于 健，鄒迪莎，葉 瑤，黃漓莉，劉曉玲，莫如芬，楊 帆，胡 璟，何永玲

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科； 2.桂林醫(yī)學(xué)院研究生院； 3.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣西 桂林 541001)

巴馬小型豬T2DM模型胰島素抵抗與同型半胱氨酸的關(guān)系

于 健1，鄒迪莎2，葉 瑤2，黃漓莉1，劉曉玲1，莫如芬1，楊 帆1，胡 璟1，何永玲3

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科； 2.桂林醫(yī)學(xué)院研究生院； 3.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣西 桂林 541001)

目的 應(yīng)用高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)構(gòu)建巴馬小型豬2型糖尿病(T2DM)模型，并探討T2DM小型豬胰島素抵抗(IR)與同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的關(guān)系。方法 選用健康雄性巴馬小型豬10只，隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組(n=5)，喂養(yǎng)普通飼料；糖尿病模型組(n=5)，喂養(yǎng)高脂高糖飼料，上述兩組共喂養(yǎng)10個(gè)月。11個(gè)月初糖尿病模型組腹腔注射STZ 100 mg/kg，1周后重復(fù)1次；對(duì)照組腹腔注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。觀察兩組小型豬體重、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)及血漿Hcy水平，同時(shí)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。結(jié)果 高脂高糖飼料喂養(yǎng)10個(gè)月后，模型組小型豬體重、FPG、FINS及HOMA-IR高于對(duì)照組(P<0.01)；與對(duì)照組相比STZ給藥后(12個(gè)月末實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí))，模型組的FPG進(jìn)一步升高，F(xiàn)INS水平明顯下降(P<0.01)。模型組Hcy高于對(duì)照組(P<0.01)，且HOMA-IR與Hcy呈正相關(guān)(r=0.906，P<0.05)。結(jié)論 T2DM小型豬Hcy升高與IR密切相關(guān)。

高脂高糖飲食；鏈脲佐菌素；2型糖尿?。话婉R小型豬；同型半胱氨酸

目前2型糖尿病(T2DM)確切的發(fā)病機(jī)制仍未明確，其中胰島素抵抗(IR)是其發(fā)病特征，近年來(lái)研究認(rèn)為，高同型半胱氨酸(Hcy)血癥是心腦及外周血管病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，Hcy水平與糖尿病、IR密切相關(guān)[1-2]。鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)能夠選擇性地破壞某些種屬動(dòng)物胰島的β細(xì)胞，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。膳食誘導(dǎo)聯(lián)合小劑量STZ構(gòu)建的糖尿病模型已被廣泛應(yīng)用[3-4]。本研究通過高脂高糖飲食聯(lián)合STZ構(gòu)建巴馬小型豬T2DM模型，并檢測(cè)其Hcy水平，旨在探討巴馬小型豬T2DM模型IR與Hcy的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 主要藥品和儀器

STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Hcy試劑盒購(gòu)自北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司(批內(nèi)變異系數(shù)CV≤5.0%，批間變異系數(shù)CV≤10%)；胰島素放射免疫分析試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所(批內(nèi)變異系數(shù)CV<10%，批間變異系數(shù)CV<15%)；胰島素單克隆抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；豬油、蔗糖、普通飼料均購(gòu)自桂林市漓源糧油飼料有限責(zé)任公司；蛋黃粉購(gòu)自南通康德生物制品有限公司。瑞士羅氏公司7600 型全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康雄性廣西巴馬小型豬10頭，2～3月齡，體重10～20 kg。所有小型豬均給予常規(guī)飲水，每日投食3次，飼養(yǎng)條件為室溫18～25 ℃，每日光照約12 h，相對(duì)濕度50%～80%，有持續(xù)空氣交換。小型豬適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組(n=5)，普通飼料喂養(yǎng)；糖尿病模型組(n=5)，高脂高糖飼料喂養(yǎng)(高脂高糖飼料配方為：蔗糖37%、豬油10%、膽固醇2%、普通飼料51%)。實(shí)驗(yàn)為期12個(gè)月，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 T2DM模型的構(gòu)建：根據(jù)動(dòng)物體重稱取適量STZ溶于0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.2～4.5)中，濃度為10 g/L，禁食空腹注射STZ溶液：11個(gè)月初給予模型組小型豬腹腔注射STZ 100 mg/kg，1周后，重復(fù)上述劑量1次。對(duì)照組小型豬腹腔注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。成模標(biāo)準(zhǔn)：參照1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)：具有糖尿病典型癥狀(多尿、多飲、多食及消瘦)，且空腹血糖≥7.0 mmol/L或隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L。如無(wú)糖尿病癥狀，則需空腹和餐后血糖同時(shí)達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，才可診斷糖尿病。

1.3.2 空腹血糖、胰島素、Hcy水平檢測(cè)：禁食過夜的小型豬前腔靜脈抽血，血糖采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)；血漿Hcy水平采用同型半胱氨酸測(cè)定試劑盒(酶法)檢測(cè)；胰島素放射免疫分析試劑盒檢測(cè)胰島素(INS)水平。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)的計(jì)算：HOMA-IR =空腹血糖(FPG)×空腹胰島素(FINS)/22.5。

1.3.3 胰腺組織HE染色及胰島β細(xì)胞免疫組化染色：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(12個(gè)月末)，將禁食過夜的小型豬采用速眠新(0.2～0.25 mL/kg)肌肉注射，聯(lián)合10%水合氯醛(2 mL/kg)腹腔注射麻醉，股動(dòng)脈放血處死，取胰腺組織，常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片, HE 染色，光鏡下觀察。并取胰腺組織石蠟切片，胰島素單克隆抗體作免疫組化染色(按試劑盒操作步驟進(jìn)行)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組小型豬一般情況比較及體重變化比較

對(duì)照組小型豬精神狀況良好，毛發(fā)光澤，生長(zhǎng)良好。糖尿病模型組均成模，成模小型豬毛發(fā)粗糙無(wú)光澤，精神萎靡，并出現(xiàn)多尿、多飲、多食及體重下降等糖尿病癥狀。高脂高糖飼料喂養(yǎng)10個(gè)月后，模型組小型豬的體重(86.32±5.86)kg較對(duì)照組小型豬的體重(41.54±4.54)kg明顯升高，差異有顯著性意義(t=15.672，P<0.01)。

2.2 高脂高糖飲食對(duì)小型豬FBG、FINS及HOMA-IR的影響

高脂高糖飼料喂養(yǎng)10個(gè)月后，模型組小型豬的FBG、FINS及HOMA-IR較對(duì)照組均明顯升高，差異有顯著性意義(P<0.01)，見表1。

表1 高脂高糖飲食對(duì)小型豬FPG、FINS及HOMA-IR的影響Tab 1 Time course of FPG, FINS and HOMA-IR in high fat/high carbohydrate and normal diet fed minipigs ±s)

2.3 STZ對(duì)小型豬FPG、FINS的影響

11個(gè)月初模型組小型豬腹腔注射不同劑量STZ后，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(12個(gè)月末)與對(duì)照組比較，模型組小型豬FPG水平明顯升高，F(xiàn)INS水平明顯降低，差異有顯著性意義(P<0.01)，且模型組小型豬FPG穩(wěn)定維持在9.8～15.6 mmol/L水平，見表2。

表2 STZ注射不同時(shí)間點(diǎn)兩組小型豬FPG及FINS水平比較Tab 2 Comparison of FPG and FINS at different time of STZ injection between the control group and model group ±s)

2.4 兩組小型豬胰腺組織HE染色結(jié)果比較

模型組鏡下可見胰島整體形態(tài)萎縮，邊緣不規(guī)整，細(xì)胞排列紊亂，胰島及胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目均減少，部分細(xì)胞核形狀不規(guī)則，胞漿內(nèi)呈空泡變性(如圖1A箭頭所示)。對(duì)照組胰島呈圓形或橢圓形，邊緣規(guī)整，與腺體緊密結(jié)合在一起，胰島及胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目多，胞核清晰且胞漿豐富，整個(gè)胰腺組織結(jié)構(gòu)基本正常(圖1B)。

圖1 小型豬胰腺組織HE染色結(jié)果(HE ×400)Fig 1 Hematoxylin eosin staining of pancreas in two groups (HE ×400)

2.5 兩組小型豬胰島β細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果比較

T2DM成模組每視野下(×200)可見散在數(shù)個(gè)胰島細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞排列紊亂(圖2A)，高倍鏡下(×400)胰島β細(xì)胞團(tuán)整體形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞，胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒明顯減少。對(duì)照組每視野下(×200)可見多個(gè)胰島細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞排列整齊(圖2B)，高倍鏡下(×400)胰島β細(xì)胞團(tuán)整體形態(tài)完整，占胰島細(xì)胞絕大部分，胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒著色深且含量豐富。

2.6 T2DM小型豬Hcy水平變化及與HOMA-IR相關(guān)性分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組Hcy(16.40±2.73)μmol/L高于對(duì)照組(9.68±2.99)μmol/L(t=3.712，P=0.006)。Pearson相關(guān)分析顯示，模型組HOMA-IR與Hcy呈正相關(guān)(r=0.906,P=0.034)。

圖2 小型豬胰島β細(xì)胞免疫組化染色比較 (×200)Fig 2 Immunostaining of pancreatic islet β cells in two groups (×200)

3 討 論

目前糖尿病的研究所采用的動(dòng)物多選用大鼠、小鼠、兔等動(dòng)物，它們的功能器官和人類有一定差距。豬是最接近人類的模式動(dòng)物，豬在解剖結(jié)構(gòu)、生理、代謝、肥胖傾向性及種類習(xí)性方面，其表現(xiàn)型與人類高度相似，而且它與人類在遺傳學(xué)上也具有高度相似性，特別是遺傳決定的代謝相似性，這使得豬成為研究人類肥胖、糖尿病及其并發(fā)癥等疾病的最佳模式動(dòng)物。其中小型豬動(dòng)物模型已廣泛運(yùn)用于心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、糖尿病、器官移植、皮膚燒傷整形、口腔疾病及手術(shù)外科等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究[5-7]。

本實(shí)驗(yàn)首先采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)小型豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小型豬出現(xiàn)明顯肥胖，胰島素水平逐漸升高，并產(chǎn)生IR，表現(xiàn)T2DM的病理特征，與Torres等[8]研究結(jié)果一致。為進(jìn)一步誘導(dǎo)典型T2DM模型，11個(gè)月初腹腔注射STZ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：模型組在高糖高脂飲食基礎(chǔ)上聯(lián)合多次STZ注射(STZ 100 mg/kg×2)可以成功構(gòu)建T2DM模型，成模小型豬均表現(xiàn)出典型“三多一少”DM癥狀，且FPG水平顯著上升，胰島素水平下降。胰腺病理切片及免疫組化均提示，成模組胰島β細(xì)胞破壞，數(shù)目明顯減少。結(jié)果提示，應(yīng)用高脂高糖喂養(yǎng)聯(lián)合STZ注射可以成功構(gòu)建小型豬T2DM模型，與既往研究結(jié)果一致[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血漿Hcy水平升高[1]，Gallistl 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖受試者血漿Hcy與體重指數(shù)、脂肪含量、內(nèi)臟脂肪比例、胰島素水平呈正相關(guān)，進(jìn)一步多元回歸分析發(fā)現(xiàn)IR是影響Hcy的主要因素。Fonseca等[11]應(yīng)用葡萄糖鉗夾試驗(yàn)研究了胰島素對(duì)T2DM患者和正常人血Hcy水平的影響, 輸注胰島素后, 正常人血Hcy顯著下降, 而伴IR的T2DM患者，無(wú)論給予大、小劑量的胰島素, 血Hcy都無(wú)變化，且高Hcy與IR獨(dú)立正相關(guān)。還有研究顯示, 高同型半胱氨酸血癥模型小鼠造模4周后，可以觀察到任意血糖明顯升高和胰島素敏感性顯著下降；同型半胱氨酸處理的脂肪細(xì)胞，對(duì)胰島素刺激下的葡萄糖攝取能力亦明顯降低[12]。高脂誘導(dǎo)的IR與大鼠血漿Hcy水平升高有關(guān)，吡格列酮可以降低血漿Hcy濃度，減輕IR[13]。本文結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組小型豬存在明顯IR，Hcy水平升高，且Hcy與IR呈正相關(guān)，與其他研究相一致[2]。提示T2DM模型組小型豬IR可能是Hcy水平升高的重要原因。胰島素作為參與合成代謝的激素，對(duì)Hcy代謝具有重要調(diào)節(jié)作用，IR導(dǎo)致Hcy的機(jī)制尚不明確，可能的機(jī)制是T2DM存在外圍組織胰島素作用障礙，對(duì)Hcy 調(diào)節(jié)作用下降，引起繼發(fā)性的Hcy代謝障礙；還有研究發(fā)現(xiàn)，IR導(dǎo)致了Hcy轉(zhuǎn)硫和甲基化通路的兩個(gè)關(guān)鍵酶胱硫醚B合成酶和亞甲基四氫葉酸還原酶活性降低，進(jìn)而抑制肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞胱硫醚β合成酶的表達(dá)[14-15]，由于上述Hcy的表達(dá)[14-15]，Hcy 代謝過程中相關(guān)酶合成減少，Hcy 在體內(nèi)堆積，形成高Hcy 血癥。

綜上所述，采用高脂高糖飼料聯(lián)合STZ可以成功誘導(dǎo)巴馬小型豬T2DM動(dòng)物模型，該模型具有與人類T2DM相似的生化及病理特征，該方法操作簡(jiǎn)便、易于掌握，且具有較好的安全性。模型組小型豬Hcy水平升高與IR有關(guān)。因此, 在以IR為主要病理生理機(jī)制的T2DM患者中應(yīng)重視檢測(cè)血漿Hcy水平，關(guān)于Hcy在T2DM IR發(fā)病機(jī)制中作用，還需進(jìn)一步深入的研究。

[1] Liu YN, Jung JH, Park H, et al. Olive leaf extract suppresses messenger RNA expression of proinflammatory cytokines and enhances insulin receptor substrate 1 expression in the rats with streptozotocin and high-fat diet-induced diabetes[J]. Nutr Res,2014,34(5):450-457.

[2] Feigh M, Hjuler ST, Andreassen KV, et al. Oral salmon calcitonin enhances insulin action and glucose metabolism in diet-induced obese streptozotocin-diabetic rats[J]. Eur J Pharmacol,2014,737C:91-96.

[3] 秦懷波,陳云,俞麗萍,等.糖尿病患者血糖和血脂水平改善與血漿同型半胱氨酸水平的相關(guān)性[J].中國(guó)糖尿病雜志,2011,19(2):123-125.

[4] 王庭俊,王中心,楊芳,等.糖尿病患者肥胖及胰島素抵抗與血漿同型半胱氨酸的關(guān)系[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,31(2):180-181.

[5] He B, Musk GC, Mou L,et al.Laparoscopic surgery for kidney orthotopic transplant in the pig model[J].JSLS, 2013,17(1):126-131.

[6] Wolf E, Braun-Reichhart C, Streckel E, et al. Genetically engineered pig models for diabetes research[J].Transgenic Res, 2014, 23(1):27-38.

[7] Sheu SY, Wang WL, Fu YT, et al. The pig as an experimental model for mid-dermal burns research[J]. Burns, 2014,9(14):164-168.

[8] Torres-Rovira L, Astiz S, Caro A, et al. Diet-induced swine model with obesity/leptin resistance for the study of metabolic syndrome and type 2 diabetes[J].Scientific World J, 2012, 5(2): 1-8.

[9] 肖國(guó)華,張素君,余堅(jiān),等.高糖高脂聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)版納微型豬2型糖尿病模型的建立[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2012,40(4):351-356.

[10] Gallistl S, Sudi K, Mangge H, et al.Insulin is an independent correlate of plasma homocysteine levels in obese children and adolescents[J].Diabetes Care,2000,23(9):1348-1352.

[11] Fonseca VA, Fink LM, Kern PA. Insulin sensitivity and plasma homocysteine concentrations in non-diabetic obese and normal weight subjects[J]. Atherosclerosis, 2003,167(1):105-109.

[12] Li Y, Jiang C, Xu G, et al. Homocysteine upregulates resistin production from adipocytes in vivo and in vitro[J]. Diabetes, 2008,57(4):817-827.

[13] 王文英,高愛濱,張健.吡格列酮對(duì)老年2型糖尿病患者C反應(yīng)蛋白及同型半胱氨酸的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2013,33(8):1895-1897.

[14] Dicker-Brown A, Fonseca VA, Fink LM,et al.The effect of glucose and insulin on the activity of methylene tetrahydrofolate reductase and cystathionine-beta-synthase: studies in hepatocytes[J]. Atherosclerosis, 2001,158(2):297-301.

[15] Fonseca V, Keebler M, Dicker-Brown A,et al.The effect of troglitazone on plasma homocysteine, hepatic and red blood cell S-adenosyl methionine, and S-adenosyl homocysteine and enzymes in homocysteine metabolism in Zucker rats[J]. Metabolism, 2002,51(6):783-786.

Relationship between serum homocysteine concentration and insulin resistance in the Bama miniature pig type 2 diabetes mellitus animal model

YU Jian1, ZOU Di-sha2, YE Yao2, HUANG Li-li1, LIU Xiao-ling1, MO Ru-fen1, YANG Fan1, HU Jing1, HE Yong-ling3

(1.DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege,Guilin541001,China; 2.GraduateSchool,GuilinMedicalCollege,Guilin541004,China; 3.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege,Guilin541001,China)

Objective To establish a Bama miniature pig type 2 diabetes mellitus (T2DM) animal model by high fat and high sugar diet and intraperitoneal (ip) injection of streptozotocin (STZ) and to investigate the relationship between serum insulin resistance and homocysteine(Hcy)concentration in the Bama miniature pig T2DM model. Methods Ten healthy male Bama miniature pigs were equally and randomly divided into control group and diabetic group (model group). The control group was fed with normal diet, while the model group was fed with high fat and high carbohydrate diet. After 10 months, the model group was injected with STZ 100 mg/kg. The injection was repeated a week later. While the control group was injected with the same amount of sodium citrate solution. Parameters including weight, FPG, FINS, and Hcy were measured. Meanwhile, the insulin resistance index (HOMA-IR) was calculated. Results (1) At the early stage of experiment, the values of weight, FPG, FINS, HOMA-IR increased significantly in the model group compared to the control group (P<0.01). (2) After administration of STZ, The serum level of FPG increased significantly, and the level of FINS was lower in the model group compared to the control group (P<0.01); (3) The level of Hcy was higher in the model group compared to the control group (P<0.01) and correlation analysis showed that HOMA-IR was positively cor-

high fat and high sugar diet; streptozotocin; type 2 diabetes mellitus; Bama miniature pig; homocystein

論 著

10.11724/jdmu.2015.01.05

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 (桂科攻1347003-5)；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳科研課題(Z2014301)

于 健(1965-)，女，廣西桂林人，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。E-mail：duduyu1623@qq.com

R587.1

A

1671-7295(2015)01-0020-04

于健，鄒迪莎，葉瑤，等. 巴馬小型豬T2DM模型胰島素抵抗與同型半胱氨酸的關(guān)系[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015,37(1)：20-24.

related with the level of Hcy in the model group (r=0.906,P<0.05).Conclusion The level of Hcy is associated with insulin resistance in T2DM miniature pig.

2014-08-16；

2014-12-12)