福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　陳鯉敏　徐國(guó)焱　謝茂松　徐國(guó)興

VEGF基因多態(tài)性與2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性*

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院陳鯉敏徐國(guó)焱謝茂松徐國(guó)興

目的：探討血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）基因啟動(dòng)子rs699947（-2578C/A）多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）的相關(guān)性。方法：提取161例并發(fā)DR的2型糖尿病患者（病例組）和213例未并發(fā)DR的2型糖尿病患者（對(duì)照組）的 DNA，PCR反應(yīng)擴(kuò)增含rs699947（-2578C/A）位點(diǎn)的 DNA片段，限制性內(nèi)切酶Bgl II酶切，測(cè)定rs699947（-2578C/A）基因多態(tài)性。結(jié)果：糖尿病視網(wǎng)膜病變組VEGF rs699947（-2578C/A）基因 AA型基因頻率高于對(duì)照組，CC基因型明顯低于對(duì)照組。糖尿病視網(wǎng)膜病變危險(xiǎn)因素的多元逐步Logistic回歸分析顯示，血糖、高血壓、高血脂是糖尿病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，攜帶VEGFrs699947 AA基因型的2型糖尿病患者發(fā)生DR的危險(xiǎn)性明顯增高。結(jié)論：VEGF基因啟動(dòng)子-2578C/A多態(tài)性與DR病有關(guān)，攜帶AA基因型的2型糖尿病患者發(fā)生DR的危險(xiǎn)性較高。

糖尿病視網(wǎng)膜病變血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因多態(tài)性

糖尿病視網(wǎng)膜病變（Diabetic Retinopathy，DR）是糖尿病最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，發(fā)病率高，后果嚴(yán)重，加強(qiáng)對(duì)易感人群篩查和預(yù)防的研究具有十分重要的意義，對(duì)其病因和預(yù)防的研究是熱點(diǎn)。家族聚集性、同卵雙生子較高的一致性及某些種族中的高發(fā)率均強(qiáng)烈提示DR有遺傳易感性［1-2］，說(shuō)明除了糖尿病病程、血糖水平、高血壓等高危因素之外，遺傳因素在DR的發(fā)生發(fā)展中也起了重要作用。因此，DR是由不同致病機(jī)制造成且與遺傳和環(huán)境相關(guān)的多因子疾病。

VEGF是DR發(fā)生發(fā)展中刺激新生血管生長(zhǎng)和導(dǎo)致血管高滲透性的首要因素。臨床研究顯示，在PDR患者的玻璃體和房水中VEGF表達(dá)明顯增高。近年來(lái)，VEGF的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與DR的相關(guān)性關(guān)系研究倍受關(guān)注。為探討VEGF基因啟動(dòng)區(qū)-2578C/A單核苷酸多態(tài)性與DR發(fā)病的關(guān)系，我們于2009年10月～2014年10月進(jìn)行了如下研究。

1　資料

1.1臨床資料

選擇2009年10月～2014年10月收治的2型糖尿病患者374例為研究對(duì)象，其中男198例，女176例，年齡40～70歲，病程0～20年，均為漢族，相互間無(wú)血緣關(guān)系。根據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織制定的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)確診。根據(jù)是否發(fā)生DR分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，其中實(shí)驗(yàn)組161例，對(duì)照組213例。除外酮癥酸中毒、心力衰竭、高血壓危象、妊娠。

1.2糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)\斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)眼底照相及眼底血管熒光造影結(jié)果提示微血管瘤形成、滲出、出血等改變，并按照2002年悉尼國(guó)際眼科會(huì)議制定的DR分型新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷分期。根據(jù)檢查結(jié)果，凡符合上述條件之一者即入選為實(shí)驗(yàn)組。

2　方法

2.1標(biāo)本采集

所有被檢者均禁食12～14h，晨起空腹抽取靜脈血5 mL，在抗凝管中混勻，置于-80℃保存，其中2mL用作DNA提取，另3mL靜脈血分離血清行三酰甘油（triglyeeride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）和血糖測(cè)定，并且測(cè)量血壓。

2.2DNA的提取與擴(kuò)增

兩組均于入院次日清晨采集空腹靜脈血5mL，加EDTA抗凝，-80℃保存。用百泰克公司中量全血基因組DNA提取試劑盒提取全血DNA。

2.3VEGF C-2578-A多態(tài)性基因型測(cè)定

采用PCR法行DNA擴(kuò)增。VEGF基因上游引物序列5′-GCACCTCCACCAAACCACAGCAACAT-3′，下游引物序列為5′-CAAGCCCCCTTTTCCTCCAACTCTCC-3′（由TaKaRa公司合成）。PCR反應(yīng)體系中各組分的終濃度為DNA樣本0.5μg，10×PC Buffer2.5μL，Taq DNA聚合酶2.5U，dNTPs 0.2μmol/L，上下游引物各0.4μmol/L，滅菌純凈水補(bǔ)足體積至25μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變5min，95℃1min，66℃1min，72℃1min，循環(huán)35次，72℃延伸7min。于2%瓊脂糖凝膠電泳，恒定電壓90V，紫外透射反射儀下觀察結(jié)果。

2.4VEGF基因C-2578-A多態(tài)性檢測(cè)

取10μLPCR產(chǎn)物，加限制性內(nèi)切酶Bgl II（10U）1μL，10×Buffer2μL，雙蒸水（ddH2O）7μL，組成20μL的反應(yīng)體系。 置于37℃恒溫水浴箱中反應(yīng)6h。酶切反應(yīng)結(jié)束后，取10μL酶切產(chǎn)物與2μL上樣緩沖液混合均勻，置于瓊脂糖凝膠，在恒定電壓90V、紫外透射反射儀下觀察結(jié)果。計(jì)算VEGF基因-2578C/A等位基因頻率、等位基因頻率 VEGF基因-2578C/A多態(tài)性與DR關(guān)系。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Hardy-Weinberg平衡分析法檢驗(yàn)各組基因型頻率的群體代表性。采用SPSS11.0版軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的基因型和等位基因頻率分布進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，DR危險(xiǎn)因素分析使用多元逐步Logistic回歸。

3　結(jié)果

3.1研究對(duì)象的一般資料比較

各組年齡差異的比較采用t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，年齡構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組性別差異的比較采用χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)義（P＞0.05）。

3.2VEGF基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切結(jié)果

VEGF rs699947 PCR擴(kuò)增片段，經(jīng)Bgl II限制性內(nèi)切酶消化可產(chǎn)生3種基因型。

圖1　VEGF基因限制性內(nèi)切酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果（部分）

3.3DR危險(xiǎn)因素的多元逐步Logistic回歸分析

將所有研究對(duì)象作為整體進(jìn)行分析。以VEGF基因rs699947位點(diǎn)的等位基因、血脂（TG、TC）、血壓（收縮壓、舒張壓）和血糖各影響因素為自變量，以有無(wú)DR為因變量進(jìn)行多因素多元逐步Logistic回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血糖、高血壓、高血脂是糖尿病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，攜帶VEGF rs699947 AA基因型的2型糖尿病患者發(fā)生DR的危險(xiǎn)性明顯增高。

3.4DR組與對(duì)照組

VEGF基因rs699947位點(diǎn)基因型頻率及等位基因分布頻率的比較。DR組與對(duì)照組的VEGF基因均存在CC、CA、AA 3種基因型，其分布符合Hardy-Weinberg平衡法，說(shuō)明達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。如表1所示，VEGF基因rs699947位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率在研究組和對(duì)照組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DR組基因型與對(duì)照組相比，AA基因型明顯增高，CC基因型明顯降低（P=0.04，P＜0.05），其等位基因A頻率則明顯高于對(duì)照組。攜帶rs699947AA基因型的糖尿病患者發(fā)生DR的危險(xiǎn)性較rs699947CC基因型及CA基因型攜帶者高。

表1　DR組與對(duì)照組VEGF基因rs699947位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率的比較

4　討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)致病的復(fù)雜病理生理過(guò)程。遺傳背景、環(huán)境因素以及兩者的相互作用在其發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，高脂血癥、糖尿病和高血壓等都是促使DR發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。同時(shí)通過(guò)多元逐步Logistic回歸分析顯示，血糖、高血壓、高血脂是糖尿病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這符合DR的一般規(guī)律。VEGF基因存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變研究最多的通常位于啟動(dòng)子區(qū)、5’非翻譯區(qū)和3’非翻譯區(qū)。VEGF基因多態(tài)性位點(diǎn)rs699947位于VEGF基因的啟動(dòng)子區(qū)域。本研究發(fā)現(xiàn)，其中攜帶rs699947 AA基因型的糖尿病患者發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變的危險(xiǎn)性較高。VEGF基因rs699947位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率在DR組和對(duì)照組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

VEGF是DR發(fā)生發(fā)展中刺激新生血管生長(zhǎng)和導(dǎo)致血管高滲透性的首要因素。臨床研究顯示，在PDR患者的玻璃體和房水中VEGF表達(dá)明顯增高。近年來(lái)，VEGF的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)同DR的相關(guān)性關(guān)系研究倍受關(guān)注，迄今為止，這方面的研究在歐洲白種人群、亞洲日本人群和印度人群已有報(bào)道，但尚未有統(tǒng)一明確的結(jié)論。高加索人VEGF基因多態(tài)性與DR的嚴(yán)重程度有明確關(guān)系［3-5］，有研究認(rèn)為VEGF基因多態(tài)性可作為印度人群DR的主要遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素［6］。 Koji Nakanishi等發(fā)現(xiàn)，在日本人群的1型糖尿病患者中VEGF內(nèi)含子2的單核苷酸多態(tài)性可作為DR進(jìn)展的早期指標(biāo)［7］。而Kangas-Kontio等則認(rèn)為VEGF基因型多態(tài)性與DR無(wú)顯著性相關(guān)［8］。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)meta分析對(duì)VEGF-2578C/A基因多態(tài)性與DR的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性也存在著分歧［9-10］。以上分歧考慮與所取樣本人群種族、研究人群的入選標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。關(guān)于VEGF-2578C/A基因多態(tài)性與DR的關(guān)聯(lián)性以及影響DR發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，還有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并進(jìn)一步深入研究。

［1］Arar NH，F(xiàn)reedman BI，Adler SG，et al.Heritability of proliferative diabetic retinopathy：the FIND Eye study［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008（49）：3839-3845.

［2］Hietala K，F(xiàn)orsblom C，Summanen P，on behalf of the FinnDiane Study Group.Heritability of proliferative diabetic retinopathy［J］.Diabetes，2008（57）：2176-2180.

［3］Amanda J.Churchill，1 James G.Carter，et al.VEGF polymorphisms are associatedwithseverityofdiabeticretinopathy［J］.Investigative Ophthalmology&Visual Science，2008，4（8）：3611-3616.

［4］Sotoodeh Abhary，Kathryn P.Burdon，Aanchal Gupta，et al.Common sequence variation in the VEGFA gene predicts risk of diabetic retinopathy［J］. Investigative Ophthalmology&Visual Science，2009，50（12）：5552-8.

［5］Al-Kateb H，Mirea L，Xie XL，et al.Multiplevariants in vascular endothelial growth factor（VEGF）gene are risk factors for severe retinopathy in type I diabetes：the DCCT/EDIC genetics study［J］.Diabetes，2007（56）：2161-2168.

［6］Balasubbu S，Rajendran A，Ramasamy K，et al.Association of VEGF and Enos gene polymorphisms in type 2 diabetic retinopathy［J］.Molecular Vision，2006（12）：336-41.

［7］Koji Nakanishi，Chizuru Watanabe.Single nucleotide polymorphisms of vascular endothelial growth factor gene intron 2 are markers for early progression of diabetic retinopathy in Japanese with type 1 diabetes［J］. Clinica Chimica Acta，2009，402（1-2）：171-175.

［8］Kangas-Kontio T，Vavuli S，et al.Polymorphism of the manganese superoxide dismutase gene but not of vascular endothelial growth factor gene is a risk factor for diabetic retinopathy［J］.Br J Ophthalmol，2009，93（10）：1401-1406.

［9］Lu Y，Ge Y，Shi Y，et al.Two polymorphisms（rs699947，rs2010963）in the VEGFA gene and diabetic retinopathy：an updated meta-analysis［J］.BMC Ophthalmol，2013（13）：56.

［10］Han L，Zhang L，Xing W，et al.，The associations between VEGF gene polymorphisms and diabetic retinopathy susceptibility：a meta-analysis of 11 case-control studies［J］.J Diabetes Res，2014：805801.

福建省自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：2012J01344），通訊作者：徐國(guó)興。