李媛媛,張建輝,林永忠

(1.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 綜合內(nèi)科，寧夏 銀川 750000； 2.中國人民解放軍第210醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 遼寧 大連 116023； 3.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 遼寧 大連 116027)

胰島素對糖尿病認(rèn)知功能障礙大鼠海馬InsR表達的影響

李媛媛1,張建輝2,林永忠3

(1.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 綜合內(nèi)科，寧夏 銀川 750000； 2.中國人民解放軍第210醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 遼寧 大連 116023； 3.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 遼寧 大連 116027)

目的 檢測海馬胰島素受體(insulin receptor, InsR)表達的變化，探討InsR的表達對糖尿病大鼠認(rèn)知功能的影響以及胰島素的干預(yù)效果。方法 成年健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠36只，隨機分為3組：糖尿病組(12只)、胰島素干預(yù)組(12只)及對照組(12只)，每組再均分為1、3個月組。應(yīng)用單次腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)的方法制作糖尿病模型。對照組給予單次腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，血糖正常。所有大鼠每周2個固定時間點測血糖。胰島素干預(yù)組大鼠每日皮下注射2～3 U低精蛋白鋅胰島素，根據(jù)血糖情況調(diào)整用量，保證空腹血糖處于正常范圍。于1、3個月分批行Morris水迷宮實驗評估認(rèn)知功能水平后處死，取腦、切片，行免疫組織化學(xué)染色，觀察各組大鼠海馬InsR表達的變化。結(jié)果 糖尿病1個月組大鼠，逃避潛伏期延長，腦內(nèi)InsR表達減少，與對照組比較，差異均有顯著性意義(P<0.05)。糖尿病3個月組大鼠，逃避潛伏期延長明顯，海馬InsR表達減少明顯，與糖尿病1個月組比較，差異均有顯著性意義(P<0.05)。胰島素干預(yù)1個月組，與對照組比較，逃避潛伏期略延長，海馬InsR表達減少，差異均無顯著性意義；與糖尿病1個月組比較，逃避潛伏期縮短，海馬InsR表達增加，差異均有顯著性意義(P<0.05)。胰島素干預(yù)3個月組與干預(yù)1個月組比較，逃避潛伏期延長，海馬InsR表達減少明顯，差異均有顯著性意義(P<0.05)；與糖尿病3個月組比較，逃避潛伏期、InsR表達差異均無明顯。結(jié)論 InsR表達減少是糖尿病認(rèn)知功能障礙的原因之一；早期應(yīng)用胰島素干預(yù)可以延緩認(rèn)知功能損害，具體機制需進一步探討。

糖尿病認(rèn)知功能障礙；胰島素受體；胰島素

隨著人口老齡化的逐漸加劇，以及人們生活方式的改變，糖尿病(diabetes mellitus， DM)患病率逐年升高。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者存在認(rèn)知障礙，尤其是學(xué)習(xí)和記憶能力。有學(xué)者認(rèn)為，糖尿病引起的認(rèn)知功能障礙是正常認(rèn)知與阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease， AD)的中間環(huán)節(jié)，有可能是AD的過渡狀態(tài)[1]。存在認(rèn)知功能障礙的中老年人，發(fā)生癡呆的危險性明顯增加[2]。研究認(rèn)為，腦內(nèi)與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的特定腦區(qū)存在高密度的胰島素受體(InsR)，其介導(dǎo)胰島素的生物學(xué)效應(yīng)[3]，包括調(diào)節(jié)細胞的代謝、生長、分裂、分化及存活等[4]。本研究通過檢測糖尿病認(rèn)知功能障礙大鼠海馬區(qū)InsR的表達情況，探討InsR變化對糖尿病認(rèn)知功能的影響以及胰島素的干預(yù)效果，為糖尿病腦病及其干預(yù)性研究提供更多的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗動物與飼養(yǎng)：成年健康雄性SD大鼠，體重180～240 g，共36只，購于大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。SD大鼠飼料由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，鼠舍通風(fēng)良好，溫度19～25 ℃，相對濕度40%～70%，光照周期12 h。所有大鼠按組分籠飼養(yǎng)，自由飲水、進食。

1.2 主要實驗試劑

鏈脲佐菌素(STZ)、多聚甲醛(Paraformaldehyde)購于美國Sigma公司；檸檬酸-檸檬酸鈉：購于天津市化學(xué)試劑三廠；低精蛋白鋅胰島素注射液(Isophane Insulin Injection)：購于江蘇萬邦生化醫(yī)藥有限公司；胰島素受體(InsR)多克隆抗體購于武漢博士得生物技術(shù)公司；免疫組織化學(xué)染色試劑盒購于北京中山金橋公司；其他試劑由大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院實驗室提供。

1.3 方 法

1.3.1 建立糖尿病模型

(1)模型制作：所有SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食10 h，隨機取24只，按60 mg/kg體重單次腹腔注射2%的STZ溶液。STZ溶液是現(xiàn)用現(xiàn)配，將STZ溶解在0.1 mmol/L滅菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.4)中，濃度為2%，冰浴、避光， 3 min內(nèi)注射完畢。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：STZ注射72 h后所有大鼠取尾靜脈血測血糖，規(guī)定空腹血糖>11.1 mmol/L，且尿糖+++者為糖尿病模型造模成功；若未達到該標(biāo)準(zhǔn)，則棄之不用，等數(shù)量隨機補缺。其余12只大鼠在相同條件下，按60 mg/kg體重單次腹腔注射0.1 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.4)，72 h后測血糖均正常。

(2)實驗分組與飼養(yǎng)：將造模成功的24只大鼠隨機分為糖尿病組與胰島素干預(yù)組，每組各12只，常規(guī)飼養(yǎng)，正常飲食，胰島素干預(yù)組：糖尿病大鼠12只，均于每日固定時間皮下注射2～3 U低精蛋白鋅胰島素注射液，根據(jù)血糖調(diào)整胰島素用量，控制空腹血糖處于正常范圍，正常飲食。上述各組再隨機均分為兩組：1、3個月組，每組6只。

1.3.2 血糖監(jiān)測

取大鼠尾靜脈血，滴在血糖儀配套的血糖試紙上測得血糖值。所有大鼠每周2個固定時間點測血糖，以保證實驗過程中血糖處于穩(wěn)定水平。

1.3.3 Morris 水迷宮實驗

Morris水迷宮實驗系統(tǒng)由水迷宮裝置、水迷宮圖像自動采集和軟件處理分析系統(tǒng)組成。水迷宮裝置為一圓形水池，直徑1.5 m，水深0.3 m，池內(nèi)東南象限有一直徑0.13 m透明平臺，平臺低于水面5 cm，水溫保持在22～25 ℃。大鼠訓(xùn)練過程如下：實驗前1天讓大鼠在平臺上停留60 s，若中途從平臺上滑下，再將其放回。實驗第1～4天進行定位航行實驗，每天于固定時間訓(xùn)練4次，每次隨機選擇東、南、西、北四象限之一作為入水點，將大鼠頭朝池壁輕放入水中，每次游泳時限為60 s，記錄大鼠從入水到找到平臺后四肢爬上平臺所需的時間即逃避潛伏期，同時獲取路線圖，若大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺，則引導(dǎo)其找到平臺，并停留10 s，逃避潛伏期記為60 s。在第5天的第4次訓(xùn)練后進行空間搜索實驗，除去平臺，隨機選一個入水點將大鼠面向池壁輕放入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠游泳的軌跡。圖像采集及數(shù)據(jù)分析均由圖像自動監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。實驗結(jié)束后記錄軌跡圖、逃避潛伏期、各象限游泳距離及時間。

1.3.4 標(biāo)本采集

對Morris水迷宮實驗后的大鼠，腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，仰臥位固定，剪開胸腔并暴露心臟，于心尖處剪一小口，向左心室插入灌注針并鉗夾固定，剪開右心耳，從左心室快速灌注生理鹽水，至右心房流出液清亮后，用4%多聚甲醛灌注固定1 h，斷頭取腦，將完整腦組織放入4%多聚甲醛溶液中保存，分別取2 mm海馬區(qū)腦組織，逐級經(jīng)二甲苯、無水乙醇、酒精脫水，石蠟包埋。

1.3.5 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片厚5 μm，經(jīng)二甲苯、無水乙醇、酒精逐級脫蠟、復(fù)水后用10 mmol/L pH 7.0 的 PBS 浸洗3次，每次3 min。3% H2O2室溫孵育15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。10 mmol/L pH 7.0 PBS 浸洗3次，每次3 min。微波爐內(nèi)放入 0.01 mmol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)，加熱至沸騰后放入組織切片，繼續(xù)加熱10 min(保證溫度90℃以上)，自然冷卻至室溫，進行抗原修復(fù)。10 mmol/L pH 7.0的PBS浸洗3次，每次3 min。小牛血清封閉，室溫孵育15 min，傾去血清，勿洗。滴加一抗(Anti-InsR，1∶50)工作液，4 ℃冰箱過夜(18 h以上)。次日，室溫下放置1 h，10 mmol/L pH 7.0的PBS浸洗3次，每次3 min。滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37 ℃水浴孵育30 min。10 mmol/L pH 7.0的PBS浸洗3次，每次3 min。滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃水浴孵育30 min。10 mmol/L pH 7.0 的PBS 浸洗3次，每次3 min。DAB 顯色劑顯色2 min，顯微鏡下觀察，顯色充分后，自來水沖洗10 min，蘇木復(fù)染，脫水、透明、封固。光鏡下觀察每張玻片，陽性信號為棕黃色。

1.4 結(jié)果判定

胰島素受體見于神經(jīng)元胞體、纖維膜上和胞漿內(nèi)，顯微鏡下觀察每張玻片，陽性信號表現(xiàn)為棕黃色或棕色。每個部位取3個不同視野，拍照保存。使用IPP6.0軟件分析所有照片并采集數(shù)據(jù)，進行半定量分析，測量積分光密度(IOD)?？偨Y(jié)不同組別胰島素受體的表達情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

對照組大鼠皮毛光滑、柔順，性格溫順，行動敏捷，飲水量及尿量如常，體重隨周齡增加而增加，血糖處于正常范圍；糖尿病組大鼠皮毛雜亂、無光澤，精神萎靡、懶動，易激惹，攻擊性強，有多飲、多尿、消瘦癥狀，體重隨周齡增長而下降，空腹血糖波動在11.1 mmol/L以上，且尿糖持續(xù)在+++以上；胰島素干預(yù)組大鼠皮毛光滑、柔順，飲水量及尿量如常，體重隨周齡增加而明顯增加，與對照組比較無差異，空腹血糖波動于3.0～6.0 mmol/L左右，與糖尿病組比較，該組大鼠血糖水平較低，差異有顯著性意義(P<0.05)，與對照組比較，血糖和體重差異均無顯著性意義(P>0.05)。大鼠血糖、體重情況比較見表1、2。

2.2 Morris 水迷宮實驗結(jié)果

糖尿病1個月組大鼠，逃避潛伏期延長，與對照組比較，差異有顯著性意義(P<0.05)；糖尿病3個月組大鼠，逃避潛伏期延長更加明顯，與1個月組比較，差異有顯著性意義(P<0.05)；胰島素干預(yù)1個月組大鼠與對照組比較，逃避潛伏期略延長，但差異無顯著性意義(P>0.05)，與糖尿病1個月組比較，逃避潛伏期縮短，差異有顯著性意義(P<0.05)；胰島素干預(yù)3個月組大鼠與1個月組比較，逃避潛伏期延長，差異有顯著性意義(P<0.05)，與3個月糖尿病組比較，逃避潛伏期略短，但差異無顯著性意義(P>0.05)。見表3。

2.3 大鼠海馬InsR表達情況

如圖1、表4所示，糖尿病1個月組，InsR表達減少，IOD值較少，與對照組比較，差異有顯著性意義(P<0.05)；糖尿病3個月組，InsR表達減少明顯，IOD值減少明顯，與對照組及糖尿病1個月組比較，差異均有顯著性意義(P<0.05)。

表1 1個月各組大鼠的血糖濃度和體重Tab 1 The boold glucose concentration and body weight of the 1 month rats

表2 3個月各組大鼠的血糖濃度和體重Tab 2 The boold glucose concentration and body weight of the 3 months rats

表3 各組大鼠逃避潛伏期Tab 3 Escape latencies of rats at 1 month and 3 months ±s)

圖1 各組大鼠海馬InsR免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×200，n=6)Fig 1 The immunohistohemical staining of InsR in each group hippocampus(×200，n=6)

胰島素干預(yù)1個月組的InsR表達較對照組減少，IOD值差異無顯著性意義(P>0.05)，較糖尿病1個月組增加，IOD值差異有顯著性意義(P<0.05)；胰島素干預(yù)3個月組InsR表達明顯減少，與對照組及胰島素干預(yù)1個月組比較，IOD值差異均有顯著性意義(P<0.05)，與糖尿病3個月組比較，IOD值差異無顯著性意義(P>0.05)。見圖1、 表4。

表4 1、3個月大鼠海馬InsR表達(IOD值)情況Tab 4 The expression of InsR(IOD) in the hippocampus in each group rats

3 討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一些神經(jīng)元錐體細胞可分泌少量胰島素，發(fā)揮自分泌或旁分泌的作用[5]，以調(diào)節(jié)腦內(nèi)的能量代謝，同時作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，胰島素可促進神經(jīng)細胞突觸的形成、胚胎的神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和再攝取。InsR是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的起始部位，其表達水平直接影響胰島素的生物學(xué)效應(yīng)[3,6]。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素與認(rèn)知功能密切相關(guān)[7]。Hoyer等[8]報道重度AD患者腦內(nèi)存在胰島素水平異常，可能是腦組織攝取胰島素的能力降低，從而出現(xiàn)腦脊液中胰島素水平降低。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病1個月大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙時，海馬區(qū)InsR表達減少，而3個月時糖尿病組大鼠認(rèn)知功能障礙更加明顯，InsR減少也更加顯著，應(yīng)用胰島素后InsR表達增加，糖尿病1個月大鼠認(rèn)知功能障礙減輕，結(jié)果提示：糖尿病認(rèn)知功能障礙與InsR表達減少有關(guān)，且與其嚴(yán)重程度相關(guān)，InsR減少導(dǎo)致胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，進一步引起腦內(nèi)糖代謝紊亂和胰島素的神經(jīng)營養(yǎng)作用缺失，最終影響神經(jīng)元功能，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙逐漸加重。

同時本研究發(fā)現(xiàn)，胰島素干預(yù)1個月組大鼠認(rèn)知功能損害不明顯，而3個月組出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，且與糖尿病3個月組無差異，結(jié)果提示，早期應(yīng)用胰島素干預(yù)，可以延緩認(rèn)知功能損害，但隨著糖尿病的病程發(fā)展，胰島素不能阻止認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。其可能原因：(1)早期應(yīng)用胰島素糾正高血糖，可上調(diào)InsR的表達，改善腦內(nèi)糖代謝，進而延緩大鼠認(rèn)知功能障礙的發(fā)生；(2)隨著糖尿病病程進展，InsR表達進行性減少，使胰島素的腦保護作用減弱；(3)與胰島素抑制Aβ的降解有關(guān)：由于胰島素和Aβ在中樞系統(tǒng)內(nèi)都是依靠胰島素降解酶進行分解代謝的，二者作為競爭性結(jié)合底物，胰島素可抑制Aβ的降解，使Aβ沉積增加，加重認(rèn)知障礙。

綜上所述，糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)生與胰島素及InsR有關(guān)，其機制需進一步探討。

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Effect of insulin on InsR expression in rats with diabetic cognitive impairment

LI Yuan-yuan1,ZHANG Jian-hui2,LIN Yong-zhong3

(1.DepartmentofInternalMedicine,People'sHospitalofNingxia,Yinchuan750000,China; 2.DepartmentofNeurology,theChinesePeople'sLiberationArmyHospital210,Dalian116023,China; 3.DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China)

Objective To observe the change of congnitive function and the expression level of hippocampal insulin receptors (InsR) in 1 month and 3 months of diabetic rats, explore the effect of InsR on diabetic rats and investigate that whether insulin can be applied to prevent diabetic cognitive impairment. Methods 36 healthy adult male SD (Sprague-Dawley) rats, weight 180-240 g, were divided into 3 groups randomly: diabetic group (n=12), insulin treatment group (n=12) and control group (n=12), and then each group was divided into 2 groups equal in amount randomly: 1 month group and 3 months group. Diabetic group and insulin treatment group rats were induced by streptozotocin injection. Fixed time to measure blood glucose of all rats twice a week. Insulin treatment group rats were injected insulin daily, and we adjusted insulin dosage according to the blood glucose level to ensure blood glucose in normal range. All the rats underwent the test of Morris water maze in 1 month and 3 months. After the assessment on cognitive function of the 1 month and 3 months rats

diabetes cognitive impairment; insulin receptor; insulin

論 著

10.11724/jdmu.2015.01.06

遼寧省自然科學(xué)基金項目(20102049)；大連市科技局項目(2010E15SF182)

李媛媛(1985-)，女，寧夏銀川人，碩士。 E-mail：yuanyuanli0907@163.com

林永忠，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：lin19671024.com

R587.1

A

1671-7295(2015)01-0025-05

李媛媛,張建輝,林永忠. 胰島素對糖尿病認(rèn)知功能障礙大鼠海馬InsR表達的影響[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015,37(1)：25-29.

that experienced the Morris water maze experiment, the expression of InsR in brain were observed. Results Compared with the control group, 1 month group of diabetic rats appeared cognitive impairment and their expression of InsR reduced, which has statistical difference (P<0.05). Compared with 1 month diabetic group, the cognitive impairment of 3 months diabetic group was obviously aggravated and their expression of InsR reduced more significantly, which has statistical difference as well (P<0.05). 1 month group of insulin treatment rats with no significant cognitive impairment, and their expression of InsR reduced slightly. Compared with the control group, there are no difference. Compared with the 1 month diabetic group, which has statistical difference (P<0.05). 3 months group of insulin treatment rats appeared cognitive impairment and their expression of InsR reduced obviously. Compared with control group, which has statistical difference (P<0.05). Compared with 1 month group of insulin treatment rats,which has statistical difference as well (P<0.05). Compared with 3 months group of diabetic rats, there are no statistical difference. Conclusion Diabetic cognitive impairment is closely related to InsR, the reduced InsR expression may contribute to diabetic cognitive impairment. Early intervention of insulin has protective effect on the brain,then delay cognitive impairment. However, as the extension of the duration, the insulin treatment group rats still show cognitive impairment, which suggests that long-term application of insulin can not prevent the occurrence of cognitive impairment. Mechanisms need to be further explored.

2014-08-25；

2014-12-29)