張明露，劉文君,李翠萍，李玉仙，顧軍農(nóng)（1.北京工商大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系,北京 100048；.清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院,北京 100084；.北京市自來水集團(tuán),北京 10001）

水源切換對水廠出水細(xì)菌群落的影響

張明露1,2，劉文君2*,李翠萍2，李玉仙3，顧軍農(nóng)3（1.北京工商大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系,北京 100048；2.清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院,北京 100084；3.北京市自來水集團(tuán),北京 100031）

針對水源切換可能造成水廠出水微生物風(fēng)險的問題,以北京某水廠由本地水源切換為河北水源期間原水和出廠水為研究對象,采用焦磷酸測序技術(shù)對水中的微生物種群結(jié)構(gòu)和潛在致病菌進(jìn)行分析.結(jié)果顯示,出廠水的細(xì)菌多樣性顯著低于原水,原水和出廠水中的優(yōu)勢菌均為變形菌門（Proteobacteria）,所占比例為11.99%～95.48%,其中包括α,β和γ變形菌綱（α, β, γ-Proteobacteria）,但相對豐度有較大差異.水源切換后的原水中優(yōu)勢菌為藍(lán)藻門（Cyanobacteria）,且該菌在切換后的出廠水中也存在.出廠水中檢測到部分潛在致病菌,優(yōu)勢菌包括不動桿菌（Acinetobacter）和代爾夫特菌（Delftia）,增加了飲用水的微生物安全風(fēng)險.PCoA結(jié)果顯示,水源切換前后原水中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化較大,但改變水源對出廠水的微生物群落影響較小,水廠能夠維持穩(wěn)定的運(yùn)行.

水源切換；微生物安全性；焦磷酸測序；致病菌

隨著城市水資源的日益匱乏和水質(zhì)持續(xù)惡化,單一水源往往不能保證供水量,許多城市特別是北方地區(qū)缺水城市,常采用多水源聯(lián)合供水的方式,如季節(jié)性的水源切換和長距離調(diào)水工程等.然而,由于各水源之間水質(zhì)存在差異,使城市供水系統(tǒng)面臨各種水質(zhì)安全問題.研究表明,不同水源切換時,由于水質(zhì)化學(xué)組成的差異有可能引起管網(wǎng)水中鐵腐蝕產(chǎn)物的釋放量增加［1］,導(dǎo)致用戶端水質(zhì)惡化,如濁度和色度升高、產(chǎn)生異味,發(fā)生“黃水”問題等［2-4］.

除了水質(zhì)化學(xué)的變化,不同水源的生物組成也有差異.我國南方地區(qū)的一些水源中微生物數(shù)量較多、微型水生動物過度孳生［5-7］,已成為威脅飲用水水質(zhì)安全的潛在風(fēng)險因素.然而,目前對水源切換過程中微生物安全性研究較少.為保證水源切換期間水廠出水持續(xù)達(dá)標(biāo),保障管網(wǎng)微生物安全性,研究水源切換前后出水的微生物變化規(guī)律,特別是病原微生物的存在,是預(yù)防和治理微生物污染的基礎(chǔ).

近年來,高通量測序技術(shù)為環(huán)境微生物生態(tài)研究提供了新的手段,它能克服傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)的缺陷,對樣品進(jìn)行深度測序,全面解析樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu).目前,國內(nèi)外已在飲用水系統(tǒng)的微生物研究方面開展了一些應(yīng)用,但尚處于初級階段［8-11］.本文以北京某水廠水源切換期間原水和出廠水的微生物群落為研究對象,采用454焦磷酸測序分析了水源切換對出廠水微生物多樣性的影響,旨在為多水源水廠的運(yùn)行和管理提供參考.

1　材料與方法

1.1樣品采集

表1　原水和出廠水水質(zhì)參數(shù)Table 1　Water quality parameters of raw and finished water

于2011年7月～8月采集北京某地表水廠在水源切換期間的原水和出廠水,該水廠切換前水源為本地水庫水,其主要處理工藝為絮凝、沉淀、煤砂濾池、活性炭吸附和氯消毒.7月30日開始切換為河北水庫水.表1為切換前后原水和出廠水的常規(guī)水質(zhì)參數(shù).切換后原水pH值下降,濁度和色度均有所升高.分別于7月22和7月26日采集切換前原水（J1和 J2）和出廠水（C1和 C2）, 于7月31日,8月2日,4日和6日采集切換后的原水（J3, J4, J5和J6）和出廠水（C3, C4, C5和C6）.

使用無菌塑料桶采集水樣5～10L,2h內(nèi)返回實(shí)驗(yàn)室并立即過濾.將水樣通過0.22μm孔徑,直徑為90mm的濾膜（GSWP,Millipore）,將濾膜取下后放入50mL無菌離心管中,加入10mL PBS緩沖液渦旋振蕩洗脫,將洗脫液8000r/min,離心10min,沉淀重懸于1～2mL PBS緩沖液中,置于-80℃冰箱中備用.

1.2總DNA的提取

使用Soil DNA提取試劑盒（MO-Bio,美國）提取水樣中 DNA,操作按照試劑盒的說明進(jìn)行.DNA濃度采用Nanodrop 2000在260nm下測定（Nano-drop Technologies, Wilmington, DE）.

1.3454高通量測序

應(yīng)用高通量測序平臺 Barcoded 454GSFLX Titanium對DNA樣品進(jìn)行測序.使用帶8bp樣本標(biāo)簽的引物擴(kuò)增16SrRNA的V1-V3區(qū).上游引物為 28F5'-TTTGATCNTGGCTCAG-3',下游引物為519R 5'-GTNTTACNGCGGCKGCTG-3'［12］. PCR反應(yīng)采用Hot Start and HotStar high fidelity Taq polymerases混合酶進(jìn)行擴(kuò)增.反應(yīng)體系為50μL,反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性 2min,95℃ 30s, 55 30s,72 30s℃℃,循環(huán)30次；72℃延伸5min,PCR產(chǎn)物回收定量后應(yīng)用454 測序平臺測序.

1.4數(shù)據(jù)處理

測序結(jié)果采用 QIIME軟件進(jìn)行分析［13］.對GS-FLX測序的序列進(jìn)行測序質(zhì)量和長度篩選,去掉含有不確定堿基（N）的序列,去掉長度小于200bp的序列.與RDP數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對,以序列相似性 97%為閾值,將序列分為可操作分類單元（OTU）.通過基于UniFrac距離和加權(quán)組平均法進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）.選取相似度在97%條件下的OTU生成物種稀疏曲線.Good's覆蓋率按（1-n/N）×100計(jì)算,n為單一序列的數(shù)目,N為樣品含有的序列總數(shù).

2　結(jié)果與討論

2.1細(xì)菌多樣性

采用高通量測序法對水源切換前后的 6個原水和6個出廠水進(jìn)行16SrDNA基因片段序列分析,共獲得有效序列63946條,序列平均長度為468bp.通過計(jì)算多樣性指數(shù)Shannon和物種豐富度指數(shù) Chaol來評估文庫所代表的微生物多樣性,序列信息及多樣性指數(shù)見表 2.種群個體分配越均勻,Shannon指數(shù)值就越大,Chaol為估計(jì)群落中的OTU數(shù)目.由表2可見,無論是豐富度指數(shù)Chaol還是Shannon指數(shù),原水均顯著高于出廠水（t檢驗(yàn), P＜0.05）.以Good's覆蓋率結(jié)合物種稀疏曲線來評估所構(gòu)建的文庫對樣品中微生物多樣性的體現(xiàn),如表2和圖1所示,12個樣品文庫的覆蓋率均大于95%,且稀疏曲線趨向于平緩,說明測序深度能夠較真實(shí)地反映樣本的細(xì)菌多樣性.同時,稀疏曲線顯示原水稀疏曲線明顯比出廠水陡峭,說明原水中的微生物種類顯著高于出廠水.

表2　測序信息及物種多樣性指數(shù)比較Table 2　Comparison of sequential analysis and diversity indices from the pyrosequencing analysis

圖1　水樣的物種稀疏曲線Fig.1　Rare faction curves of water samples

2.2細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

圖2　原水和出水中細(xì)菌門水平相對豐度Fig.2　Relative abundance of different phyla in raw waters and finished water

圖3　原水和出水中細(xì)菌綱水平相對豐度Fig.3　Relative abundance of different classes in raw waters and finished water

以門為分類單元分析水樣中細(xì)菌群落的結(jié)果如圖 2所示.12個水樣中優(yōu)勢細(xì)菌（相對豐度＞1%）共包括 7個門,分別是放線菌門（Actinobacteria）,擬桿菌門（Bacteroidetes）,藍(lán)藻門（Cyanobacteria）,厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）,變形菌門（Proteobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）.原水中除了 J5,其余 5個水樣中的第1優(yōu)勢細(xì)菌均為變形菌門,其相對豐度為24.90%～59.96%,該菌在水樣J1中相對豐度最高.J5中第1優(yōu)勢細(xì)菌為藍(lán)藻門,其相對豐度為 24.23%,且該菌在切換前的原水中未發(fā)現(xiàn).由圖2可以看出,水源切換前后原水中細(xì)菌群落的變化較大.切換前原水中特有的細(xì)菌包括放線菌門和擬桿菌門,切換后原水特有的細(xì)菌除藍(lán)藻門外,還包括厚壁菌門.6個出廠水中的第1優(yōu)勢細(xì)菌均為變形菌門,所占比例最高的為 C1,達(dá) 95.48%.水源切換前后變形菌門和放線菌門在 6個出廠水中一直存在.此外,藍(lán)藻門細(xì)菌在水源切換后的出廠水中均能檢測到.

以綱為分類單元分析12個水樣的細(xì)菌群落結(jié)果如圖3所示.12個水樣中優(yōu)勢細(xì)菌覆蓋了33個綱,其中相對豐度大于1%的包括10個綱.水源切換前,原水J1和J2中第一優(yōu)勢細(xì)菌均為γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）,相對豐度分別為 27.77%和35.91%,其次為β變形菌綱（Betaproteobacteria）和α變形菌綱（Alphaproteobacteria）；水源切換后,原水中第一優(yōu)勢菌為 α變形菌綱,相對豐度達(dá) 44.74%～50.55%.水源切換后,原水中未知細(xì)菌的比例明顯升高,其相對豐度在J5水樣中最高,達(dá)40.96%.切換前后出廠水中細(xì)菌種類和比例變化較小,優(yōu)勢細(xì)菌均為α,β和γ變形菌綱.

表3　原水和出廠水中潛在病原菌種類及豐度Table 3　Taxonomic composition and relative abundance of potential pathogens in raw water and finished water

2.3水樣中潛在病原菌多樣性

12個水樣中含有的優(yōu)勢潛在病原菌種類和相對豐度見表3.共檢測到13種潛在致病菌,其中5種為WHO《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》中所列出的致病菌［14］,分別為不動桿菌（Acinetobacter）,氣單胞菌（Aeromonas）,芽孢桿菌（Bacillus）,大腸桿菌（Escherichia）和假單胞菌屬（Pseudomonas）.在 12個樣品中相對豐度最高的潛在致病菌為不動桿菌和代爾夫特菌（Delftia）.原水中豐度最高的潛在病原菌為不動桿菌,在J1中占25.61%；出廠水中豐度最高的為代爾夫特菌,在C3中占50.75%,而且這兩種菌在出廠水中的含量均顯著高于原水（t 檢驗(yàn), p＜0.05）.其它潛在致病菌數(shù)量較少,在出廠水中的比例范圍為0.03～4.45%.

2.4水樣中細(xì)菌群落組成差異分析

采用PCoA分析衡量樣本間物種組成的相似度,用加權(quán)重（weighted）計(jì)算方法獲得結(jié)果.由圖 4可見,12個水樣聚類成3個群,52.42%和18.72%的微生物群落差異可以由PCo1軸和PCo2軸解釋.水源切換前的兩個原水J1和J2距離最近,分布于第四象限,切換后的4個原水J3～J6相似度較高,聚類于第二象限；水源切換對出廠水影響較小,6個出廠水相似度較高,分布于第一象限.

圖4　水樣細(xì)菌群落的主坐標(biāo)分析Fig.4　Principal coordinates analysis （PCoA） of bacterial communities in water samples

2.5討論

本研究采用焦磷酸測序技術(shù)分析水源切換對水廠出水微生物安全性的影響.新一代測序技術(shù)突破了傳統(tǒng)微生物分離純化方法的局限性,能較全面揭示各種生態(tài)環(huán)境中微生物多樣性,目前焦磷酸測序法已成功應(yīng)用到食品［15］,土壤［16］,污水［17］和飲用水［18］等領(lǐng)域微生物群落研究中.本文對12個水樣的測序覆蓋率達(dá)到95.86%～98.14%,稀疏曲線也趨于平緩,說明測序深度可以充分的表征樣品中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性,滿足對飲用水貧營養(yǎng)環(huán)境中細(xì)菌群落的研究需求,特別是對數(shù)量較少的病原微生物的分析.

通過比較水源切換前后原水中的細(xì)菌種群發(fā)現(xiàn),北京水庫和河北水庫中的微生物群落結(jié)構(gòu)差異明顯,存在部分共同的優(yōu)勢菌,但相對豐度不同.原水中的優(yōu)勢菌包括變形菌門和藍(lán)藻門,所占比例最高分別達(dá)59.96%和24.23%,這2類細(xì)菌均為飲用水系統(tǒng)中的常見菌屬［19-20］.藍(lán)藻門在切換前的原水中并沒有發(fā)現(xiàn),水源切換后的4個原水和 4個出廠水中均檢測到不同豐度的藍(lán)藻門細(xì)菌,說明本地水庫水源中不含有藍(lán)藻門細(xì)菌,而在切換后的河北水庫水源中藍(lán)藻門細(xì)菌所占比例較高.藍(lán)藻在水體中過量增殖可能引發(fā)水華,導(dǎo)致水質(zhì)下降,并且水中藻毒素的含量會升高［21-22］,對公眾健康產(chǎn)生潛在危害,提示水處理廠在切換為河北水庫水源時應(yīng)注意監(jiān)測藻類數(shù)量,以便及時采取適當(dāng)處理措施.此外,原水中還發(fā)現(xiàn)含有大量無法確定其分類位置的序列,表明原水中存在大量未被認(rèn)知的細(xì)菌類群,其對給水處理系統(tǒng)的影響及病原特征尚有待進(jìn)一步研究.

對水樣中潛在病原菌的分析發(fā)現(xiàn)多種致病菌或條件致病菌,如不動桿菌、代爾夫特菌、氣單胞菌和芽孢桿菌等,前兩者為優(yōu)勢菌.不動桿菌屬細(xì)菌廣泛存在于土壤、淡水及污水環(huán)境中, 97%的天然地表水樣品中均可分離到該菌,占飲用水樣品中HPC菌群的1.0～5.5%［23］.該菌為條件致病菌,可引起泌尿道感染、肺炎、菌血癥、繼發(fā)性腦膜炎以及傷口感染,多發(fā)于免疫力低下人群,如新生兒和老年人［24］.出廠水中的不動桿菌比例較高（12.96%～39%）,應(yīng)引起水廠的關(guān)注.

出廠水中另一種優(yōu)勢菌為代爾夫特菌,比例為18.16%～50.75%,但該菌在原水中比例為 3.15%～15.64%,說明該菌在水處理過程中得到了富集和累積.代夫特菌屬是1999年建立的一個新菌屬,屬于變形菌β綱,廣泛分布于土壤、水源等自然環(huán)境,為少見的人類機(jī)會致病菌,主要在免疫力抑制或在侵入性操作時易發(fā)生感染.代爾夫特菌屬由食酸代夫特菌和 Delftiatsuruhatensis兩個菌種組成,后者尚未見分離于臨床標(biāo)本的報(bào)道.近年來,食酸代爾夫特菌感染在我國時有發(fā)生,可導(dǎo)致肺炎,敗血癥等［25-26］.該菌在飲用水中已被多次發(fā)現(xiàn)［9,26］.本研究發(fā)現(xiàn)的代爾夫特菌包括上述食酸代夫特菌和Delftiatsuruhatensis,相似度最高達(dá)到97%.

比較水源切換前后原水和出廠水中細(xì)菌群落組成發(fā)現(xiàn),本地水源與河北水源細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)明顯不同,在主坐標(biāo)圖中分為兩個群,但出廠水的細(xì)菌群落相似度很高,說明原水微生物組成對出廠水影響不大,切換水源后水廠仍能平穩(wěn)運(yùn)行.

3　結(jié)論

3.1通過對北京某地表水廠水源切換期間的原水和出廠水的分析發(fā)現(xiàn),本地水源與河北水源細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)明顯不同.水處理廠的原水和出廠水中細(xì)菌群落具有較高的多樣性,分布在7個門,出廠水中細(xì)菌多樣性顯著低于原水.原水和出廠水中優(yōu)勢菌均為變形菌門,包括α,β和γ變形菌綱.此外,切換后的河北水源中優(yōu)勢菌還包括藍(lán)藻門和大量未確定的細(xì)菌.

3.2在原水和出廠水中均存在部分致病菌或條件致病菌.其中不動桿菌和代爾夫特菌所占比例較高,增加了飲用水的健康風(fēng)險,應(yīng)引起水廠關(guān)注以保障飲用水供水安全.

3.3切換水源對水廠原水中細(xì)菌群落影響較大,但對出廠水中細(xì)菌群落的影響較小,切換前后出廠水的細(xì)菌群落相似度較高.在水源切換期間出廠水能維持微生物群落穩(wěn)定,確保居民用水安全.

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Effect of water switch on the bacterial community structure of finished water in a drinking water treatment plant.

ZHANG Ming-lu1,2, LIU Wen-jun2*, LI Cui-ping2, LI Yu-xian3, GU Jun-nong3（1.Department of Environmental Science and Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2.School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084, China；3.Water Quality Monitoring Center, Beijing Waterworks Group, Beijing 100031, China）.

China Environmental Science, 2015,35（8）：2517～2522

To evaluate the microbial safety during the source water switch in a drinking water treatment plant in Beijing, bacterial community compositions and potential pathogensin the raw water and finished water were analyzed by pyrosequencing. The bacterial diversity of finished water was significantly lower than raw water. Proteobacteria were observed as one of the most dominant populations both in raw water and finished water, ranging from 11.99% to 95.48%. Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria and Gammaproteobacteria dominated in this group. However, the relative abundance varied in raw water and finished water. Cyanobacteria were found in raw water and finished water after water switch. Several potential pathogens were detected in the finished water and the majorbacteria were Acinetobacterand Delftia. The occurrence of pathogens was associated with increased health risk. PCoA results showed that bacterial community structure in raw water before switch was significantly different from that after water switch, but water switch had little effect on the bacterial composition of finished water. The water treatment plant operated stably during water switch.

water switch；microbial safety；pyrosequencing；pathogen

X52,R123

A

1000-6923（2015）08-2517-06

2015-02-05

國家水專項(xiàng)（2012ZX07404002）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（51408010）

* 責(zé)任作者, 教授, wjliu@tsinghua.edu.cn

張明露（1982-）,女,黑龍江哈爾濱人,講師,博士,主要從事飲用水的微生物安全研究.發(fā)表論文10余篇.