黃敏芳，唐志列，2，3，吳泳波，2，3

（1.華南師范大學(xué)物理與電信工程學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省量子調(diào)控工程與材料重點實驗室，廣東廣州510006；3.廣東省光電檢測儀器工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006）

利用散射光聲微分成像技術(shù)實現(xiàn)弱吸收物質(zhì)顯微成像

黃敏芳1，唐志列1，2，3，吳泳波1，2，3

（1.華南師范大學(xué)物理與電信工程學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省量子調(diào)控工程與材料重點實驗室，廣東廣州510006；3.廣東省光電檢測儀器工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006）

光聲顯微成像技術(shù)依賴于樣品的內(nèi)源性光吸收，對強散射弱吸收樣品成像效果差，甚至無法進(jìn)行成像。為了實現(xiàn)強散射弱吸收高透明生物樣品的光聲顯微成像，以及獲得圖像的邊緣增強效果，使光聲顯微成像技術(shù)在實際的生物醫(yī)學(xué)研究中更有應(yīng)用價值，本文首次將散射光聲技術(shù)引入到光聲微分顯微技術(shù)中，研制了新型的散射光聲微分成像技術(shù)。該技術(shù)不僅可以獲得強散射弱吸收高透明生物樣品的散射光聲顯微圖像，還可以獲得對應(yīng)的邊緣清晰的散射光聲微分圖像，對在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域有重要的應(yīng)用意義。

光聲顯微術(shù)；邊緣增強；散射光聲技術(shù)；空間微分技術(shù)

0 引言

微分顯微技術(shù)具有增強邊緣與突出微細(xì)結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢［1，2］，而光聲顯微鏡具有實現(xiàn)高對比度與高分辨率的免標(biāo)記功能成像的優(yōu)勢［3-5］，將這兩種技術(shù)結(jié)合形成一個新的技術(shù)--光聲微分顯微技術(shù)，可將二者的優(yōu)勢結(jié)合，在對樣品進(jìn)行高對比度與高分辨率免標(biāo)記光聲成像的同時，實現(xiàn)邊緣的增強與微細(xì)結(jié)構(gòu)的突出［6］。然而，光聲微分顯微鏡技術(shù)無法對強散射弱吸收樣品進(jìn)行成像，因為其是基于傳統(tǒng)的光聲顯微鏡技術(shù)，依賴于樣品的內(nèi)源性光吸收，而強散射弱吸收樣品的光吸收非常弱，產(chǎn)生的光聲信號太弱無法實現(xiàn)有效探測［3，7，8］。由于在實際的生物醫(yī)學(xué)研究中，腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞等的生長形態(tài)、生長和繁殖等是研究的熱點內(nèi)容［9，10］，而這些細(xì)胞樣品一般都是光吸收能力差。因此，為了使光聲微分顯微技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)強散射弱吸收樣品的光聲顯微成像以及獲得邊緣增強效果，本文在光聲微分技術(shù)的基礎(chǔ)上引入了散射光聲成像技術(shù)，利用該技術(shù)獲得了強散射弱吸收細(xì)胞的高對比度的光聲圖像，以及邊緣清晰的散射光聲微分圖像，使得光聲成像技術(shù)應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中更具意義。

1　散射光聲微分的原理

散射光聲微分顯微鏡技術(shù)本質(zhì)上是在散射光聲顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上引入空間微分技術(shù)。散射光聲顯微鏡技術(shù)是采用光聲探測技術(shù)探測被強散射弱吸收樣品散射的光子，再將光信號轉(zhuǎn)化為電信號，通過采集與處理電信號，重構(gòu)樣品的散射光聲顯微圖像。而空間微分技術(shù)是利用空間互補調(diào)制的方法將入射光束I調(diào)制成兩束強度相同、相位相反的光束，這兩束調(diào)制光束的表達(dá)式分別為I1（t）=I0cos（ωt）與I2（t +△t）=I0cos（ωt+π），再使入射激光連續(xù)掃描，實現(xiàn)兩束調(diào)制光束到達(dá)樣品上的空間兩點距離足夠小，即實現(xiàn)△x→0。

由于在散射光聲顯微鏡技術(shù)中，探測到的光聲信號是來自樣品的散射光聲信號與樣品自身吸收產(chǎn)生的光聲信號的疊加，但由于強散射弱吸收樣品自身光吸收很弱，光散射很強，故探測到的光聲信號主要是散射光聲信號，而散射光聲信號與樣品的散射光強度I成正比。因此，當(dāng)兩束光I1、I2先后聚焦到樣品的某一點產(chǎn)生散射光聲信號后，光聲探測器接收到的散射光聲信號為：

其中C是與實驗條件有關(guān)的常數(shù)，a（x）是樣品的光散射系數(shù)。由上式可知，互補調(diào)制技術(shù)實現(xiàn)了強散射弱吸收樣品的散射光聲信號的差分。

根據(jù)數(shù)學(xué)推導(dǎo)，光聲探測器最后探測到的散射光聲微分信號即散射光聲信號S（x）對樣品上對應(yīng)空間位置x的微分，可表示為：式中S（x+△x）和S（x）分別代表成像樣品在x+△x和x處產(chǎn)生的散射光聲信號。

當(dāng)樣品上相鄰兩點的散射光聲信號強度相同時，光聲探測器探測到的信號強度為零，當(dāng)相鄰兩點的散射光聲強度不相同時，則光聲探測器探測到一個不為零的散射光聲信號。在樣品的邊緣位置或有變化結(jié)構(gòu)位置時，空間相鄰兩點的散射光聲信號差異較大，因此散射光聲微分顯微成像技術(shù)能實現(xiàn)強散射弱吸收物質(zhì)的邊緣信號提取，實現(xiàn)邊緣增強。即散射光聲微分顯微鏡技術(shù)可以實現(xiàn)強散射弱吸收物質(zhì)的微分圖像即邊緣增強的散射光聲顯微圖像的獲取。

2　實驗裝置

如圖1，散射光聲微分顯微成像系統(tǒng)主要是由風(fēng)冷氬離子激光器（波長為514.5nm，Argon ion laser，35LAL515-230，CVIMelles Griot）、互補光調(diào)制器、振鏡驅(qū)動器（6231C，Cambridge Technology）、微腔散射光聲探測器、前置放大器、鎖相放大器（SR830，Stan-ford Research Systems）、數(shù)據(jù)采集卡（PCI6115，Na-tional Instrument）、以及計算機(jī)構(gòu)成。其中，互補調(diào)制器、微腔散射光聲探測器和前置放大器為本課題組自主研發(fā)。

圖1　散射光聲微分顯微成像系統(tǒng)原理圖Fig.1 The experimental setup of scattering photoacoustic differentialm icroscopy

氬離子激光器輸出的激光被半透半反鏡分束后，經(jīng)互補調(diào)制器調(diào)制成強度相等、相位相反的兩束光。兩束調(diào)制后的光再次聚合，入射到振鏡驅(qū)動系統(tǒng)，出射后被顯微物鏡聚焦在成像物體上。樣品所激發(fā)的散射光聲信號被微腔散射光聲探測器所探測，由于探測到的散射光聲信號十分微弱，因此，利用自行設(shè)計的前置放大器對光聲信號進(jìn)行預(yù)放大，接著使用鎖相放大器對被調(diào)制的光聲信號進(jìn)行解調(diào)并進(jìn)一步放大。利用互補調(diào)制器，微腔散射光聲探測器探測到的是成像物體上相鄰兩點的微分散射光聲信號。將該信號輸送到數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)中，通過計算機(jī)算法可以重建出成像物體二維空間分布的散射光聲微分顯微圖像，即散射光聲微分顯微圖像。

3　實驗結(jié)果與分析討論

3.1光聲微分顯微成像

為了驗證利用互補調(diào)制技術(shù)結(jié)合激光掃描技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)光聲微分，實驗采取標(biāo)準(zhǔn)分辨率板（JJG 827-1993，RTA-07）作為成像物體。顯微物鏡的放大倍數(shù)為50×（NA=0.65），實驗過程中，我們對分辨率板上的同一目標(biāo)分別利用光聲微分顯微、光聲顯微鏡和光學(xué)顯微鏡成像，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2　分辨率版成像。（a）光聲微分圖像；（b）光聲圖像；（c）光學(xué)顯微鏡圖像Fig.2 Images of resolution plate：（a）photoacoustic differential imaging；（b）photoacoustic imaging（c）opticalmicroscopy

圖2（a）是分辨率板的光聲微分圖像，即邊緣增強光聲顯微圖像，圖2（b）是對應(yīng)的光聲圖像，而圖2（c）則是對應(yīng)的光學(xué)顯微圖像。從圖2（b）和（c）可看出，光點入射于分辨率板上的暗區(qū)時產(chǎn)生強光聲信號，光點入射于透明區(qū)則產(chǎn)生弱光聲信號。分辨率板的光聲顯微圖像2（b）和對應(yīng)的光聲微分顯微圖像2（a）結(jié)構(gòu)清晰，對比度高。在分辨率測試板中，當(dāng)空間上連續(xù)被掃描的兩點是在分辨率板中的暗區(qū)或透明區(qū)上，這兩點對應(yīng)的光吸收系數(shù)相等，產(chǎn)生的光聲信號相等，微腔散射光聲探測器的輸出為零；如果連續(xù)被掃描的兩點處于暗區(qū)或透明區(qū)的邊緣位置，它們對應(yīng)的光吸收系數(shù)不等，產(chǎn)生的光聲信號不能相消為零，則微腔散射光聲探測器就會輸出一個脈沖信號，用鎖相放大器把該脈沖信號檢測出來，用該信號進(jìn)行成像，經(jīng)過計算機(jī)處理就可以得到光聲微分圖像。綜上所述，利用互補光調(diào)制器結(jié)合激光掃描技術(shù)，可以成功實現(xiàn)光聲顯微鏡微分成像。

3.2散射光聲顯微成像及散射光聲微分顯微成像

為了驗證散射光聲微分顯微鏡系統(tǒng)能實現(xiàn)強散射弱吸收樣品的成像，獲取樣品微分圖像即邊緣增強的散射光聲顯微圖像的可行性，以強散射弱吸收的口腔上皮細(xì)胞作為樣品進(jìn)行實驗，實驗采用40×（NA=0.65）的顯微物鏡，實驗結(jié)果如圖3所示。

圖3　口腔上皮細(xì)胞成像。（a）散射光聲微分圖像；（b）散射光聲圖像；（c）光學(xué)顯微鏡圖像；（d）圖（a）標(biāo)示位置的數(shù)據(jù)圖像；（e）圖（b）標(biāo)示位置數(shù)據(jù)圖像Fig.3 Images of oral epithelial cell：（a）photoacoustic differential imaging；（b）scattering photoacoustic imaging；（c）opticalmicroscopy；（d）signals image at the sections highlighted in Fig.3（a）；（e）signals image at the sections highlighted in Fig.3（b）

圖3（a）是口腔上皮細(xì)胞的微分圖像，即邊緣增強散射光聲顯微圖像，圖3（b）是對應(yīng)的散射光聲顯微圖像，而圖3（c）則是對應(yīng)的光學(xué)顯微圖像。實驗得到的圖像充分證明了我們提出的散射光聲微分顯微鏡系統(tǒng)不僅能獲得強散射弱吸收生物細(xì)胞的散射光聲圖像，圖像清晰，而且還能同時實現(xiàn)微分成像，獲取邊緣增強的光聲顯微圖像。從圖3（a）可以看出，微分圖像中細(xì)胞邊緣輪廓非常清晰突出，邊緣增強效果很好。相比于光學(xué)顯微圖像，我們得到散射光聲圖像與微分圖像的細(xì)胞結(jié)構(gòu)均與光學(xué)顯微圖像一一對應(yīng)，但由于口腔上皮細(xì)胞較為透明，一般的光學(xué)顯微鏡所成的圖像對比度很低，而我們所得到的散射光聲圖像與微分圖像均比光學(xué)顯微圖像清晰，圖像對比度高。圖3（d）和圖3（e）分別對應(yīng)圖3（a）和圖3（b）白色箭頭所表示區(qū)域的信號強度。由此可知，對強散射弱吸收樣品，應(yīng)用散射光聲微分顯微成像技術(shù)比起散射光聲顯微成像能獲得的邊緣增強效果。

4　結(jié)論

利用散射光聲成像技術(shù)可以實現(xiàn)強散射樣品的光聲顯微成像，獲得高對比度的光聲顯微圖像；將光聲微分技術(shù)與散射光聲技術(shù)結(jié)合，可以實現(xiàn)光聲顯微圖像的邊緣增強，獲得邊緣清晰的光聲顯微圖像。利用散射光聲微分成像技術(shù)實現(xiàn)了弱吸收生物細(xì)胞的光聲微分成像，獲得了邊緣清晰的弱吸收細(xì)胞的光聲顯微圖像。該技術(shù)對強散射弱吸收物質(zhì)的顯微成像具有重要意義，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)⒂泻艽蟮膽?yīng)用潛力。

［1］ 張曼，唐志列，譚治良，等.一種實現(xiàn)共焦顯微鏡空間微分成像的新方法［J］.光學(xué)學(xué)報，2012，32（3）：183-187.HANGMan，TANG Zhilie，TAN Zhiliang，etal.New methodof spatial differential imaging with confocalmicroscope［J］.Ac-ta Optica Sinica，2012，32（3）：183-187.

［2］COGSWELL C J，SHEPPARDC JR.Confocaldifferential inter-ference contrast（DIC）microscopy：including a theoreticalanaly-sis of conventionaland confocal DIC imaging［J］.Journalof Mi-croscopy，1992，165（1）：81-101.

［3］XU M，WANG L V.Photoacoustic imaging in biomedicine［J］. Rev Sci Instrum，2006，77（4）：041101.

［4］KU G，WANG X，STOICA G，etal.Multip le-bandwidth photo-acoustic tomography［J］.PhysMed Biol，2004，49（7）：1329-1338.

［5］TAN Z，TANG Z，WU Y，et al.Multimodal subcellular imaging with microcavity photoacoustic transducer［J］.Opt Express，2011，19（3）：2426-31.

［6］TANG H，TANG Z，WU Y，etal.Differential photoacousticmi-croscopy technique［J］.Opt Lett，2013，38（9）：1503-1505.

［7］ROSENCWAIG A，GERSHO A.Theory of the photoacoustic effectwith solids［J］.JAppl Phys，1976，47（1）：64-69.

［8］DANIELLIA，F(xiàn)AVAZZA C P，MASLOV K，et al.Picosecond absorption relaxationmeasured with nanosecond laser photoacous-tics［J］.App l Phys Lett，2010，97（16）：163701.

［9］HANAHAN D，WEINBERG R A.The hallmarks of cancer［J］.Cell，2000，100（1）：57-70.

［10］ ELLENBROEK S I，VAN RHEENEN J.Imaging hallmarks of cancer in living mice［J］.Nat Rev Cancer，2014，14（6）：406-418.

DENG Huijun.Effect of nursing intervention on postoperative complications of spine surgery patients［J］.Practical Preven-tive Medicine，2011，18（4）：759-760.

［5］楊靈.老年脊椎壓縮性骨折40例圍護(hù)期的康復(fù)護(hù)理［J］.

中國醫(yī)藥指南，2013，11（19）：57，56.

YANG Ling.40 Elderly vertebral compression fractures cases of retaining period of rehabilitation nursing［J］.Guide of China Medicine，2013，11（19）：57，56.

［6］李騰標(biāo)，黃漢春，鐘家云.腰椎間盤突出合并脊椎滑脫患者手術(shù)治療的臨床探索［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2015，14（2）：130-132.LITengbiao，HUANG Hanchun，ZHONG Jiayun.An explora-tory study on surgical treatmentof patientswith lumbar disc her-niation associated with spondylolisthesis［J］.Journalof Clinical and Experimental Medicine，2015，14（2）：130-132.

［7］LEE K W，LEE S K，KIM K J，et al.Arthroscopic-assisted locking compression plate clavicular hook fixation for unstable fractures of the lateral end of the clavicle：a prospective study［J］.Int Orthop，2010，34（6）：839-845.

［8］于海國.腰椎間盤突出癥合并椎體滑脫的手術(shù)治療效果分析［J］.中國醫(yī)藥科學(xué)，2014，4（8）：183-184，202. YU Haiguo.Analysis on operation treatment effect of lumbar disc herniation combined with spondylolisthesis［J］.China Medicine and Pharmacy，2014，4（8）：183-184，202.

［9］Canadian Orthopaedic Trauma Society.Nonoperative treatment compared with plate fixation of disp laced midshaft clavicular fractures.A muhicenter randomized clinical trial［J］.JBone Joint Surg Am，2007，89（1）：1-10.

［10］ 劉亞耘.護(hù)理干預(yù)對普外科大手術(shù)后患者疼痛的影響［J］.護(hù)理實踐與研究，2011，8（14）：58-60. LIU Yayun.Effect of nursing observation on pain after major surgical operation［J］.Nursing Practice and Research，2011，8（14）：58-60.

［11］朱巧愛.綜合性護(hù)理干預(yù)對鎖骨骨折患者術(shù)后功能恢復(fù)和并發(fā)癥的影響［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，1 1（7）：117-119. ZHU Qiao'ai.Influence of comprehensive nursing intervention on postoperative functional recovery and complications of pa-tients with clavicular fracture［J］.China Medical Herald，2014，11（7）：117-119.

［12］黃淼.綜合性護(hù)理干預(yù)對不穩(wěn)定型心絞痛患者治療效果的影響［J］.中國實用醫(yī)藥，2015，10（3）：232-234.

Scattering Photoacoustic Differential Microscopy of Weak Absorbing Material

HUANGMinfang1，TANG Zhilie1，2，3，WU Yongbo1，2，3
（1.School of Physics and Telecommunication Engineering，South China Normal University，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.Laboratory of Quantum Information Technology，South China Normal University，Guangzhou 510006，Guangdong，China；3.Guangdong Provinval Engineering Research Center for Optoelectronic Instrument，Couth China Normal University，Guangzhou 51006，Guangzhou，China）

Depending on endogenous optical absorption of sample，photoacoustic microscopy for the strong scattering weak absorbing samp le is difficult.In order to realize the photoacoustic microscopy of strong scattering weak absorbing biological samp le，and obtain the edge enhancement image，which make the photoacoustic m icroscopy technique has meaningful application value in biomedical research，this paper firstly combine the scattering photoacoustic technique with the photoacoustic differentialmicroscopy and develop a novel scattering photoacoustic differential imaging technique. This technique can not only obtain scattering photoacousticmicroscopic images of strong scattering weak absorbing biolog-ical sample，but also obtain the corresponding scattering photoacoustic differential images with clear edge.This tech-nique has important application significance in the field of biomedical research.

Photoacoustic microscopy；edge enhancement；scattering photoacoustic technique；spatial differential technique

O438

A

1007-7146（2015）03-0232-05

10.3969/j.issn.1007-7146.2015.03.004

2015-01-12；

2015-03-08

國家自然科學(xué)基金（61178086）；廣東省自然科學(xué)基金重點項目（S2013020012810）

黃敏芳（1989-），女，華南師范大學(xué)物理與電信工程學(xué)院碩士研究生，主要從事光聲成像方面的學(xué)習(xí)和研究

唐志列（1963-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事光聲成像和激光共聚焦顯微鏡等方面的研究。（電子郵箱）tangzhl@scnu.edu.cn