王 強(qiáng)，鞏 鵬，金 實(shí)，譚 廣，王洪江，郭慧淑，董 擂，李克軍，程 雷

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 普通外科，遼寧 大連 116011)

磁標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞作用的研究

王 強(qiáng)，鞏 鵬，金 實(shí)，譚 廣，王洪江，郭慧淑，董 擂，李克軍，程 雷

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 普通外科，遼寧 大連 116011)

目的 探討磁標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)對(duì)具有不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞的作用。方法 采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSCs，流式細(xì)胞儀測(cè)定BMSCs表面分子CD29、CD44、CD45。對(duì)BMSCs進(jìn)行超順磁性氧化鐵(SPIO)標(biāo)記。對(duì)SPIO標(biāo)記BMSCs分別與高低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞MHCC97-H和MHCC97-L的共培養(yǎng)及流式細(xì)胞儀鑒定。結(jié)果 普魯士藍(lán)染色顯示BMSCs的磁標(biāo)記率近95%, CD29、CD44呈陽性表達(dá)。SPIO標(biāo)記BMSCs 對(duì)高低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用,組間和組內(nèi)比較均有明顯差異，P<0.05。 結(jié)論 SPIO標(biāo)記BMSCs 對(duì)高低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞具有抑制作用，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；肝細(xì)胞癌；超順磁性氧化鐵

1974年首次從骨髓中分離獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchynal stem cells， BMSCs)[1]，BMSCs具有高度自我更新能力，在一定的條件下能分化為成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和肝細(xì)胞等，并且體外培養(yǎng)相對(duì)容易獲得，是其能夠進(jìn)行細(xì)胞治療的基礎(chǔ)。隨著干細(xì)胞臨床應(yīng)用的發(fā)展，干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)如何分布、遷徙、分化及代謝轉(zhuǎn)歸，其生物學(xué)行為如何監(jiān)測(cè)，成為評(píng)價(jià)治療效果的關(guān)鍵，本研究旨在為進(jìn)一步優(yōu)化干細(xì)胞治療方案提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)

取1～2個(gè)月月齡80～100 g SD大鼠1只，購自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，斷頸處死。無菌條件下分離股骨、脛骨，用DMEM培養(yǎng)液5 mL沖出骨髓腔內(nèi)的骨髓，離心，去除上清液，將沉淀接種于25 mL塑料培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后換培養(yǎng)液，以后每2～3天換液1次，通過換培養(yǎng)液，棄掉懸浮的非骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得貼壁生長(zhǎng)的BMSCs。純化后，按1∶2比例傳代培養(yǎng)。

1.2 BMSCs的鑒定

1.2.1 流式細(xì)胞儀測(cè)定BMSCs表面分子CD29、CD44、CD45:收集P3代生長(zhǎng)良好細(xì)胞，用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，吹打均勻，4 ℃ 1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，用PBS清洗細(xì)胞3遍。細(xì)胞計(jì)數(shù)，平均分到6個(gè)管中，依次加入抗CD29-FITC抗體、抗CD44-FITC抗體、抗CD45-FITC抗體、剩余3管不加任何抗體，做各管空白對(duì)照。4 ℃避光，培育45 min，PBS沖洗3遍后放入冰盒，避光，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.2 超順磁性氧化鐵(SPIO)標(biāo)記BMSCs及鑒定:將配制好的SPIO培養(yǎng)液5 mL加至第4代BMSCs培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后胰蛋白酶消化,PBS重懸,計(jì)數(shù)后備用。臺(tái)盼藍(lán)染色, 取第3代BMSCs，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)用0.25%胰蛋白酶1 mL消化成細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min。向上述0.5 mL細(xì)胞懸液中加入0.4%的臺(tái)盼藍(lán)溶液0.5 mL，混勻，靜置5 min。

1.2.3 高低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞MHCC97-H和MHCC97-L的培養(yǎng)(細(xì)胞株購自上海復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所):使用100 mL玻璃培養(yǎng)瓶加5 mL完全培養(yǎng)基,平放于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí),胰酶消化傳代。

1.2.4 SPIO標(biāo)記BMSCs分別與高、低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞MHCC97-H和MHCC97-L的共培養(yǎng)及流式細(xì)胞儀鑒定:分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好、SPIO標(biāo)記BMSCs和高低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞[MHCC97-H(HH)和MHCC97-L(HL)]，SPIO標(biāo)記BMSCs分別與肝癌細(xì)胞MHCC97-H及MHCC97-L按1∶1組、2∶1組、4∶1組及8∶1組加入培養(yǎng)基中，共8組，每?jī)商鞊Q液。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs磁標(biāo)記的鑒定

2.1.1 BMSCs的表面標(biāo)記物：取第3代BMSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其相應(yīng)抗體，結(jié)果顯示：CD29細(xì)胞計(jì)數(shù)陽性率為98.34%，CD44細(xì)胞計(jì)數(shù)陽性率為97.53%，CD45細(xì)胞計(jì)數(shù)陽性率為3.1%，符合BMSCs的表面抗原特性。臺(tái)盼藍(lán)染色染色顯示細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見較多藍(lán)染顆粒,標(biāo)記率達(dá)95%以上。

2.1.2 BMSCs磁標(biāo)記細(xì)胞與高低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞MHCC97-H和MHCC97-L生長(zhǎng)曲線比較：采用CCK8方法，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀器測(cè)定各共培養(yǎng)組細(xì)胞450 nm波長(zhǎng)的OD值，連續(xù)7天。以天數(shù)為橫坐標(biāo)、OD 值為縱坐標(biāo)繪制 hBMSCs 和不同肝癌CD29陰性細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各共培養(yǎng)組細(xì)胞，1～7天CD29 的陰性細(xì)胞計(jì)數(shù)表達(dá)率見表1，與 CCK8 方法檢測(cè)的各共培養(yǎng)組細(xì)胞 OD 值(表 2)相乘，得出不同天數(shù)、各共培養(yǎng)組CD29陰性細(xì)胞的 OD 值，繪制各共培養(yǎng)組CD29陰性細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，見圖1。

BMSCs磁標(biāo)記細(xì)胞對(duì)于MHCC97-H和MHCC97-L細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，隨著BMSCs濃度越高，抑制程度越來越明顯。BMSCs磁標(biāo)記細(xì)胞對(duì)于MHCC97-H和MHCC97-L細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制,組間比較差異有顯著性意義(P<0.05)，并且對(duì)于MHCC97-H組抑制更明顯。

3 討 論

最新的分子影像學(xué)技術(shù)，主要是MR和MSCs 的磁性納米顆粒標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步為開展本研究奠定了基礎(chǔ)。利用磁對(duì)比劑標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行 MR 成像是移植細(xì)胞定位及遷徙情況的重要監(jiān)測(cè)手段[2-3]。超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)作為 MRI 對(duì)比劑，已用于多種干細(xì)胞的標(biāo)記和移植后的活體示蹤[4]，其中MSCs 的磁性納米顆粒標(biāo)記技術(shù)可以觀察MSCs 的定向遷移及消滅肝癌組織和修復(fù)過程中MSCs 的動(dòng)態(tài)變化，以及MR多參數(shù)評(píng)價(jià)肝癌形態(tài)學(xué)的演變[5-8]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)利用磁性納米顆粒標(biāo)記MSCs對(duì)具有不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞的作用和影響，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用影像學(xué)技術(shù)評(píng)價(jià)MSCs對(duì)肝癌高低轉(zhuǎn)移潛能的影響作準(zhǔn)備。

表1 共培養(yǎng)各組連續(xù) 7 天的 CD29 陰性表達(dá)率Tab 1 CD29 negative expression rate in co-cultured group for seven days (%)

表2 不同細(xì)胞培養(yǎng)組1～7天的 450 nm處的OD值Tab 2 OD values of 450 nm in Different cell culture group for 1-7 days ±s)

圖1 CD29陰性表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig 1 Growth curves of CD29 negative expression cells

BMSCs可抑制肝癌細(xì)胞增殖，BMSCs在肝癌細(xì)胞治療中的研究尚處于初級(jí)階段,其抑制肝癌細(xì)胞增殖的具體機(jī)制目前尚不清楚,可能通過以下幾個(gè)途徑得以實(shí)現(xiàn)：(1)通過抑制惡性腫瘤細(xì)胞分子蛋白激酶B(Akt)激活實(shí)現(xiàn)，Akt是磷脂酰肌醇3激酶—分子蛋白激酶B通路(PI3K-Akt信號(hào)通路)的核心組成部分，該通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖, 其活性異常不僅能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化, 而且與腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等相關(guān)；(2)在人MSCs對(duì)腫瘤細(xì)胞的Wnt信號(hào)通路抑制中起作用，Wnt信號(hào)通路包含許多信號(hào)成員蛋白,其中任何一個(gè)成員蛋白的突變或異常均可激活Wnt信號(hào)通路引起細(xì)胞異常增殖而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；(3)MSCs能分泌大量的血管生成因子，包括angiopoietin1(Ang1)，Angl能抑制腫瘤-血管泄漏，抑制腫瘤生長(zhǎng)；(4)MSCs主要位于腫瘤邊緣，形成被囊樣結(jié)構(gòu)，這種獨(dú)特的MSCs分布可能形成一種屏障防止肝癌細(xì)胞進(jìn)入正常的肝組織內(nèi)[9-15]。MSCs在原發(fā)性肝癌中的治療機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，目前尚未完全闡明。MSCs誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的研究是細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，而MSCs作為骨髓中一種主要的具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，來源廣泛，體外培養(yǎng)擴(kuò)增容易，同樣也被證實(shí)在體外誘導(dǎo)劑及肝內(nèi)微環(huán)境作用下可以分化為具有正常功能的肝樣細(xì)胞或肝細(xì)胞 ，因此MSCs作為種子細(xì)胞在治療肝臟疾病方面具有很好的前景。根據(jù)前述文獻(xiàn)分析可知MSCs 促使惡性腫瘤細(xì)胞分子蛋白激酶B(Akt)激活通路的失活與肝癌的增殖有關(guān)，與肝癌細(xì)胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等相關(guān)，而這些機(jī)制也是包括肝癌在內(nèi)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的必經(jīng)過程，因此，可以假設(shè)認(rèn)為MSCs 不但通過多種途徑抑制肝癌細(xì)胞的存活和增殖，也抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生，MSCs 對(duì)具有高低不同轉(zhuǎn)移特性肝癌的轉(zhuǎn)移潛能影響程度也應(yīng)不同[16-21]。

本實(shí)驗(yàn)中體外培養(yǎng)的BMSCs通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示細(xì)胞均一性較好，表達(dá)高水平CD29和CD44，CD45表達(dá)率極低，符合BMSCs的特點(diǎn)。臺(tái)盼藍(lán)染色染色顯示細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見較多藍(lán)染顆粒, 磁性納米顆粒標(biāo)記率達(dá)90%以上。

本研究結(jié)果顯示，BMSCs能在一定程度上抑制MHCC97-H和MHCC97-L的生長(zhǎng)，且不同濃度磁標(biāo)記BMSCs的抑制程度不同，濃度越高抑制越明顯，并且對(duì)于MHCC97-H的作用更顯著。其體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還需要今后進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Effects of magnetically labeled bone mesenchymal stem cells to hepatocellular carcinoma cells with different metastatic potential

WANG Qiang, GONG Peng, JIN Shi, TAN Guang, WANG Hong-jiang,GUO Hui-shu, DONG Lei, LI Ke-jun, CHENG Lei

(DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)

Objective To label rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) with superparamagnetic iron oxide (SPIO) and to explore the curative effects of BMSCs to hepatocellular carcinoma cells with different metastatic potential. Methods BMSCs were isolated and purified from bone marrow of Sprague-Dawly (SD) rats and cultured in vitro. Detect the surface markers (CD29,CD44,CD45) of BMSCs by flow cytometry and lable BMSCc with SPIO. Results Immunohistochemistry showed positive expression of CD29 and CD44 of BMSCs. Prussian blue stain confirmed that the labeling efficiency of SPIO was above 95%. SPIO-labeled BMSCs inhibited the growth of hepatocellular carcinoma cells with different metastatic potential (MHCC97-H and MHCC97-L). The differences were significant within the groups and between the groups,P<0.05. Conclusion SPIO-labeled BMSCs could inhibit the growth of hepatocellular carcinoma cells with different metastatic potential. The mechanism should be studied further.

bone mesenchymal stem cells; hepatocellular carcinoma; superparamagnetic iron oxide (SPIO)

論 著

10.11724/jdmu.2015.01.03

遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013225002)

王 強(qiáng)(1990-)，男，山西朔州人，碩士研究生。E-mail:278063060@qq.com

程 雷，教授。E-mail:docchengleii@163.com

R735.7

A

1671-7295(2015)01-0013-04

王強(qiáng)，鞏鵬，金實(shí)，等. 磁標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞作用的研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015,37(1)：13-16.

2014-11-15；

2014-12-25)