王慧鋼，于思淼，邱　瑾，劉振林

（1天津市濱海新區(qū)大港小王莊鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，天津300273；2天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；3天津安捷臨奧腦科醫(yī)院神經(jīng)外科，天津300402）

·實(shí)驗(yàn)研究·

SUMO-2/3活化介導(dǎo)丹參對(duì)缺血神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制*

王慧鋼1，于思淼2，邱瑾3，劉振林3

（1天津市濱海新區(qū)大港小王莊鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，天津300273；2天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；3天津安捷臨奧腦科醫(yī)院神經(jīng)外科，天津300402）

［目的］從類泛素化（SUMO）角度研究丹參對(duì)缺血性腦血管病后的神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制。［方法］原代分離培養(yǎng)SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，免疫熒光方法予以鑒定；制作神經(jīng)元體外氧糖剝奪（OGD）模型，分為對(duì)照組、OGD組和丹參治療組；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）含量，原位凋亡法檢測(cè)凋亡細(xì)胞率；蛋白印記和免疫熒光方法檢測(cè)SUMO-1和SUMO-2/3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定量和定位情況。［結(jié)果］所培養(yǎng)細(xì)胞高表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和微管相關(guān)蛋白-2（MAP-2），膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP），神經(jīng)元純度大于95%；ELISA結(jié)果顯示，3組中LDH含量對(duì)照組＜丹參治療組＜OGD組；凋亡細(xì)胞率對(duì)照組＜丹參治療組＜OGD組；蛋白印記結(jié)果顯示，神經(jīng)元接受OGD處理后SUMO-2/3的蛋白表達(dá)量明顯上升（P＜0.05），但SUMO-1無明顯變化（P＞0.05），而丹參治療能夠進(jìn)一步提高SUMO-2/3的表達(dá)（P＜0.05）；免疫熒光結(jié)果顯示OGD神經(jīng)元發(fā)生了SUMO-2/3由細(xì)胞漿向細(xì)胞核的明顯移位現(xiàn)象，而丹參治療能夠進(jìn)一步增強(qiáng)這種效果。［結(jié)論］丹參能夠通過誘導(dǎo)SUMO-2/3，而非SUMO-1的活化機(jī)制，發(fā)揮對(duì)缺血神經(jīng)元的保護(hù)作用。

缺血性腦血管病；小類泛素蛋白；丹參；神經(jīng)元

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.07.10

腦卒中是嚴(yán)重危害人類生命健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一［1］。丹參能夠通過擴(kuò)張心腦血管，減少氧自由基生成，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等機(jī)制改善腦卒中后的氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加神經(jīng)保護(hù)作用［2］。新近研究發(fā)現(xiàn)，一種類泛素蛋白（SUMO）在腦缺血發(fā)生后可被顯著激活，并對(duì)神經(jīng)元具有肯定的保護(hù)作用［3］。但到目前為止，尚未見到有關(guān)于中藥丹參對(duì)卒中后SUMO通路調(diào)控的報(bào)道。本研究旨在通過觀察丹參對(duì)體外培養(yǎng)的氧糖剝奪（OGD）神經(jīng)元中3個(gè)最主要的SUMO家族成員SUMO-1～3的表達(dá)調(diào)控，推測(cè)SUMO通路是否介導(dǎo)了丹參對(duì)缺血神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制，為未來基于SUMO這類小分子蛋白物質(zhì)的中成藥物開發(fā)提供有價(jià)值的參考和借鑒。

1　資料與方法

1.1試劑與動(dòng)物10mL裝丹參注射液（杭州正大青春寶藥業(yè)公司）；改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM，美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青）；乳酸脫氫酶（LDH）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒（武漢博士德）；原位凋亡檢測(cè)試劑盒（北京百浩）；兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、微管相關(guān)蛋白（MAP-2）和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）均購自北京中杉公司，兔抗大鼠SUMO-1和SUMO-2/3（北京中原領(lǐng)先）；孕齡18 d SD大鼠4只購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，飼養(yǎng)于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液病研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，無菌，溫度20～25℃，濕度（50±5）%。

1.2神經(jīng)元原代培養(yǎng)將SD大鼠脫頸處死，75%乙醇消毒5min，在超凈臺(tái)上取出全腦，小心剝離并去除腦膜及脈絡(luò)叢，分離雙側(cè)海馬，剪成約1mm3的小塊，在孵箱中以0.25%胰蛋白酶消化5min。以1.0×106密度接種細(xì)胞到經(jīng)多聚賴氨酸鋪板過夜處理的培養(yǎng)皿中，37℃、5%二氧化碳（CO2）、飽和濕度條件下培養(yǎng)。6～8 h細(xì)胞貼壁后，換培養(yǎng)基為含2% B27的Neurobasal，含有B27和0.5mmol/L的谷氨酰胺。培養(yǎng)2～3 d培養(yǎng)基中加入8～10μmol的阿糖胞苷，以抑制或阻止非神經(jīng)細(xì)胞和原代膠質(zhì)增殖。每3天用Neuronbasal使用液半量換液。

1.3免疫熒光方法鑒定將培養(yǎng)第8天的細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定30min，1%Triton X-100室溫處理10min，10%羊血清封閉30min，甩去血清，滴加不同稀釋度的MAP-2（1∶500）、GFAP（1∶500）、NSE（1∶500）抗體，置濕盒中4℃過夜，空白對(duì)照以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗；轉(zhuǎn)日滴加適當(dāng)比例稀釋的異硫氰酸熒光素（FITC）或四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）標(biāo)記二抗，置濕盒中37℃孵育45min；封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4神經(jīng)元OGD模型的建立取培養(yǎng)第8天后的神經(jīng)元進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。共分為以下3組：1）對(duì)照組：?jiǎn)渭兒ｑR神經(jīng)元，不進(jìn)行其他干預(yù)處理。2）OGD組：細(xì)胞置于OGD液中處理4 h，然后吸去OGD液，PBS洗滌，加入標(biāo)準(zhǔn)DMEM高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20 h。3）以含200mg/L丹參注射液的OGD液取代單純OGD液，其他步驟同2）。

1.5 LDH活力檢測(cè)上述分組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后按照ELISA說明書對(duì)條件培養(yǎng)液進(jìn)行LDH含量檢測(cè)。

1.6細(xì)胞原位凋亡檢測(cè)將繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞于4%中性甲醛固定10min，3%過氧化氫甲醇中浸洗10min，用蛋白酶K孵育15min，PBS洗滌后加入50μL的TUNEL反應(yīng)混合液，在濕盒中37℃孵育60min，4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染，封片及鏡下觀察。計(jì)算細(xì)胞凋亡率（細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%）。

1.7 Western blot方法提取細(xì)胞總蛋白，電泳及轉(zhuǎn)膜后脫脂奶粉封閉1 h，滴加相應(yīng)一抗，抗體稀釋度為SUMO-1（1∶2 000）、SUMO-2/3（1∶2 000）和βactin（1∶500），4℃水平搖床孵育過夜，次日使用辣根酶標(biāo)記的1∶500稀釋二抗孵育2 h。凝膠成像系統(tǒng)掃描光密度值，Quantity One軟件進(jìn)行定量分析。

1.8細(xì)胞免疫熒光方法方法同1.3，抗體稀釋度為SUMO-1（1∶1 000）和SUMO-2/3（1∶1 000）。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，組間兩兩比較采用Dunnett’sT3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1神經(jīng)元鑒定結(jié)果見圖1，TRITC熒光標(biāo)記顯示為紅色細(xì)胞漿著色，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記顯示為綠色細(xì)胞漿著色。可見所培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)神經(jīng)元特異標(biāo)記蛋白NSE，其陽性表達(dá)率為（96.47±3.45）%和MAP-2，其陽性表達(dá)率為（96.22±3.21）%，幾乎不表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白GFAP，其陽性表達(dá)率為（0.79±0.27）%，同時(shí)綜合上述鑒定結(jié)果，可見所培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞純度較高，即大于95%，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 LDH濃度和細(xì)胞凋亡率測(cè)定結(jié)果由ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，對(duì)照組中未經(jīng)任何處理的神經(jīng)元LDH水平非常低，在OGD組神經(jīng)元LDH的水平明顯增高（P＜0.01），丹參治療組LDH水平則明顯低于OGD組（P＜0.05）；細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了相似的趨勢(shì)，見表1、圖2。

圖1　神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白熒光檢測(cè)Fig.1 The expression of neural cell m arker proteins detected by fluorescenceassay

表1　不同組別乳酸脫氫酶濃度及細(xì)胞凋亡率比較（x±s）Tab.1 Com parison of lactate dehyd rogenase concentration and the rateof cellapoptosisamong differentgroups（x±s）

圖2　 TUNEL方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Cellapoptosisdetected by TUNEL assay

2.3 Western blot結(jié)果由結(jié)果可以看出游離及共價(jià)結(jié)合狀態(tài)的SUMO-1蛋白表達(dá)水平在3組間沒有明顯變化（F=0.978，P＞0.05），游離狀態(tài)的SUMO-2/3在3組間比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.237，P＞0.05）但共價(jià)結(jié)合狀態(tài)的SUMO-2/3在3組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=11.417，P＜0.05），見圖3。

2.4免疫熒光結(jié)果SUMO-1蛋白在3組中均定位于細(xì)胞漿，3組間無明顯變化；SUMO-2/3在對(duì)照組主要表達(dá)于細(xì)胞漿，接受OGD處理后SUMO-2/3發(fā)生了明顯向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，在丹參治療組這種趨勢(shì)進(jìn)一步加劇，見圖4。

圖3　 W estern blot檢測(cè)SUMO蛋白表達(dá)水平Fig.3 Expression of SUMO detected by W estern blotassay

圖4　 SUMO成員在不同組中的表達(dá)定位熒光檢測(cè)Fig.4 Expression and localization of SUMO members in the differentgroups detected by fluorescenceassay

3　討論

腦卒中是一種突發(fā)的腦血液循環(huán)障礙性疾病，是指因各種誘發(fā)因素引起腦內(nèi)動(dòng)脈狹窄，閉塞或破裂，而造成急性腦血液循環(huán)障礙，臨床上表現(xiàn)為一過性或永久性腦功能障礙的癥狀和體征［4-6］。主要包括腦梗死、腦出血等疾病，其原因可由動(dòng)脈粥樣硬化加重致血管過度狹窄、栓子脫落、動(dòng)脈瘤破裂或顱內(nèi)腫瘤內(nèi)灶性出血等引起［7-9］。當(dāng)前臨床治療主要以外科手術(shù)及血管內(nèi)介入治療為主，但這些治療均需要在發(fā)病短時(shí)間內(nèi)接受治療，且治療后期的神經(jīng)功能恢復(fù)大多并不理想，而對(duì)于偏遠(yuǎn)地區(qū)的腦卒中患者受醫(yī)療條件的限制，使死亡和致癱風(fēng)險(xiǎn)倍增［10-13］。因此有必要進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腦卒中的病情演進(jìn)機(jī)制，并尋找新的有效的救治性藥物。

SUMO是一類結(jié)構(gòu)與泛素蛋白相似，但功能迥異的蛋白質(zhì)翻譯后修飾小分子蛋白［14-15］。與泛素蛋白降解靶蛋白機(jī)制不同，SUMO常常與泛素競(jìng)爭(zhēng)靶蛋白結(jié)合位點(diǎn)，抑制蛋白遭到由泛素介導(dǎo)的蛋白酶的降解，故而多對(duì)靶蛋白起到一定的保護(hù)作用［16-18］。有研究表明，腦組織急性缺血缺氧發(fā)生后，會(huì)誘發(fā)SUMO循環(huán)通路的快速激活和反應(yīng)，特別是使原本存在于細(xì)胞漿中游離狀態(tài)的SUMO-2/3快速與大量靶蛋白結(jié)合，使部分蛋白質(zhì)免于泛素介導(dǎo)的蛋白酶降解，同時(shí)啟動(dòng)細(xì)胞核做出積極的反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生新的神經(jīng)保護(hù)性蛋白，發(fā)揮神經(jīng)損傷修復(fù)作用［19］。

基于上述理論，筆者首次對(duì)傳統(tǒng)血管保護(hù)性中藥丹參進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，旨在從類泛素化角度研究丹參對(duì)缺血性腦血管病后的神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制。首先使用原代分離培養(yǎng)法獲得了高純度的SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，以其為研究對(duì)象，制作了神經(jīng)元OGD模型，并給予丹參治療。LDH屬糖酵解酶，LDH測(cè)定常用于診斷心肌梗死、肝病和某些惡性腫瘤，其含量的顯著增高常反應(yīng)病情的嚴(yán)重程度［20］。在體外實(shí)驗(yàn)中，常被用來檢測(cè)所培養(yǎng)細(xì)胞的受損害程度。本研究的結(jié)果顯示，在所檢測(cè)的3組中LDH含量對(duì)照組＜丹參治療組＜OGD組，提示丹參治療組的神經(jīng)元受損程度明顯低于OGD組，這種趨勢(shì)在原位凋亡實(shí)驗(yàn)中得到相同的驗(yàn)證。這均反應(yīng)丹參作為一種血管保護(hù)性藥物對(duì)于因缺血所致的神經(jīng)元損傷具有肯定的神經(jīng)保護(hù)作用。

為進(jìn)一步研究其內(nèi)在機(jī)制，筆者利用蛋白印記方法對(duì)SUMO1-3的蛋白表達(dá)水平和蛋白定位進(jìn)行研究。本研究結(jié)果顯示，神經(jīng)元接受OGD處理后SUMO-2/3的蛋白表達(dá)量明顯上升，但SUMO-1無明顯變化，而丹參治療能夠進(jìn)一步提高SUMO-2/3的表達(dá)；免疫熒光結(jié)果顯示OGD神經(jīng)元發(fā)生了SUMO-2/3由細(xì)胞漿向細(xì)胞核的明顯移位現(xiàn)象，而丹參治療能夠進(jìn)一步增強(qiáng)這種效果。由此得出結(jié)論，丹參能夠通過活化SUMO-2/3，而非SUMO-1的機(jī)制，發(fā)揮對(duì)缺血神經(jīng)元的保護(hù)作用。

總之，通過本實(shí)驗(yàn)筆者首次報(bào)道傳統(tǒng)中藥丹參可以通過激活SUMO循環(huán)通路途徑，誘導(dǎo)多個(gè)靶蛋白的SUMO化作用，對(duì)受損神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。這一結(jié)論豐富了丹參對(duì)于腦卒中的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制理論，為新型小分子藥物的研發(fā)提供了新的參考。參考文獻(xiàn)：

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（本文編輯：馬英，滕曉東）

Theactivation of SUMO-2/3mediated protection effectsof Salviam iltiorrhiza on ischem ic neurons

WANGHui-gang，YU Si-m iao，QIU Jin，LIU Zhen-lin
（1.Xiaowangzhuang Community Health Service Center，Dagang District，BinhaiNew Areaof Tianjin，Integrated TraditionalChineseand Western Medicine，Tianjin 300273，China；2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Neurosurgenry Department，Tianjin Anjie LinaoBrain Hospital，Tianjin 300402，China）

［Objective］To study the protectionmechanism of salviamiltiorrhiza on neuronsafter ischem ic cerebral vascular disease from the field ofsmallubiquitin-like protein（SUMOs）.［M ethods］The neuronswere cultured from the hippocampalof SD rats，and identified by fluorescence immunoassaymethod.Aftermaking oxygenglucose deprivation（OGD）model for neurons，we designed threegroups for thisstudy:controlgroup，OGDgroup and salviamiltiorrhizagroup.The lactate dehydrogenase（LDH）contentwasdetected by ELISA，and apoptosisby apoptosis in situ.Then the quantitative expression and intracellular localization of SUMO-1and SUMO-2/3 proteinswere detected bywestern blotand immunofluorescencemethod.［Results］The cultured cellswerewith high expression ofneuron specific enolase（NSE）and microtubule associated protein-2（MAP-2），but low levelofglial fibrillary acidic protein（GFAP），the neuron puritygreater than 95%.ELISA results showed that the contentof LDH in the threegroupswere controlgroup＜Salviamiltiorrhizagroup＜OGDgroup，as well as the results from apoptosis.Western blotting results showed that the level of SUMO-2/3 of neurons received OGD treatmentwas raised significantly（P＜0.05），buttherewasno significantchange in SUMO-1（P＞0.05），and salviamiltiorrhiza treatmentcan further improve the expression ofSUMO-2/3（P＜0.05）.Immunohistochemistry resultsshowed that therewasapparentshiftof SUMO-2/3 from cytoplasm to nucleus in OGD neurons，and salviamiltiorrhiza treatment could further enhance this effect.［Conclusion］Salviamiltiorrhiza can induce SUMO-2/3 activation and enhance protecteffectson ischemic neurons.

ischemic cerebrovascular disease；smallubiquitin like protein；Salviamiltiorrhiza；neuron

R743

A

1672-1519（2015）07-0420-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81471175）。

王慧鋼（1973-），男，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)科系統(tǒng)疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療。

劉振林，E-mail：wjzhenlin817@163.com

（2015-01-28）