周輝 羅媚 文亦戈 馬安迪 羅永忠 易青 陳建華 肖玲

肺癌是最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，生存率低，預后差，居惡性腫瘤死亡率首位[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌的80%-85%，研究[2]發(fā)現(xiàn)慢性炎癥與腫瘤發(fā)生相關。Toll樣受體5（toll-like receptor 5, TLR5）是toll樣受體家族中的一員，是一類最具有特征性的模式受體分子，能募集多種配體蛋白，激發(fā)信號轉導，導致一些特異性轉錄因子的活化。細菌的鞭毛蛋白（Flagellin）作為TLR5特異性的外源性配體，TLR5與其結合后具有保護性的抗炎作用，其可能在腫瘤異常表達。我們前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織比較，TLR5在NSCLC組織中高表達，且與吸煙分化程度呈正相關，但有關TLR5在NSCLC高表達后的信號通路活化情況的研究并不多見。本研究旨在探討不同NSCLC細胞株中TLR5表達情況，尋找較好的實驗模型，并探討其信號通路活化的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肺腺癌細胞株SPC-A-1購于中科院上海細胞研究所；人肺腺癌細胞株A549（cat# CCL-185），人肺鱗癌細胞株SK-MES-1（cat# HTB-58）均購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）。

1.1.2 主要試劑和耗材 DMEM培養(yǎng)基、FBS、胰酶均購自美國ATCC公司；Triton X-100購自美國Genview公司；反轉錄試劑盒、PCR Mix試劑盒均購自加拿大Fermentas（MBI Fermentas）分子生物技術公司；Tris-Base、10%SDS均購自美國Sigma公司；TEMED購自上海生工生物工程股份有限公司；天然膜蛋白抽提試劑盒ProteoExtractTM（M-PEK）購自德國MERCK公司（中國）；Total protein Extraction試劑盒購自美國ProMab公司；NucBusterTMProtein Exaction Kit購自德國MERCK公司（中國）；Mouse GAPDH antibody、Goat Anti Rabbit IgG/HRP購自美國Santa Cruz生物公司；Rabbit Anti Goat IgG/HRP購自中杉金橋技術有限公司（北京）；Goat Anti Mouse IgG/HRP、Goat Anti Mouse IgG+A+M(H+L)/HRP均購自美國Zymed Laboratories公司；Goat anti-rat IgG-HRP、Rabbit Anti-Sheep IgG/HRP均購自美國Santa Cruz生物技術公司；NF-κB熒光素酶報告基因質粒購自江蘇碧云天技術研究所。shRNA空載體pLKO.3G購自Addgene公司；LipofectamineTM2000試劑、Opti-MEM?低血清培養(yǎng)基均購自美國Invitrogen公司。

1.1.3 引物 見表1。

1.2 方法

1.2.1 TLR5在不同NSCLC細胞系的表達 免疫熒光觀察不同NSCLC細胞株TLR5蛋白表達，Trizol法提取細胞的RNA，RT-PCR檢測不同肺癌細胞株TLR5 mRNA的水平，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測。通過gel-pro 6.0灰度掃描軟件分析各細胞株TLR5的表達狀況。Western blot檢測TLR5蛋白表達水平。

1.2.2 TLR5與NF-κB信號通路的關系 分別用0 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的鞭毛蛋白刺激，用NF-κB熒光素酶報告基因質粒瞬時轉染三種細胞株，檢測細胞內NF-κB熒光素酶的活性。選擇出TLR5表達最高的細胞株作為研究對象，選擇適合濃度的鞭毛蛋白，分別用0 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL的TLR5抗體抑制通路活化，檢測細胞內NF-κB熒光素酶的活性，驗證TLR5活化通路。

1.2.3 TLR5信號通路磷酸化水平檢測 用適合濃度的鞭毛蛋白刺激SPC-A-1細胞，分別在0 min、10 min、30 min和60 min用Western blot方法檢測TLR5活化后作用通路中的p-IKBα、IKBα、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK等分子的變化。構建靶向TLR5基因的shRNA質粒，用脂質體法體外轉染SPC-A-1細胞，48 h后用相同濃度鞭毛蛋白刺激，Western blot法在相同的四個時間點檢測對TLR5信號通路分子的變化（β-actin作為內參）。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件（美國）進行，計量數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差（Mean±SD）。計量資料使用t檢驗，計數(shù)資料使用χ2檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TLR5在不同NSCLC細胞系的表達 免疫熒光顯示TLR5蛋白在肺腺癌細胞株SPC-A-1中呈高表達，且主要表現(xiàn)在細胞膜上，在細胞質中也表達（圖1A）。在兩種肺腺癌細胞株均可檢測到TLR5 mRNA表達（SPC-A-1和A549細胞中TLR5 mRNA相應對表達量分別為0.386±0.022、0.293±0.018），而肺鱗癌細胞株SK-MES-1未檢出（P＜0.05） （圖1B）。Western blot檢測結果顯示肺腺癌細胞株SPC-A-1和A549中均有TLR5蛋白表達（SPC-A-1和A549細胞中TLR蛋白相對表達量分別為0.446±0.023、0.195±0.011），而且SPC-A-1細胞株中TLR5蛋白的水平明顯高于A549細胞株（P＜0.05），肺鱗癌細胞株中未檢出TLR5蛋白（圖1C，圖1D）。

2.2 TLR5與NF-κB信號通路的關系（不同濃度Flagellin刺激） 用NF-κB熒光素酶報告基因質粒瞬時轉染后，檢測細胞內熒光素酶的活性。隨著鞭毛蛋白濃度的增加，SPC-A-1細胞內NF-κB熒光素酶的活性增強，且呈濃度依賴性，0.1 μg/mL鞭毛蛋白即可明顯增強NF-κB熒光素酶的活性（P＜0.05）；而在A549和SK-MES-1細胞中，NF-κB熒光素酶的活性變化不如SPC-A-1細胞明顯（表2，圖2A）。SPC-A-1細胞內NF-κB熒光素酶的活性可被TLR5抗體抑制，隨著TLR5抗體濃度的增加，NF-κB熒光素酶的活性明顯降低（P＜0.05），與TLR5抗體濃度負相關（表3，圖2B）。

2.3 TLR5信號通路磷酸化水平檢測 選取0.1 μg/mL鞭毛蛋白處理SPC-A-1細胞，分別在作用0 min、10 min、30 min、60 min后，收集細胞進行Western blot檢測。結果顯示，與0 min相比較，p-IKBα、p-ERK1/2、p-JNK水平在鞭毛蛋白刺激10 min即明顯增高，30 min達到高峰，60 min開始下降（P＜0.05），且與10 min和60 min相比，p-IKBα、p-ERK1/2、p-JNK水平在30 min明顯增高（P＜0.05）；而IKBα、ERK1/2的水平在0 min、10 min、30 min、60 min均無明顯變化（P＞0.05）（表4，圖3）。

2.4 TLR5-shRNA轉染效率及轉染后TLR5的表達情況 在轉染48 h后，在熒光顯微鏡下可見空質粒對照組和TLR5-shRNA組被轉染SPC-A-1細胞數(shù)多，轉染效果高。TLR5-shRNA轉染SPC-A-1細胞48 h后，與空白對照組（TLR5 蛋白相對表達量為0.382±0.017）相比，TLR5-shRNA組細胞TLR5表達（TLR5 蛋白相對表達量為0.118±0.008）明顯受到抑制（圖4）。

2.5 Flagellin對TLR5-shRNA SPC-A-1細胞TLR5信號通路的影響 TLR5-shRNA轉染SPC-A-1細胞48 h后，加入Flagellin（0.1 μg/mL），用Western blot法分別在0 min、10 min、30 min、60 min檢測信號通路相關蛋白的表達。結果顯示，在四個不同的作用時間點，IKBα、ERK1/2蛋白的水平無明顯變化（P＞0.05），p-ERK1/2蛋白水平隨著時間延長明顯增高（P＜0.05），而p-IKBα、p-JNK蛋白均未檢出（表5，圖5 ）。

3 討論

表1 引物Tab1 Primer

TLRs在機體粘膜免疫、腫瘤起始和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，不僅在免疫細胞上表達，也廣泛表達于正常上皮細胞和胃癌等多種腫瘤細胞[4,5]。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)TLR5蛋白在NSCLC組織中表達明顯增高，在不同組織學類型的表達陽性率為鱗癌65%、腺癌82.1%、鱗腺癌50%、其他類型20%，其中TLR5在腺癌中表達陽性率最高。為了進一步研究其高表達的意義和作用機制，挑選合適的細胞株作為研究對象，我們分別檢測TLR5在兩種人肺腺癌細胞株SPC-A-1、A549細胞和人肺鱗癌細胞株SK-MES-1中的表達情況。免疫熒光、RT-PCR和Western blot結果表明在人肺鱗癌細胞株SK-MES-1中未檢測到TLR5表達，兩種不同NSCLC腺癌細胞株中均有TLR5的表達，而且SPC-A-1中TLR5表達明顯增高，這與我們在組織中觀察到的結果大致一致。S?awińska A等[6-8]發(fā)現(xiàn)不同品種的雞相同器官、組織上TLR5表達不一致，其表達的強度與由生物體的生理狀態(tài)（尤其與炎癥）密切相關，我們發(fā)現(xiàn)三種人肺癌細胞株TLR5的表達存在差異，因此推測可能與細胞株的細胞來源不同相關。免疫熒光結果還顯示，TLR5在SPC-A-1細胞膜和細胞質均有表達，而且主要表達在細胞膜上，這與既往文獻報道[9,10]相符?；赥LR5在NSCLC組織和不同NSCLC細胞株中的表達情況，因此我們選擇SPC-A-1細胞株作為實驗對象，研究TLR5與特異性配體結合后，其信號通路的活化情況。

圖1 TLR5在不同NSCLC細胞株中的表達。A：免疫熒光顯示TLR5在三種NSCLC細胞株中的表達，其主要表達在細胞膜上；B：三種NSCLC細胞株中的表達TLR5 mRNA的相對表達量，與SK-MES-1細胞株相比，*P＜0.05；C、D：Western blot檢測三種NSCLC細胞株中TLR5蛋白的表達及其相對表達量，與SK-MES-1細胞株相比，*P＜0.05。Fig1 Expression of TLR5 in three different NSCLC cell lines. A: TLR5 expression in three kinds of NSCLC cell lines by immunofluorescence, which is mainly expressed in the cell membrane; B: The relative expression of TLR5 mRNA in three kinds of NSCLC cell lines; compared with that of SKMES-1 cell lines, *P＜0.05; C, D: the expression of TLR5 protein in three kinds of NSCLC cell lines and their relative expressions detected by Western blot; compared with that of SK-MES-1 cell lines, *P＜0.05. NSCLC: non-small cell lung cancer.

表2 Flagellin刺激后，NSCLC細胞內NF-κB熒光素酶相對活性Tab2 The relative activity of NF-κB luciferase of NSCLC cells after stimulated by flagellin

圖2 Flagellin刺激后，細胞內NF-κB熒光素酶活性。A：三種NSCLC細胞株的NF-κB熒光素酶活性；B：加入TLT5抗體拮抗后，SPC-A-1細胞內NF-κB熒光素酶活性。Fig2 The relative activity of NF- kappa B luciferase of the cells when stimulated by flagellin. A: the relative activity of NF-κB luciferase of three kinds of NSCLC cell lines; B: After added with TLR5 antibody, the relative activity of NF-κB luciferase of SPC-A-1 cells.

圖3 鞭毛蛋白刺激后，TLR5信號通路分子磷酸化水平。*:與0 min組相比，P＜0.05；△：與其他組相比，P＜0.05。Fig3 The phosphorylation of TLT5 signaling pathway molecules after stimulated by flagellin. *: compared with that of 0 min group, P＜0.05; △:compared with the other groups, P＜0.05.

表3 加入TLR5抗體，F(xiàn)lagellin刺激SPC-A-1細胞，其細胞內NF-κB熒光素酶相對活性Tab3 The relative activity of NF-κB luciferase of SPC-A-1 cells stimulated by flagellin when added with TLR5 antibody

圖4 TLR5 shRNA轉染SPC-A-1細胞及TLR5表達。A：a: 空載體質粒轉染組，200×；b: 空載體質粒轉染組，熒光，400×；c: TLR5-shRNA轉染組，200×；d：TLR5-shRNA轉染組，熒光，400×；B：Western blot檢測。Fig4 SPC-A-1 cells transfected with TLR5-shRNA and the expression of TLR5 genes. A: a: SPC-A-1 cells transfected with vector, 200×;b: SPC-A-1 cells transfected with vector under the fluorescence microscope, 400×; c: SPC-A-1 cells transfected with TLR5-shRNA,200×; d: SPC-A-1 cells transfected with TLR5-shRNA under the fluorescence microscope, 400×; B: Detected by Western blot.

圖5 Flagellin刺激TLR5 shRNA SPC-A-1細胞不同時間點TLR5通路分子的表達。1：0 min；2：10 min；3：30 min；4：60 min。Fig5 The relative expression of TLT5 signaling pathway molecules at different time after TLR5-shRNA SPC-A-1 cells were stimulated by flagellin. 1:0 min; 2: 10 min; 3: 30 min; 4: 60 min.

表4 鞭毛蛋白刺激后，TLR5信號通路分子相對表達量Tab4 The relative expression of TLT5 signaling pathway molecules after stimulated by flagellin

表5 Flagellin刺激TLR5-shRNA SPC-A-1細胞不同時間點TLR5信號通路分子相對表達量Tab5 The relative expression of TLT5 signaling pathway molecules at different time after TLR5-shRNA SPC-A-1 cells were stimulated by flagellin

TLR在癌細胞的表達增加，可上調NF-κB，產(chǎn)生抗凋亡蛋白，從而促進腫瘤細胞增殖；亦可介導腫瘤細胞釋放趨化因子和細胞因子，誘導機體的免疫細胞參與腫瘤細胞微環(huán)境中的免疫反應。免疫細胞進一步釋放炎性細胞因子、生長因子和血管形成因子，促進腫瘤細胞的生長、侵襲、新的血管淋巴管形成、轉移。既往研究[11]還發(fā)現(xiàn)TLR4、TLR9、TLR7、TLR8等Toll樣受體表達在人肺癌細胞株上，與腫瘤細胞的存活與化療耐藥性等相關。Cherfils-Vicini等[11]發(fā)現(xiàn)TLR7、TLR8可以表達在離體培養(yǎng)的肺癌組織和細胞株上，兩者被激活后，NF-κB蛋白、抗凋亡蛋白Bcl-2的表達上調，增加腫瘤細胞的存活及其耐藥性。進一步分析發(fā)現(xiàn)用配體刺激TLR7或TLR8后，在人肺原發(fā)腫瘤細胞和人肺腫瘤細胞株原位檢測顯示基因表達上調，提示腫瘤細胞受到慢性刺激，說明TLR信號可以直接有促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。我們選取SPC-A-1細胞株，發(fā)現(xiàn)隨著鞭毛蛋白濃度的增加，TLR5被激活，其通路下游分子NF-κB熒光素酶的活性增強，且呈濃度依賴性；其活性能被TLR5抗體抑制，隨著TLR5抗體濃度的增加，NF-κB熒光素酶的活性逐漸降低，與TLR5抗體濃度呈負相關。說明鞭毛蛋白活化了TLR5通路，并引起下游分子的活化，與既往文獻相符。

樹突狀細胞（dendritic cells, DCs）位于抵御外來入侵第一道防線，接收到警報后可啟動后天免疫系統(tǒng)。TLRs位于DCs上，是先天免疫模式識別的主要受體之一，它能識別許多病原微生物上的PAMPs，這些保守序列與TLRs結合后，進而活化機體先天免疫系統(tǒng)，導致一些親炎癥細胞因子的產(chǎn)生，因此TLRs被認為控制著由先天免疫向后天免疫的轉變。我們前期研究發(fā)現(xiàn)TLR5蛋白不僅在NSCLC組織表達增加，還高表達于NSCLC細胞株中。由于肺癌組織或細胞中其內源性的配體目前并不明確，而鞭毛蛋白是TLR5已知特異的外源性配體，因此我們用鞭毛蛋白刺激TLR5，進一步研究其在NSCLC細胞中激活后，信號通路活化的情況。

TLR與特異PAMPs結合后，自身的異構形態(tài)發(fā)生改變，銜接分子被募集，下游分子陸續(xù)發(fā)生磷酸化和/或泛素化，大量蛋白質被募集，或結合，信號通路激活，引起炎性轉錄因子、炎性基因表達，機體發(fā)生免疫防御反應，產(chǎn)生炎癥。在此通路中，NF-κB位于TLR下游信號通路的樞紐位置。NF-κB具有多向性調節(jié)作用的細胞核轉錄因子，也是能觸發(fā)炎癥、并廣泛存在于炎癥反應中的一種關鍵性因子。NF-κB參與誘導基因表達、調控免疫細胞的激活、腫瘤形成、細胞凋亡、細胞信號轉導、炎癥反應及多種自身免疫性疾病發(fā)生等過程[12,13]，也是炎癥和腫瘤的重要樞紐分子。我們檢測到用鞭毛蛋白刺激SPC-A-1細胞后，p-IKBα、p-ERK1/2水平均在10 min開始升高，30 min達到高峰，60 min水平明顯降低，而相應的的時間點IKBα、ERK1/2蛋白水平并無明顯變化，說明SPC-A-1細胞受到鞭毛蛋白刺激后，引起胞漿內關鍵分子IKBα發(fā)生磷酸化，繼而降解，引起NF-κB活化移位入胞核，啟動下游ERK1/2蛋白磷酸化，及一系列的級聯(lián)反應。而用鞭毛蛋白刺激TLR5 shRNA細胞后，在0 min、10 min、30 min、60 min四個不同的作用時間點，IKBα、ERK1/2蛋白的水平無明顯變化，p-ERK1/2蛋白水平隨著時間延長明顯增高，而p-IKBα、p-JNK蛋白均未檢出。說明TLR5基因并非完全被沉默，表達出的極少量TLR5蛋白可以引起ERK1/2的磷酸化。

NF-κB在肺癌組織中的的表達明顯高于正常肺組織，提示在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。而且煙霧中的化學物質可引起支氣管損傷、支氣管炎癥，炎癥中的一些細胞因子、趨化因子活化NF-κB，進而誘導與癌癥相關的基因表達。我們的研究也發(fā)現(xiàn)吸煙的肺癌患者中TLR5表達高于非吸煙者，說明吸煙確實提高了支氣管炎癥的發(fā)生。

因此，從我們的實驗結果可以推測出鞭毛蛋白刺激NSCLC細胞TLR5活化，通路下游具有活性的磷酸化p-IKBα、p-ERK1/2及p-JNK蛋白表達增多，在30 min達到高峰，NF-κB入核率增加，導致NSCLC細胞活化，但對其生物行為的影響還有待進一步研究。