劉淑娟，劉麗娜，呂 申，李 梅，張 剛

(1.大連港醫(yī)院 消化內(nèi)科，遼寧 大連 116015；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，遼寧 大連 116011；3. 大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 中心實驗室，遼寧 大連 116027)

EGFR和K-ras蛋白在大腸息肉中的表達及臨床意義

劉淑娟1，劉麗娜2，呂 申3，李 梅3，張 剛1

(1.大連港醫(yī)院 消化內(nèi)科，遼寧 大連 116015；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，遼寧 大連 116011；3. 大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 中心實驗室，遼寧 大連 116027)

目的 探討EGFR及K-ras蛋白在大腸息肉中的表達及臨床意義。方法 免疫組化法檢測大腸息肉及大腸癌組織EGFR和K-ras的蛋白表達?？偨Y(jié)大腸息肉組中EGFR和K-ras蛋白表達與臨床參數(shù)的關(guān)系，并分析兩種蛋白表達的相關(guān)性。結(jié)果 大腸腺瘤性息肉及大腸癌組的EGFR蛋白陽性表達率分別為64.29%與62.61%，均高于大腸非腺瘤性息肉組的32.00% (P<0.05)；大腸腺瘤性息肉組的K-ras蛋白陽性表達率為78.57%，高于大腸非腺瘤性息肉及大腸癌組的36.00%及46.09%(P<0.05)。兩種蛋白表達在組織學(xué)分型方面比較有差異(P<0.05)，而在性別、年齡、息肉數(shù)量及部位方面比較無差異。在大腸息肉中EGFR與K-ras蛋白表達呈顯著正相關(guān)(r=0.444，P<0.005)。結(jié)論 EGFR及K-ras蛋白在大腸腺瘤性息肉中有一定表達；二者的表達升高可能與大腸腺瘤性息肉的發(fā)生與惡性轉(zhuǎn)化有一定關(guān)系；二者在大腸息肉的發(fā)生發(fā)展中有協(xié)同作用。

大腸息肉；EGFR；K-ras

表皮生長因子受體(EGFR)的異?；罨cK-ras及其引起的B-raf等基因及其產(chǎn)物的過度表達目前認為是大腸癌發(fā)生及惡性演進的重要原因之一,而大腸腺瘤性息肉為大腸癌癌前病變之一。由于息肉癌變的分子學(xué)表達往往早于其形態(tài)學(xué)改變，因此利用基因表達早期有效區(qū)分出有潛在惡變風(fēng)險的息肉，并給予及時處理、縮短隨訪時間，將對大腸癌的預(yù)防起到重要作用。本研究通過檢測大腸息肉中EGFR及K-ras蛋白表達情況，旨從蛋白水平研究二者在大腸息肉發(fā)生發(fā)展中所起作用，從而探討這兩種蛋白作為大腸腺瘤性息肉演進及惡性轉(zhuǎn)化預(yù)警標志物的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集大連港醫(yī)院2011年11月—2012年11月腸鏡下摘除大腸息肉標本53例。其中男37例，女16例；年齡33～81歲，平均58.17歲；<60歲31例，≥60歲22例；單發(fā)息肉12例，多發(fā)息肉41例；非腺瘤性息肉25例，腺瘤性息肉28例；直腸息肉5例，左半結(jié)腸息肉31例，右半結(jié)腸息肉17例。選取大連市多家醫(yī)院2006年7月—2008年9月診斷明確的大腸癌手術(shù)切除標本115例。其中男57例，女58例；年齡27～87歲，平均62歲。所有大腸癌患者術(shù)前均未接受過放、化療。

1.2 試劑與方法

兔抗人EGFR單克隆抗體及兔抗人K-ras單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，SP免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。所有標本常規(guī)脫蠟水化，HE染色，免疫組織化學(xué)過程按試劑盒說明書進行。以PBS代替一抗作陰性對照，選已知陽性切片作陽性對照。

1.3 結(jié)果判定

EGFR蛋白以細胞漿或細胞膜或兩者均出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，K-ras蛋白以細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。免疫組化結(jié)果評分采用半定量方法：陽性細胞數(shù)<5%為0分，5%～20%為1分，21%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；陽性強度不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者分數(shù)相加,>3分為陰性，<3分為陽性。病理診斷由兩名高年資病理醫(yī)師獨立進行，選取至少5個高倍視野不少于1 000個細胞對免疫組化結(jié)果進行評估。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)選用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗和Spearman相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 大腸息肉(非腺瘤性、腺瘤性)組與大腸癌組EGFR及K-ras蛋白的表達情況

大腸非腺瘤性息肉、腺瘤性息肉及大腸癌組EGFR蛋白陽性表達率分別為32.00%(8/25)、64.29%(18/28)與62.61%(72/115)，腺瘤性息肉及大腸癌組高于非腺瘤性息肉組(P<0.05)，而腺瘤性息肉組與大腸癌組接近(P>0.05)。K-ras蛋白陽性表達率在大腸非腺瘤性息肉、腺瘤性息肉及大腸癌組分別為36.00%(9/25)、78.57%(22/28)與46.09%(53/115)，腺瘤性息肉組高于非腺瘤性息肉及大腸癌組(P<0.05)。見表1、圖1～圖4。

表1 EGFR及K-ras蛋白在大腸息肉及大腸癌組中的表達情況Tab 1 Expressions of EGFR and K-ras in colorectal polyp group and colorectal cancer group

2.2 大腸息肉組EGFR及K-ras蛋白表達與患者臨床參數(shù)的關(guān)系

大腸息肉EGFR蛋白陽性表達率在非腺瘤及腺瘤組分別為32.00%(8/25)與64.29% (18/28)，K-ras蛋白陽性表達率在非腺瘤及腺瘤組分別為36.00%(9/25)與78.57% (22/28)。該兩種蛋白表達在組織學(xué)分型間比較差異有顯著性意義(P<0.05)，在性別、年齡、息肉數(shù)量及部位比較差異均無顯著性意義(P>0.05)。見表2。

2.3 大腸息肉組EGFR與K-ras蛋白表達的相關(guān)性分析

大腸息肉組中K-ras與EGFR蛋白均為陽性表達21例，均為陰性表達17例，隨K-ras蛋白表達增高EGFR蛋白表達也增高，兩者呈顯著正相關(guān)(r=0.444，P<0.005)。見表3。

圖1 腺瘤組織中EGFR陽性表達(SP法×200)Fig 1 Possitive expression of EGFR in adenoma(SP×200)

圖2 癌組織中EGFR陽性表達(SP法×200)Fig 2 Possitive expression of EGFR in carcinoma(SP×200)

圖3 腺瘤組織中K-ras陽性表達(SP法×200)Fig 3 Possitive expression of K-ras in adenoma(SP×200)

圖4 非腺瘤組織中K-ras陽性表達(SP法×200)Fig 4 Possitive expression of K-ras in non-adenoma (SP×200)

表2 大腸息肉組EGFR及K-ras蛋白表達與患者臨床參數(shù)的關(guān)系Tab 2 Relationship between EGFR and K-ras protein expressions in colorectal polyp group and the clinical parameters

表3 大腸息肉組EGFR與K-ras蛋白表達的相關(guān)性分析Tab 3 Correlation analysis of EGFR and K-ras protein expression in colorectal polyp group (n)

r=0.444,P<0.005

3 討 論

大腸息肉來源于腸黏膜上皮，在組織學(xué)上分為腺瘤性息肉及非腺瘤性息肉。一般認為非腺瘤性息肉發(fā)生癌變可能性極小，但腺瘤性息肉則有癌變傾向。

EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白受體，是原癌基因ErbB1的表達產(chǎn)物，在多種上皮來源的惡性腫瘤中過表達[1]，它介導(dǎo)的細胞信號傳遞途徑非常重要，一旦表達過度、活性增強或其他某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，則可導(dǎo)致惡性腫瘤等疾病的發(fā)生。現(xiàn)已證實，在人類多種惡性腫瘤組織和腫瘤細胞株中，存在著EGFR的表達和功能異常[2-3]。

單寶珍等[4]研究發(fā)現(xiàn)大腸癌組EGFR蛋白陽性表達率顯著高于腺瘤及癌旁黏膜組，且腺瘤組的表達高于癌旁黏膜組，認為EGFR的高表達與大腸癌的發(fā)生可能有關(guān)。本實驗中大腸非腺瘤性息肉、腺瘤性息肉及大腸癌組EGFR蛋白陽性表達率分別為32.00%、64.29%與62.61%，腺瘤性息肉及大腸癌組陽性表達率均高于非腺瘤性息肉組，表明大腸腺瘤及大腸癌中EGFR蛋白有較高的表達，提示其高表達可能參與大腸腺瘤性息肉及大腸癌的發(fā)生。EGFR過度表達可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，本實驗中大腸腺瘤性息肉與大腸癌組EGFR陽性表達率相接近，提示EGFR蛋白的高表達在大腸腺瘤性息肉的惡變過程中可能起著一定的作用，腺瘤性息肉具有一定的癌變潛能，本結(jié)論與目前大腸腺瘤被視為大腸癌癌前病變的觀點相符合。

Ras蛋白過度表達是細胞增生的標志，其陽性表達是腫瘤發(fā)生的早期事件。在Ras基因中，以K-ras基因突變最為常見。K-ras可由基因突變、自身活化或在接受EGFR的信號后發(fā)生過表達，這種過表達被認為是包括大腸癌在內(nèi)的很多上皮源性惡性腫瘤的發(fā)生機制。Siddiqui等[5]報道結(jié)直腸癌病人K-ras基因突變率為27%～43%。張王娜等[6]研究發(fā)現(xiàn)腺癌及腺瘤組K-ras蛋白陽性表達率明顯高于正常組，而腺癌和腺瘤組表達無明顯差異，認為K-ras蛋白與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本實驗中K-ras蛋白在大腸非腺瘤性息肉、腺瘤性息肉及大腸癌組中的陽性表達率分別為36.00%、78.57%與46.09%，腺瘤性息肉組明顯高于非腺瘤性息肉組，提示K-ras蛋白在大腸腺瘤階段已發(fā)生高表達，在大腸腺瘤階段已存在某種程度K-ras基因突變。

本實驗中大腸腺瘤性息肉中K-ras蛋白表達明顯高于大腸癌尚難以解釋，已知大腸癌的發(fā)生發(fā)展同時涉及多種基因，包括原癌基因、腫瘤抑制基因以及DNA修復(fù)基因等多因素，其多種機制可能互相調(diào)節(jié)、互相制約，這可能是本實驗大腸癌K-ras蛋白表達低于腺瘤性息肉的一個原因。

已有報道EGFR及K-ras突變與大腸癌患者年齡、性別、病變部位關(guān)系不大，而與腫瘤分化程度、浸潤力及轉(zhuǎn)移等之間的關(guān)系結(jié)論不一。Bo-Young Oh等[7]研究結(jié)果提示EGFR突變與大腸癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者年齡、性別、大腸癌發(fā)生部位及分化程度無關(guān)；馬玉濱等[8]研究認為K-ras表達與大腸癌腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度有關(guān)，而與患者年齡、性別、腫瘤的病理分期無關(guān)。本實驗EGFR及K-ras表達與大腸息肉患者年齡、性別、數(shù)量及部位無明顯關(guān)系，而與組織學(xué)分型有關(guān)，腺瘤性息肉組兩種蛋白表達明顯高于非腺瘤性息肉組，表明EGFR及K-ras的高表達在腺瘤性息肉發(fā)生中起著一定的作用，由此也提示腺瘤性息肉較非腺瘤性息肉有惡變傾向。

EGFR和K-ras蛋白同處于EGFR/Ras/Raf/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，K-ras位于EGFR的下游，將磷酸化激活的EGFR信號自細胞內(nèi)傳遞，從而與細胞的增殖和分化相連造成細胞不可控制的增殖及惡變。本實驗通過檢測EGFR及K-ras蛋白在大腸息肉中表達的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，二者表達呈明顯正相關(guān)，這表明大腸息肉中EGFR/Ras/Raf/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是EGFR及K-ras蛋白聯(lián)系的一個主要內(nèi)在機制，該兩種蛋白在大腸息肉的發(fā)生發(fā)展中可能起著協(xié)同作用。

本實驗結(jié)果提示EGFR及K-ras蛋白高表達的大腸腺瘤性息肉存在潛在惡變風(fēng)險。近年來，大腸息肉發(fā)病率逐年增高，Cappell等[9]的研究結(jié)果證實內(nèi)鏡下檢出，摘除腺瘤可使大腸癌的發(fā)生率降低76%～90%，因此應(yīng)重視大腸息肉的早期治療。

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Expressions and clinical significance of EGFR and K-ras protein in colorectal polyps

LIU Shu-juan1, LIU Li-na2, LV Shen3, LI Mei3, ZHANG Gang1

(1.DepartmentofGastroenterology,DalianPortHospital,Dalian116015,China; 2.DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China; 3.CentralLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China)

Objective To explore the expressions and significance of EGFR and K-ras protein in colorectal polyps. Methods EGFR and K-ras protein expressions in colorectal polyps and colorectal cancer were detected by immunohistochemistry. Results The positive expression rates of EGFR in colorectal adenomatous polyp group and colorectal cancer group were 64.29% and 62.61% respectively. They were higher than that at colorectal non-adenomatous polyp group Both of them being 32.00% (P<0.05); The positive expression rate of K-ras in colorectal adenomatous polyp group was 78.57%. It was higher than those of colorectal non-adenomatous polyp group 36.00% and colorectal cancer group 46.09%(P<0.05). EGFR and K-ras protein expressions existed statistic difference in colorectal polyp histopathology (P<0.05), but there were no statistic significance in sex, age, number and site of colorectal polyp. The expressions of these two proteins in colorectal polyp group showed a significant positive correlation (r=0.444，P<0.005). Conclusion A certain level of expression of EGFR and K-ras protein exists in the colorectal adenomatous polyps. The increased expression of the two proteins may be related to the occurance and malignant transformation of colorectal adenomatous polyps; The two proteins play a synergistic role in the occurrence and progrusssim of colorectal polyps.

colorectal polyps; EGFR; K-ras

論 著

10.11724/jdmu.2015.01.07

國家自然科學(xué)基金項目(81071805)

劉淑娟(1976-)，女，河北定州人，副主任醫(yī)師，碩士。E-mail:lsj116015@163.com

劉麗娜，教授。E-mail:liulina_dl@sohu.com

R735.3

A

1671-7295(2015)01-0030-04

劉淑娟，劉麗娜，呂申，等. EGFR和K-ras蛋白在大腸息肉中的表達及臨床意義[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015,37(1)：30-33.

2014-11-05；

2014-12-30)