劉玉華，孟晶山（新疆克拉瑪依綠成農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司乳品廠，新疆克拉瑪依 834000）

傳統(tǒng)發(fā)酵酸駝乳中酵母菌的分離與鑒定

劉玉華，孟晶山
（新疆克拉瑪依綠成農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司乳品廠，新疆克拉瑪依 834000）

為了了解塔城和豐地區(qū)的酵母菌特征，分離該傳統(tǒng)發(fā)酵酸駝乳中的3株酵母菌，采用形態(tài)學(xué)觀察，生理生化試驗(yàn)和ITS間區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)合的方法，將T-1酵母菌鑒定為Issatchenkia orientails（東方伊薩酵母），T-2鑒定為Issatchenkia orientails（東方伊薩酵母），T-3鑒定為Saccharomyces unisporus（單孢酵母）。為酵母菌的進(jìn)一步開發(fā)利用和自然菌種的保藏提供基礎(chǔ)。

酸駝乳；酵母菌；分離；鑒定

世界上許多國(guó)家將駝乳視為上等的營(yíng)養(yǎng)性食品。駝乳除了含有與牛乳相似的營(yíng)養(yǎng)成分外，還具有很多的生物活性成分，即駝乳中含有大量的諸如溶菌酶、乳鐵蛋白和免疫球蛋白等抗微生物因子，在機(jī)體抗病機(jī)制方面起著重要作用［1］。酸駝乳（Hogormag）是由鮮駝乳經(jīng)乳酸菌和酵母菌等微生物自然發(fā)酵制成的酸性低酒精含量乳飲品。駝乳及酸駝乳已經(jīng)在哈薩克斯坦等許多國(guó)家的民間醫(yī)院和診所用于治療胃腸道潰瘍、慢性肝炎等感染性疾?。?］。新疆醫(yī)科大學(xué)古麗孜亞·卡克巴依等（2007）研究證明，發(fā)酵駝乳具有抗炎作用和免疫調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制與抑制炎性因子的滲出，降低CRP含量及消除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)［3］。Alhadrami等也報(bào)道酸駝乳還可用來(lái)治療結(jié)核病和其他一些胃腸道疾?。?］。

乳制品中酵母的鑒定主要是使用常規(guī)的生理生化方法，包括形態(tài)上的、生理學(xué)上的、生物化學(xué)上的和某些生態(tài)學(xué)上的性質(zhì)，這些技術(shù)需要豐富的經(jīng)驗(yàn)。傳統(tǒng)菌株鑒定方法一般要經(jīng)過(guò)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)，最后查檢索表來(lái)確定所測(cè)菌株的種屬［5］。同時(shí)，還可以采用新方法，以簡(jiǎn)化酵母的鑒定，其中包括分子生物技術(shù)的應(yīng)用，商業(yè)中成套機(jī)器的使用以及計(jì)算機(jī)的分析。

為了全面了解酵母菌生物學(xué)特性及為其以后的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，本試驗(yàn)主要使用傳統(tǒng)的生理生化方法和對(duì)ITS間區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增相結(jié)合的方法對(duì)酵母菌進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

酸駝乳樣品采集于塔城和豐牧民家發(fā)酵缸中， 是牧民利用自然發(fā)酵法制作成的。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)源

102：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；

2.1549：馬克斯克魯維酵母 （Kluyveromyces marxian us）；

2.68：漢遜酵母（Hansenula）。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

分離使用PDA（Potato Dextrose Agar）合成培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)使用YPD（Yeast extract Peptone Dextrose）培養(yǎng)基，生理生化試驗(yàn)使用氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、無(wú)維生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基、糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Gorodkowa培養(yǎng)基和脲酶培養(yǎng)基。

1.1.4 儀器設(shè)備

HVE-50高壓蒸汽滅菌器（日本HIRAYAMA）；

ZHJH-1214B垂直流超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司）；JT102N電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；PL303/01電子精密天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；Motic/AE31EFINV圖像處理倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS日本公司）；HQ-60-Ⅱ漩渦混合器（北方同正）；BCD-276W海爾電冰箱（海爾集團(tuán)青島海爾電冰箱股份有限公司）；

LHR-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；水浴鍋（SIBATA，日本）。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離

將樣品稀釋涂布于酸化PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)2d后選取單個(gè)菌落觀察、編號(hào)、劃線純化并保存。

1.2.2 菌株的活化及菌懸液制備

先將試驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于YPD固體斜面培養(yǎng)基活化培養(yǎng)3代，經(jīng)染色鏡檢為純培養(yǎng)物后，用無(wú)菌生理鹽水洗滌離心2次，制成菌懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，使懸液至半透光。

1.2.3 菌落特征觀察

用平板劃線法將菌從固體斜面接種到固體平板上，25℃培養(yǎng)24h。觀察菌落的顏色、凸起、透明度、光滑度、形狀、邊緣。

1.2.4 菌株形態(tài)學(xué)觀察

用接種環(huán)蘸取1或2環(huán)菌液涂于載玻片上，涂抹均勻后，火焰固定。然后，用結(jié)晶紫染色1min，洗去染色液，滴香柏油，于顯微鏡油鏡上觀察菌株的大小、形態(tài)等特征。

1.2.5 酵母菌生理生化試驗(yàn)

待測(cè)菌株活化3代后，制成106cfu/mL左右的供試菌懸液，進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

（1）碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)。碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)采用杜氏管（Durham tube）法，測(cè)試6種糖，包括：葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖。配制濃度為2%，其中麥芽糖需濾菌處理，其它均高壓滅菌。

將制成的細(xì)胞懸液，以每管0.1mL的量接種于準(zhǔn)備好的發(fā)酵試管內(nèi)，搖勻，25℃下培養(yǎng)14d，第3，7，14d觀察杜氏管內(nèi)是否有氣體積存及其積存量。

（2）碳源同化試驗(yàn)。碳源同化試驗(yàn)采用液體法，選用17種碳源作為同化試驗(yàn)對(duì)象，用氮基礎(chǔ)液配制成0.5%（棉籽糖1%）的溶液，主要包括以下方面。六碳糖：半乳糖，葡萄糖；雙糖：蔗糖，麥芽糖，纖維二糖，乳糖，蜜二糖；三糖：棉子糖，松三糖；五碳糖：D-阿拉伯糖；醇類：赤蘚糖醇，D-甘露醇，乙醇；有機(jī)酸：琥珀酸，檸檬酸，D-乳酸；其他：檸檬酸三銨。其中，麥芽糖、D-阿拉伯糖需濾菌處理，琥珀酸、D-乳酸調(diào)pH值至5.7。

將制成的細(xì)胞懸液用無(wú)菌吸管滴入準(zhǔn)備好的試管內(nèi)，每管一滴（約為40～50μL），25℃下培養(yǎng)14d，于第3、7、14d觀察，并記錄結(jié)果。

（3）氮源同化試驗(yàn)。酵母菌可以利用很多含氮化合物作為氮源，但對(duì)硝酸鹽、亞硝酸鹽、鹽酸乙胺、二鹽酸尸胺、L-賴氨酸等的同化利用最有分類價(jià)值，日常鑒定酵母中需測(cè)以下氮源的同化反應(yīng)：

硫酸銨 0.5%

硝酸鉀 0.78%

亞硝酸鈉 0.032 5% 調(diào)pH值6.5過(guò)濾除菌

尸胺 0.085% 過(guò)濾除菌

賴氨酸 0.07% 過(guò)濾除菌

將制成的細(xì)胞懸液用無(wú)菌吸管滴入準(zhǔn)備好的同化管內(nèi)，每管一滴（約為40～50μL），25℃下培養(yǎng)14d，于第3、7、14d觀察，并記錄結(jié)果。

（4）維生素需要情況試驗(yàn)。測(cè)試無(wú)維生素、無(wú)硫胺素、無(wú)吡哆素、無(wú)煙酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況。接種方法，培養(yǎng)條件及結(jié)果記錄與碳源化合物的同化試驗(yàn)相同。

（5）放線菌酮抗性試驗(yàn)。配制成含放線菌酮100ppm和1 000ppm濃度液體培養(yǎng)基（濾菌），接種、培養(yǎng)、結(jié)果記錄與判定方法與碳源同化試驗(yàn)相同。

（6）溫度試驗(yàn)。在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)：與葡萄糖同化試驗(yàn)相同，接種后于30、37、42℃下培養(yǎng)14d后以同樣方式記錄結(jié)果。

（7）尿素酶試驗(yàn)。固體培養(yǎng)基法：把活化后的測(cè)試菌株接種于脲酶培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7d，其間每天觀察一次，出現(xiàn)深粉紅色者為陽(yáng)性反應(yīng)。

1.2.6 酵母菌ITS間區(qū)PCR擴(kuò)增

（1）酵母DNA提取。提取方法為改良氯化芐法。預(yù)處理的菌泥懸浮于0.5mL提取液A，用長(zhǎng)嘴吸管吸打數(shù)次，充分混勻；依次加入100μL 10%SDS 和300μL氯化芐，漩渦高速震蕩5min；50℃保溫1h，間隔5～10min震混一次；加0.3ml 3M醋酸鈉（pH5.2）冰浴30min；12 000g離心10min，取上清，加入2μL 10mg/mL RNase溶液，37℃溫育1h；加入450μLTE；加500μL酚氯仿異戊醇，顛倒混勻，12 000g離心6min；取上清400μL，加等體積的氯仿異戊醇，12 000g離心6min；取上清350μL，加入30μL醋酸鈉和340μL預(yù)冷的異丙醇，再12 000g離心6min；70%乙醇洗兩次；自然干燥1h，用30μL TE回溶；-20℃保存。

（2）ITS間區(qū)PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物使用酵 母ITS1/4通 用引物。 引 物序列 為：ITS1：5-T C C G T A G G T G A A C C T G C G-3；I T S 4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。 擴(kuò) 增 條 件：采用25μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：95℃5min變性；94℃1min，58℃2min；72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

取2μL產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。通過(guò)對(duì)酵母菌ITS區(qū)間進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到不同大小的擴(kuò)增片段，與參考菌株對(duì)比以鑒定酵母菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離結(jié)果

從采集于塔城和豐地區(qū)的酸駝乳中共分離出3株酵母菌，編號(hào)為T-1、T-2、T-3。

2.2 酵母菌的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

3株酵母菌顯微鏡觀察結(jié)果見圖1、圖2、圖3。

圖1 T-1

圖2 T-2

圖3 T-3

由上圖可知，T-1、T-2酵母菌為橢圓和臘腸狀，T-3為卵圓形。

2.3 酵母菌菌落特征觀察結(jié)果

株酵母菌菌落特征。

表1 酵母菌菌落特征觀察結(jié)果

3株酵母菌的菌落均為乳白色，有凸起，邊緣整齊，T-3無(wú)透明度，T-2不光滑且形狀不規(guī)則。

2.4 酵母菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果

于接菌后第3d、第7d、第14d各觀察一次，分別記錄。綜合三次記錄結(jié)果，并主要以第14d記錄結(jié)果為準(zhǔn)，第3d、第7d的實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄可作為參考，結(jié)果見表2和表3。

表2 酵母菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果（一）

表3 酵母菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果（二）

根據(jù)表2和3，T-1和T-2的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)基本一致，均不利用硝酸鹽、半乳糖，無(wú)耐放線菌酮的能力，有膜醭，產(chǎn)假菌絲。T-3的生長(zhǎng)對(duì)維生素要求全面，能較好地利用和發(fā)酵半乳糖，有耐放線菌酮的能力，無(wú)膜醭，產(chǎn)子囊孢子，不產(chǎn)假菌絲。

2.5 酵母菌的檢索結(jié)果

根據(jù)生理生化的各項(xiàng)指標(biāo)，通過(guò)表5的檢索表來(lái)確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與食品有關(guān)的酵母菌檢索表；與軟飲料有關(guān)的普通酵母菌檢索表；與果酒和果酒制造有關(guān)的酵母菌檢索表；與釀造有關(guān)的酵母菌檢索表。

表4 標(biāo)準(zhǔn)菌株檢索結(jié)果

表5 待測(cè)菌株檢索結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)菌株檢索結(jié)果與原菌株歸屬一致，檢出率為100%。說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果可靠，并得出待測(cè)菌株的檢索結(jié)果：T-1菌株為膜醭畢赤氏酵母/東方伊薩酵母，T-2為膜醭畢赤氏酵母/東方伊薩酵母，T-3為單孢酵母。

2.6 ITS間區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 ITS間區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

如圖4所示，T-1，T-2的條帶大約為500bp，與A（東方伊薩酵母）在同一水平線上，可初步判斷T-1 和T-2為東方伊薩酵母。T-3與D（乳酸克魯維酵母）、E（馬克斯克魯維酵母）、F（單孢酵母）的片段大小相同，約為750bp，初步判斷T-3為乳酸克魯維酵母/馬克斯克魯維酵母/單孢酵母。

3 結(jié)論

從采自塔城和豐的酸駝乳中分離出3株酵母菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、傳統(tǒng)生理生化試驗(yàn)和對(duì)ITS間區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增相結(jié)合的方法成功將其鑒定到種。其中，T-1，T-2均為東方伊薩酵母，T-3為單孢酵母。通過(guò)本次試驗(yàn)，說(shuō)明通過(guò)對(duì)ITS間區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可初步對(duì)酵母菌進(jìn)行歸屬，再結(jié)合傳統(tǒng)生理生化試驗(yàn)可將酵母菌準(zhǔn)確鑒定到種。

[1] Elagamy E I.Effect of Heat Treatment on Camel Milk Proteins with Respect to Antimicrobial Factors: a Comparison with Cows and Buffalo Milk Protein[J]. Food Chemistry,2000(68):227-232.

[2] Saitmuratova O Kh, Sulaimanova G I, Sadykov A A.Camel’s Milk and Shubat from Aral Region[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2001(6):566-568.

[3] 古麗孜亞·卡克巴依,新華·拉比．新疆哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵駝乳抗炎作用的初步研究[J].中國(guó)乳品工業(yè),2007(9):8-10.

[4] Alhadrami G A.Camel[A]//Roginski H, Fuquay J W,Fox P F. Encyclopedia of Dairy Sciences[M].UK:Academic Press,2003:616-622.

[5] 周春艷,張秀玲,王冠蕾．酵母菌的5種鑒定方法[J].中國(guó)釀造,2006(8):51-54.

Separation and Identification of Traditional Fermented Camel milk Yeasts

LIU Yu-hua,MENG Jing-shan
(Karamay Green into Agricultural Development Co., Ltd. dairy,Xinjiang Karamay 834000)

An area isolated from Tacheng abundance of traditional fermented camel milk in three yeast, using morphological, physiological and biochemical tests and between ITS region PCR amplification method of combining the T-1 was identified as yeast Issatchenkia orientails (East Issa yeast), T-2 was identified as Issatchenkia orientails (East Issa yeast), T-3 was identified as Saccharomyces unisporus (single spore yeast). In order to understand the area of yeast acid camel milk,Yeast provide a basis for further development and preservation of natural species.

Sour camel milk; Yeast; Isolation; Identification

TS252.56

A

2096-0387（2015）01-0032-03

劉玉華（1984-），女，新疆，博士，工程師，研究方向：食品檢測(cè)。