藍(lán)(南京建成生物公司提供)、大鼠TNF-αELLISA試劑盒(深圳晶美生物技術(shù)公司)。

1.2動(dòng)物分組

大鼠28只隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組(Sham組)8只(皮下注射同等量生理鹽水)，造模術(shù)后隨機(jī)分為：模型組(AAC組)10只(皮下注射同等量生理鹽水)；rhEPO組(rhEPO組)10只(皮下注射rhEPO)，其中rhEPO(1000 U/kg，1周3次)行皮下注射。

1.3壓力超負(fù)荷大鼠模型的制作

Wister大鼠行4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，在劍突下腹正中切口，分層打開腹腔，在腎動(dòng)脈分支以上鈍性游離腹主動(dòng)脈，將7號(hào)注射器針頭平行置于腹主動(dòng)脈上，再用4號(hào)手術(shù)絲線將腹主動(dòng)脈和注射器一同結(jié)扎，然后緩慢將注射器撤出，關(guān)腹后分層縫合。使得大鼠腹主動(dòng)脈直徑縮窄為0.7 mm。Sham組開腹后將手術(shù)絲線穿過(guò)腹主動(dòng)脈，除不縮窄腹主動(dòng)脈以外，其他操作與AAC組完全相同。術(shù)后3天內(nèi)給予青霉素腹腔注射(4000 U/kg)，以預(yù)防感染。

1.4給藥方法

rhEPO組造模后給予皮下注射rhEPO(1000 U/kg，1周3次)。Sham組和AAC組大鼠術(shù)后正常飲食，并分別給予皮下注射等容量生理鹽水。上述操作持續(xù)4周。

1.5左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)的計(jì)算

4周后大鼠禁食不禁水12 h，行4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，麻醉后稱體重，然后開胸迅速取出心臟，冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干，剪去心房及血管組織，沿室間隔分離左心室，包括室間隔，用電子天平稱重。左心室質(zhì)量除以體重得左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI) 。將其它心肌組織標(biāo)本置于液氮中保存。

1.6心肌組織形態(tài)學(xué)觀察

取大鼠左心室游離壁心肌為標(biāo)本，置于4%福爾馬林固定心肌組織，然后作石蠟包埋。后以切片機(jī)切成5～10 μm厚的組織切片，貼于載玻片上，脫蠟后常規(guī)HE染色。光鏡下觀察心肌細(xì)胞及心肌間質(zhì)的變化，攝片對(duì)比。

1.7心肌丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量的檢測(cè)

取大鼠左心室游離壁心肌為標(biāo)本，用冰生理鹽水沖洗，取約200 mg的左室心肌，剪碎加入2 mL冰生理鹽水，在冰水浴中進(jìn)行組織勻漿破碎，制成10%的心肌組織勻漿后3500 r/min離心15 min ，取上清液放入-20 ℃冰箱中待用。標(biāo)本蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)，檢測(cè)方法嚴(yán)格按操作說(shuō)明進(jìn)行。分別用比色法、硫代巴比妥酸法檢測(cè)心肌中MDA和SOD的含量。根據(jù)試劑說(shuō)明書的公式計(jì)算心肌中所含MDA含量。結(jié)果以每毫克蛋白心肌的含量表示。根據(jù)試劑說(shuō)明書提供的公式計(jì)算心肌中SOD的含量。結(jié)果以每毫克蛋白心肌組織的活力單位表示。

1.8心肌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量的檢測(cè)

心室肌的取用及組織的勻漿同前，心肌組織的TNF-α含量用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±SD表示。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多樣本均數(shù)間比較采用One-wayANOVA檢驗(yàn)，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1一般觀察

28只大鼠中1只死于麻醉意外，2只分別在術(shù)后第1、2天因急性心力衰竭而死亡。1只死于術(shù)后感染。其中AAC組、rhEPO組分別死亡2只，其余均正常生存。

2.2左心室質(zhì)量指數(shù)

AAC組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)與Sham組比較增高了39.4%，差異有顯著性意義(P<0.01)。用rhEPO干預(yù)后明顯降低了大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)，與AAC組大鼠相比差異有顯著性意義(P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠心臟的病理學(xué)指標(biāo)Tab 1 LVW and LVWI of rats

2.3心肌病理變化

Sham組大鼠心肌無(wú)明顯病理改變。AAC組大鼠的心室肌顯示：心肌纖維增粗、斷裂，細(xì)胞核增大，深染。間質(zhì)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；心肌小動(dòng)靜脈血管壁增厚，腔變狹窄；周圍增多的膠原纖維包繞；局部心肌細(xì)胞缺血壞死后瘢痕形成。而rhEPO干預(yù)后大鼠的心室肌病理變化則較輕，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞混濁腫脹，心肌纖維輕度的增粗，但無(wú)明顯的紊亂、斷裂，間質(zhì)有少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小血管管壁稍增厚。見圖1。

圖1　各組大鼠心肌組織病理變化(HE ×400)Fig 1 pathology of myocardial tissue in rats(HE ×400)

2.4心肌氧化產(chǎn)物MDA、抗氧化酶SOD的含量

AAC組大鼠心肌中氧化產(chǎn)物MDA含量與Sham組大鼠比較明顯增高，抗氧化酶SOD含量則明顯降低，差異有顯著性意義(P<0.01)。而rhEPO干預(yù)后的大鼠，心肌氧化產(chǎn)物MDA含量比AAC組大鼠明顯降低，抗氧化酶SOD含量則顯著增高(P<0.01)。見表2。

2.5心肌TNF-α的含量

AAC組大鼠心肌炎癥細(xì)胞因子TNF-α含量比Sham組大鼠明顯增高，差異有顯著性意義(P<0.01)。在rhEPO干預(yù)后大鼠的心肌炎癥細(xì)胞因子TNF-α含量明顯降低，與AAC組相比差異有顯著性意義(P<0.01)。見表2。

表2　各組大鼠心肌MDA、SOD、TNF-α的含量Tab 2 Changes incontent of MDA,SOD and TNF-α of heart tissue of rats　±s)

3　討　論

心室肥厚是壓力超負(fù)荷的一種代償，如壓力負(fù)荷持續(xù)存在，最終會(huì)進(jìn)展至心力衰竭，近年來(lái)大量的實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)，氧化應(yīng)激與心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到大鼠心肌中氧化產(chǎn)物MDA的變化，AAC組大鼠與Sham組大鼠比較，含量明顯增高，而AAC組大鼠抗氧化酶SOD的含量與Sham組大鼠比較則顯著降低。表明AAC組大鼠在心肌肥厚形成同時(shí)伴有氧化產(chǎn)物的增加，而抗氧化性減弱，處于過(guò)氧化狀態(tài)。結(jié)果提示氧化應(yīng)激可能參與了壓力超負(fù)荷大鼠心肌肥厚的形成。既往文獻(xiàn)報(bào)道在多種高血壓動(dòng)物模型中均可觀察到ROS活性增高，AngⅡ等神經(jīng)體液因素所引起的多種病理變化與誘導(dǎo)ROS升高有關(guān)，而且ROS本身可能也是高血壓的一個(gè)致病因素[2]。給予抗氧化治療可減輕壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心室肥厚[3]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大是由ROS所介導(dǎo)的，抗氧化治療能夠減輕AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大[4]，而ROS在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮多種作用，包括細(xì)胞凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)，NO活性的降低及各種蛋白激酶的激活[5]。

除此之外，本研究還觀察到AAC組大鼠心肌中促炎癥細(xì)胞因子TNF-α含量明顯增加，并且從心肌組織形態(tài)上可以看到，AAC組的大鼠心肌中有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示壓力超負(fù)荷大鼠心肌肥厚形成時(shí)還伴有心肌中促炎癥細(xì)胞因子的釋放。即炎癥可能參與了壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心室肥厚的形成。既往也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)在壓力負(fù)荷增加時(shí)，心肌中TNF-α含量也會(huì)增加，壓力負(fù)荷增加時(shí)TNF-α足以引起心肌蛋白質(zhì)合成增加[6]。過(guò)度表達(dá)還會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，收縮功能降低。TNF-α體外實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，促進(jìn)細(xì)胞胚胎基因及蛋白的表達(dá)[7]。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也觀察到相似的結(jié)果[8]。

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是具多功能效應(yīng)的細(xì)胞因子，當(dāng)機(jī)體受到缺血缺氧刺激時(shí)，EPO可以在缺氧誘導(dǎo)因子的作用下分泌增加。近年來(lái)的研究已經(jīng)證明，不僅腎小管周間質(zhì)細(xì)胞可以分泌EPO，而且體內(nèi)很多器官和組織包括肝臟、大腦、子宮、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及心肌細(xì)胞等都可以產(chǎn)生EPO和表達(dá)EPO受體，近幾年大量動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)[9-13]，它可以通過(guò)減少炎癥、氧化應(yīng)激對(duì)心肌的損傷，阻止內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)新生血管生成，從而在缺血再灌注損傷、心肌梗死、心力衰竭及一些非缺血性心肌病中發(fā)揮重要的心血管保護(hù)作用。而在本實(shí)驗(yàn)中觀察到AAC組大鼠在經(jīng)rhEPO干預(yù)后，左心室質(zhì)量指數(shù)明顯下降了，rhEPO組大鼠心肌切片的常規(guī)HE染色顯示心肌組織形態(tài)病理變化明顯減輕。上述結(jié)果均提示rhEPO對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心室肥厚的形成有一定的抑制作用。

為了進(jìn)一步探討rhEPO抑制心室肥厚的作用機(jī)制，本研究觀察了rhEPO對(duì)大鼠心肌中氧化產(chǎn)物MDA、抗氧化酶SOD和促炎癥因子TNF-α的含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)rhEPO干預(yù)后，大鼠的心肌氧化產(chǎn)物MDA含量明顯降低，而抗氧化酶SOD含量則明顯增高。提示rhEPO可以降低壓力超負(fù)荷大鼠氧化產(chǎn)物的生成，提高抗氧化酶的含量，從而發(fā)揮抗氧化作用，抑制氧化應(yīng)激對(duì)心肌的損傷。由此分析可以得出，rhEPO對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心室肥厚形成的抑制效應(yīng)可能與其抗氧化作用有關(guān)。同時(shí)觀察到rhEPO組大鼠心肌中促炎癥細(xì)胞因子TNF-α的含量明顯降低，從組織形態(tài)上也可看出，rhEPO干預(yù)后大鼠心肌間質(zhì)中的炎癥細(xì)胞明顯減少。表明rhEPO還可以抑制壓力超負(fù)荷大鼠心肌中促炎癥細(xì)胞因子的釋放，從而抑制壓力超負(fù)荷大鼠心肌中的炎癥反應(yīng)對(duì)心肌的損傷。由此推論rhEPO通過(guò)抑制心肌中炎癥細(xì)胞因子的釋放，保護(hù)炎癥對(duì)心肌的損傷，也可能是rhEPO發(fā)揮對(duì)心室肥厚的抑制作用的機(jī)制之一。此外研究表明ROS可以調(diào)控多種基因的表達(dá)，與細(xì)胞的凋亡、增殖及炎癥相關(guān)[14]。在壓力負(fù)荷大鼠心肌中ROS可能通過(guò)JNK信號(hào)通道增加組織化學(xué)趨化蛋白-1(MCP-1)的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控促炎癥因子的表達(dá)[15]。

本研究結(jié)果提示，rhEPO對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠的心室肥厚有抑制作用，其部分機(jī)制可能與rhEPO通過(guò)抑制氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制促炎癥因子的釋放，從而抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)對(duì)心肌損傷的作用有關(guān)。

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Effect of rhEPO on left ventricular hypertrophy induced by pressure-overload

WANG Dong-xia1, LIU Jin-qiu1, XIA Yun-long1,TAN Ming-yue2

(1.DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China; 2.DepartmentofCardiology,SecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410000,China)

Objective To investigate the effect of rhEPO on left ventricular hypertrophy induced by pressure-overload in rats. Methods The rat model were established by coarctation of abdominal aorta (AAC) in Wister rats. Rats were randomly allocated to three groups: Sham group, AAC group, rhEPO group. Rats in rhEPO group were injected rhEPO (1000 U/kg) subcutaneously for three times a week after operation. Rats in Sham group were given the same volume of physiological saline. All rats were killed after 4 weeks. Left ventricular mass index (LVMI) was calculated. Myocardial histological changes were observed with routine HE stain, and the level of SOD, MDA, TNF-α in myocardium were detected respectively. Results Compared with the sham group, there were significant cardiac hypertrophy, higher LVWI and level of MDA and TNF-α (P<0.01), while lower SOD level (P<0.01) in myocardium in rats of AAC group. However, compared with the AAC group, cardiac hypertrophy was significantly relieved in rhEPO group, as well as LVMI and the levels of MDA, TNF-α decreased, SOD level improved in myocardium (P<0.01). Conclusion RhEPO could attenuates left ventricular hypertrophy induced pressure overload via its function of antioxidation and anti-inflammatory.

ventricular hypertrophy; pressure overload; oxidative stress; inflammation; erythropoietin

論著10.11724/jdmu.2015.03.05

王東俠(1981-),女,河北張家口人,主治醫(yī)師。E-mail:wangdx1980@aliyun.com

夏云龍，教授。E-mail: yunlong.xia@gmail.com

R3

A

1671-7295(2015)03-0227-05

2015-01-12；

2015-04-19)