常江，王穎，柳利，王滿倉Δ

IGF2BP3低甲基化與結(jié)腸癌組織分化的關(guān)系

常江1，王穎2，柳利1，王滿倉1Δ

目的 探討IGF2BP3低甲基化與結(jié)腸癌組織分化之間的關(guān)系。方法 收集2011年3月—8月在我院就診的結(jié)腸癌組織標(biāo)本41例，其中高分化腺癌19例，中分化腺癌12例，低分化腺癌10例，同時收集結(jié)腸炎標(biāo)本12例作為對照。免疫組化和Western blot檢測標(biāo)本IGF2BP3表達(dá)。改進ELISA法檢測標(biāo)本DNA總甲基化水平，甲基化特異性PCR（MS-PCR）檢測IGF2BP3甲基化水平。結(jié)果 免疫組化和Western blot結(jié)果示結(jié)腸癌組織IGF2BP3表達(dá)高于結(jié)腸炎組織（P＜0.05），低分化結(jié)腸癌組IGF2BP3表達(dá)水平最高，中、高分化程度間表達(dá)無明顯差異。結(jié)腸癌組基因總甲基化水平和IGF2BP3甲基化水低于結(jié)腸炎組（均P＜0.05），且隨著結(jié)腸組織分化程度降低，IGF2BP3甲基化水平依次降低（P＜0.05）。結(jié)論 IGF2BP3甲基化水平與結(jié)腸癌分化程度密切相關(guān)，在調(diào)控結(jié)腸癌組織IGF2BP3表達(dá)中具有重要價值。

胰島素樣生長因子2信使RNA結(jié)合蛋白3；結(jié)腸癌；DNA甲基化；分化；免疫組織化學(xué)；甲基化特異性PCR

胚胎發(fā)育過程中胰島素樣生長因子2信使RNA結(jié)合蛋白3（IGF2BP3）在RNA轉(zhuǎn)位、固定、細(xì)胞生長及細(xì)胞遷移中扮演重要角色［1］。研究發(fā)現(xiàn)IGF2BP3在胰腺癌、肺癌、食管癌、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤組織中表達(dá)［2］。有研究證實IGF2BP3與結(jié)腸癌等腫瘤的預(yù)后相關(guān)，但I(xiàn)GF2BP3在結(jié)腸癌分化中的作用及機制尚不清楚［3］。目前通過表觀遺傳學(xué)尤其是DNA甲基化探索結(jié)腸癌發(fā)病機制已成為研究熱點［4］。鑒于此，本研究擬通過觀察IGF2BP3甲基化在不同分化結(jié)腸組織中的表達(dá)，探討IGF2BP3甲基化與結(jié)腸癌分化程度的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2011年3月—8月內(nèi)蒙古巴彥淖爾市醫(yī)院普外一科手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織標(biāo)本41例，所有標(biāo)本均經(jīng)病理形態(tài)學(xué)檢查證實，臨床病理資料完整。年齡：≤60歲19例，＞60歲22例。性別：男25例，女16例。腫瘤最大徑：＞5 cm 13例，≤5 cm 28例。分化程度：低分化10例，中分化12例，高分化19例。腸壁浸潤程度：T1+T2 6例，T3+T4 35例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無轉(zhuǎn)移19例，有轉(zhuǎn)移22例。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移：無轉(zhuǎn)移32例，有轉(zhuǎn)移9例。TNM分期：Ⅰ期+Ⅱ期17例，Ⅲ期+Ⅳ期24例。收集同期12例結(jié)腸鏡活檢結(jié)腸炎標(biāo)本作為對照。

1.2 主要試劑 IGF2BP3鼠抗人單克隆抗體、羊抗鼠二抗及DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），DNA提取試劑盒與PCR試劑（Promega生物技術(shù)有限公司），基因組總甲基化檢測試劑盒（美國Epigentek公司），DNA甲基化修飾試劑盒（美國ZYMO公司），BCA蛋白定量試劑盒（凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.3 免疫組化 4%甲醛溶液固定標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋后，4 μm連續(xù)切片，然后進行HE染色和免疫組化染色。免疫組化采用SP法，使用枸櫞酸鈉緩沖液進行高壓修復(fù)5 min，3% H2O2通透10 min，10%山羊血清封閉30 min，滴加IGF2DP3一抗4℃過夜，二抗37℃孵育1 h，DAB顯色后蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，鏡下觀察并采集圖像。IGF2BP3的陽性表達(dá)指數(shù)用染色強度分?jǐn)?shù)×染色細(xì)胞比例分?jǐn)?shù)表示。染色強度按顏色評分:完全陰性0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分。陽性細(xì)胞染色百分比＜5%、5%～24%、25%～49%、50%～74%、≥75%分別計0、1、2、3、4分。同時采用Image-Pro Plus 5.0對IGF2BP3陽性細(xì)胞的平均光密度值進行定量分析。

1.4 Western Blot檢測IGF2BP3蛋白表達(dá) 取各組織標(biāo)本100 mg，加500 μL蛋白裂解液提取標(biāo)本總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每孔40 μg蛋白行SDS-PAGE，100 V濕轉(zhuǎn)1 h將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，以β-actin為內(nèi)參，PBS洗膜后加入一抗（1∶200）4℃過夜。次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG（1∶3 000），室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯影、曝光，UVI凝膠成像系統(tǒng)成像，Image-Pro Plus 5.0進行灰度值分析，計算蛋白相對表達(dá)量。

1.5 DNA總甲基化水平檢測 取20 mg組織標(biāo)本提取DNA，紫外分光光度計測定濃度后取200 ng DNA檢測總甲基化水平。操作步驟嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。實驗結(jié)束后酶標(biāo)儀檢測各標(biāo)本在450 nm處的光密度（OD）值，根據(jù)如下公式計算基因組甲基化水平，公式中X=41%是指人類基因組中GC的平均含量。Methylation%=［（SampleOD-NegativeControlOD）/X］/［（PositiveControlOD-NegativeControlOD）］×100%。

1.6 基因組DNA亞硫酸鹽修飾 取純化的標(biāo)本DNA 500 ng用于亞硫酸鹽修飾，嚴(yán)格按照操作說明書執(zhí)行。標(biāo)本經(jīng)過結(jié)合、脫硫、洗脫等步驟后可獲得10 μL亞硫酸氫鹽修飾后的基因組DNA，用于后續(xù)PCR反應(yīng)。經(jīng)修飾后的基因組DNA，非甲基化胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），在PCR反應(yīng)中擴增為胸腺嘧啶（T），而5甲基胞嘧啶（5-mC）不變。

1.7 IGF2BP3基因甲基化水平檢測 應(yīng)用甲基化特異性PCR（MS-PCR）進行檢測，Meth Primer軟件設(shè)計IGF2BP3引物序列并委托Invitrogen公司合成。IGF2BP3甲基化引物：上游5′-AAAGGGGATTTAGGTTACGGTCATA-3′，下游5′-CCATAAAAAAAAACAAAAACTAAACG-3′，產(chǎn)物長度165 bp；IGF2BP3非 甲 基 化 引 物 ：上 游 5′-ATATGG TTAGAAAGGGTTTAGGTGA-3′，下游 5′-CCATAAAAACAAAAACTAAAAAAACAC-3′，產(chǎn)物長度為164 bp。PCR反應(yīng)體系：GoTaq?GreenMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 4 μL，無核酸酶H2O 6.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，67℃10 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃10 min。凝膠成像系統(tǒng)測量目的片段灰度值，以甲基化條帶灰度值/非甲基化條帶灰度值計算樣本甲基化水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)變換后，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化 IGF2BP3定位于細(xì)胞漿，呈淡黃色、黃色或棕黃色，見圖1。與結(jié)腸炎（A）組相比，結(jié)腸癌組織中IGF2BP3表達(dá)升高（均P＜0.05），且低分化（D）組高于高分化腺癌（B）組和中分化（C）組（均P＜0.05），中分化組與高分化組表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。光密度值法分析結(jié)果與積分法結(jié)果一致，見表1。

Tab.1 The IGF2BP3 positive index and integrated optical density（IOD）in colon tissues with various differentiation表1 不同分化結(jié)腸組織IGF2BP3陽性表達(dá)指數(shù)與平均光密度值比較 （±s）

Tab.1 The IGF2BP3 positive index and integrated optical density（IOD）in colon tissues with various differentiation表1 不同分化結(jié)腸組織IGF2BP3陽性表達(dá)指數(shù)與平均光密度值比較 （±s）

＊＊P＜0.01，a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05，圖2～4同

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Fig.1 The expression of IGF2BP3 in colon tissues with various differentiations（×200）圖1 不同分化結(jié)腸組織IGF2BP3表達(dá)（×200）

2.2 IGF2BP3蛋白表達(dá)水平 與結(jié)腸炎組相比，結(jié)腸癌組織IGF2BP3蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。低分化結(jié)腸癌組IGF2BP3表達(dá)高于高分化和中分化組（P＜0.05），中、低分化組間表達(dá)無明顯差異，見圖2。

Fig.2 The expressions of IGF2BP3 protein in colon tissue with various differentiations圖2 不同分化結(jié)腸組織IGF2BP3蛋白表達(dá)水平

2.3 IGF2BP3基因甲基化水平 結(jié)腸炎組IGF2BP3甲基化水平高于其他3組（P＜0.05）。結(jié)腸癌組織IGF2BP3甲基化水平隨組織分化程度的降低依次降低（P＜0.05），見圖3。

Fig.3 IGF2BP3 methylation status of colon tissue with various differentiations圖3 不同分化結(jié)腸組織IGF2BP3甲基化水平

2.4 不同分化結(jié)腸組織基因組總甲基化水平 結(jié)腸炎組織基因總甲基化水平高于其他3組（P＜0.05），低分化腺癌低于高分化和中分化腺癌（P＜0.05），而高分化與中分化腺癌甲基化水平無明顯差異，見圖4。

Fig.4 The global methylation status of colon tissue with various differentiation圖4 不同分化結(jié)腸組織基因組總甲基化水平

3 討論

結(jié)腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位列所有腫瘤第3位，2013年，美國9%的腫瘤患者死于結(jié)腸癌［5］，我國目前無相關(guān)的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。因其死亡率較高，為更好判斷腫瘤的診斷和預(yù)后，特異性生物標(biāo)志物成為結(jié)腸癌研究的重要方向。目前ColoVantage和ColoSure等DNA甲基化標(biāo)志物已經(jīng)應(yīng)用于臨床實踐，指導(dǎo)結(jié)腸癌診斷和預(yù)后判斷［6］。腫瘤的發(fā)生過程伴隨原癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化。既往的結(jié)腸癌生物標(biāo)志物大多聚焦于抑癌基因甲基化研究，有關(guān)原癌基因甲基化修飾在結(jié)腸癌分化中的作用研究較少。IGF2BP3是RNA結(jié)合、癌胚蛋白保守家族成員，在細(xì)胞增殖、遷移、代謝及分化中具有重要作用。

目前諸多研究支持IGF2BP3作為一種原癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［7］。體外培養(yǎng)肺癌和乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)IGF2BP3可增加細(xì)胞侵襲性［8］。在小鼠黑色素瘤模型中，黑色素瘤細(xì)胞過表達(dá)IGF2BP3可促進腫瘤生長，血管生成及轉(zhuǎn)移［9］。臨床研究發(fā)現(xiàn)IGF2BP3是結(jié)腸癌病理分型和預(yù)后判斷的重要標(biāo)志物［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)在不同分化程度的結(jié)腸癌組織中均有IGF2BP3表達(dá)，且在低分化組織中，其表達(dá)量較高，與上述研究結(jié)果相一致?；蚪M總甲基化水平降低是細(xì)胞增殖水平升高的重要表現(xiàn)。本研究顯示結(jié)腸癌組織基因總甲基化水平低于結(jié)腸炎組織，且低分化組織總甲基化水平低于高分化和中分化組織。有研究采用LINE-1甲基化作為基因組總甲基化水平的指示因子，發(fā)現(xiàn)LINE-1低甲基化與結(jié)腸癌組織分化和預(yù)后相關(guān)，且LINE-1低甲基化與IGF2BP3高表達(dá)和結(jié)腸癌預(yù)后不良相關(guān)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎組織IGF2BP3甲基化水平高于其他結(jié)腸癌組織，且隨著分化程度減低，IGF2BP3甲基化水平逐漸減低，提示IGF2BP3低甲基化是IGFBP3表達(dá)升高的主要原因，與結(jié)腸組織分化密切相關(guān)。高分化和中分化結(jié)腸癌組織兩組之間無明顯差異，可能與樣本量相對較少和存在選擇偏倚有關(guān)。IGF2BP3低甲基化可能成為一種新的判斷結(jié)腸癌分化和預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物，在表觀遺傳學(xué)迅猛發(fā)展的大背景下，具有廣泛的應(yīng)用前景。一方面需進一步探索IGF2BP3低甲基化調(diào)控其表達(dá)的機制；另一方面，需要更多的臨床研究去求證IGF2BP3低甲基化用于結(jié)腸癌早期診斷、預(yù)后評估的科學(xué)性和可行性。

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（2014-10-16收稿 2015-01-07修回）

（本文編輯 胡小寧）

The relationship between IGF2BP3 hypomethylation with colon tumor differentiation

CHANG Jiang1，WANG Ying2，LIU Li1，WANG Mancang1Δ
1 Department of General Surgeon，2 Department of Nephrology，Inner Mongolia Bayannaoer City Hospital，Inner Mongolia 015000，China
ΔCorresponding Author E-mail:rh6917@aliyun.com

Objective To investigate the relationship between IGF2BP3 hypomethylation with colon tumor differentiation.Methods Tissue samples from 41 colorectal cancer were collected from March 2011 to August 2011 in our hospital，among which 19 cases were well-differentiated adenocarcinoma，12 cases were of moderately differentiated adenocarcinoma and 10 cases were of poorly differentiated adenocarcinoma.Meanwhile biopsy samples from 12 cases of colonic colitis were collected as a control.The expression of IGF2BP3 was assessed by immunohistochemistry and Western blot.An innovate of ELISA technique was used to examine global methylation levels while IGF2BP3 methylation level was tested by methylation specific PCR technique.Results The expressions of IGFBP3 are higher in all colon cancer groups than that in colitis（P＜0.05）.The expression of IGFBP3 in poorly differentiated adenocarcinoma is higher than that in all the other groups，but there is no significant difference between its expressions in the well differentiated group and in the moderately differentiated adenocarcinoma group.The global DNA level and IGFBP3 methylation level of every colon cancer group is lower than those in colitis（P＜0.05）.Also，a tendency of decreasing global DNA and IGFBP3 methylation status was observed comparing well differentiated towards poorly differentiated carcinomas（P＜0.05）.Conclusion IGF2BP3 expression in colorectal cancer is associated with differentiation of colon cancer tissue.A lower global and IGF2BP3 DNA methylation suggest a worse differentiation of colon cancer.DNA hypomethylation may therefore play a regulatory role in the expression of IGF2BP3 in colon cancer tissue.

IGF2BP3；colonic neoplasms；DNA methylation；differentiation；immunohistochemistry；methylation-specific PCR

R735.3

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.017

1內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市醫(yī)院普外科（郵編015000），2腎內(nèi)科

常江（1977），研究生，主治醫(yī)師，主要從事胃腸道腫瘤的防治研究

E-mail:rh6917@aliyun.com